Procedimentos Immunoblotting

Esta técnica analítica prossegue nos seguintes passos. As proteínas são geralmente separadas por tamanho através de eletroforese em gel de poliacrilamida de dodecil sulfato de sódio (SDS). Depois disso, elas são transferidas para uma membrana sintética através de métodos secos, semi-secos, ou blotting úmido. No campo elétrico gerado por uma fonte de energia, as proteínas revestidas com SDS com carga negativa migram em direção ao eletrodo positivo. Conforme as proteínas migram para fora do gel, elas são capturadas em uma membrana. A ligação das proteínas à membrana é um mecanismo irreversível. As membranas podem ser da nitrocelulose, difluoreto de polivinilideno (PVDF) ou da variedade de nylon. A membrana pode então ser bloqueada com albumina sérica ou solução de leite para evitar a ligação não específica de anticorpos. Segue-se a sondagem com anticorpos específicos da proteína em estudo na membrana, um método semelhante à imuno-histoquímica, mas sem necessidade de fixação. Esta técnica explora a especificidade inerente ao reconhecimento de antigénios-anticorpos. A detecção é tipicamente realizada usando cromogénio ou anticorpos secundários ligados a peróxido para catalisar uma reacção cromogénica ou quimioluminescente.