Abstract
Background and Objective. Wiarygodne nieinwazyjne narzędzie predykcyjne do badań przesiewowych, diagnostyki i/lub oceny zaawansowania raka jelita grubego (CRC) przed zabiegiem operacyjnym ma decydujące znaczenie dla wyboru leczenia i rokowania. Metody. Pacjenci przyjęci do wstępnego leczenia CRC między 1 stycznia 2015 r. a 31 grudnia 2018 r. zostali wyszukani i przejrzani. Zapisy CD16+CD56+ komórek naturalnego zabójcy (NK) analizowano w zależności od stadiów CRC. Wyniki. Liczba zakwalifikowanych uczestników w grupie zdrowych, w stadium I, w stadium II, w stadium III i w stadium IV chorych na CRC wynosiła odpowiednio 60, 66, 60, 70 i 68. Stwierdzono istotną różnicę w ilości krążących komórek NK CD16+CD56+ pomiędzy grupą zdrową a grupą z CRC (), jak również pomiędzy grupą zdrową a grupą z CRC w stadium III lub IV ( i 0,001, odpowiednio). Odsetek krążących komórek NK CD16+CD56+ w limfocytach był ujemnie skorelowany z występowaniem CRC. Porównując pulę przypadków CRC w stadium I i II z pulą przypadków CRC w stadium III i IV przy użyciu krążących komórek CD16+CD56+ NK, pole pod krzywą Receiver Operating Characteristic wynosiło 0,878. Przy optymalnej wartości odcięcia 15,6%, OR wynosił 0,06 (0,03, 0,11), czułość 86,5%, swoistość 72,5%, dodatnia wartość predykcyjna 74,2%, a ujemna wartość predykcyjna 85,5%. Wnioski. Krążące komórki NK CD16+CD56+ mogą być wykorzystywane jako narzędzie przesiewowe i diagnostyczne/stopniujące w CRC.
1. Wprowadzenie
Rak jelita grubego (CRC) występuje z częstością około miliona zachorowań rocznie i jest przyczyną śmierci prawie 700 000 osób każdego roku, co plasuje go na czwartym miejscu wśród najbardziej śmiertelnych nowotworów na świecie. Obecna strategia badań przesiewowych CRC boryka się z niską czułością i/lub specyficznością testów opartych na stolcu, żmudnymi etapami przygotowania jelita przed badaniami radiograficznymi oraz wysokim ryzykiem perforacji w badaniach endoskopowych. W rzeczywistości najlepszy test przesiewowy i kontrolny o wysokim stopniu zgodności dla CRC powinien być łatwo wykonywany i powtarzany, zwłaszcza biorąc pod uwagę do 25% przypadków nieresekcyjnych w momencie diagnozy i 50% wskaźnik nawrotów w przypadkach wczesnych stadiów po operacji .
Stopniowanie i rokowanie CRC opierają się głównie na patologii po zabiegach chirurgicznych . Praktycznym przykładem był konsensus immunoscore na wycinkach parafinowych dla klasyfikacji i rokowania CRC. Chociaż w kilku badaniach zastosowano uzupełniające i nieinwazyjne biomarkery w diagnostyce CRC, nadal brakuje wiarygodnego narzędzia predykcyjnego o wysokiej czułości i swoistości do diagnozowania i/lub oceny zaawansowania CRC przed zabiegiem chirurgicznym.
Układ odpornościowy jest znany jako zaangażowany w rozwój i progresję CRC. Wykazano, że infiltracja immunologiczna różnych komórek odpornościowych w CRC jest związana z przerzutami i rokowaniem. Ponadto, krążące komórki odpornościowe mogą odzwierciedlać lokalną odpowiedź immunologiczną w mikrośrodowisku guza, dostarczając w ten sposób potencjalnie ważnych informacji dotyczących progresji choroby w CRC. Komórki NK (Natural killer), jako ważny podzbiór komórek odpornościowych, których aktywność jest wyzwalana przez ewoluującą i delikatną równowagę między sygnałami aktywującymi i hamującymi odbieranymi przez receptory powierzchniowe komórek, są uważane za interesujące cele badań translacyjnych i klinicznych.
W obecnym badaniu przeanalizowaliśmy podwójnie pozytywne komórki NK CD16 i CD56 u zdrowych i w różnych stadiach zaawansowania pacjentów z CRC przed rozpoczęciem leczenia, próbując ustalić wartość komórek NK CD16+CD56+ w przewidywaniu i wstępnej ocenie zaawansowania CRC.
2. Metody
To było retrospektywne badanie kohortowe przeprowadzone w 2nd Affiliated Hospital of Harbin Medical University, trzeciorzędowym szpitalu w północno-wschodnich Chinach. Zatwierdzenie Institutional Ethics Committee uzyskano przed zebraniem danych, a świadomą zgodę uzyskano od pacjentów przy przyjęciu.
Clinical records of patients who were admitted for initial treatment of CRC between January 1, 2015, and December 31, 2018, to the Department of Oncology were retrieved and reviewed. Włączeni pacjenci powinni mieć dostępne dane dotyczące komórek NK przed leczeniem (ostatnie przed pierwszą operacją), a także potwierdzony histologicznie pierwotny CRC. Staging oparty był na terminologii TNM (Tumor Node Metastasis). Wykluczono chorych z niejasnym rozpoznaniem, powikłanych innymi nowotworami, przyjętych po wcześniejszym leczeniu z powodu CRC, z innymi chorobami przewlekłymi (takimi jak choroby układu krążenia i choroby endokrynologiczne) oraz z infekcjami wirusowymi lub bakteryjnymi. Zdrowi uczestnicy dobrani pod względem wieku i BMI (bez dolegliwości klinicznych, którzy właśnie ukończyli coroczny egzamin fizyczny w momencie zapisu) zostali włączeni do grupy kontrolnej.
Próbki świeżej obwodowej krwi żylnej pobrano od wszystkich uczestników przed leczeniem (dla grupy CRC) lub w dniu corocznego egzaminu (dla zdrowych kontroli) w probówce pokrytej heparyną i przechowywano w temperaturze 2-8°C. 100 μl świeżo pobranej krwi przeniesiono do probówki specyficznej dla danego przepływu. Do badania cytometrycznego dodano 20 μl odczynnika BD Multitest 6-color TBNK (Ref # 644611, BD, USA, w tym CD3 FITC, CD16 PE+CD56 PE, CD45 PerCP-Cy5.5, CD4 PE-Cy7, CD19 APC, i CD8 APC-Cy7) zgodnie z instrukcją producenta, w ramach panelu, z którego CD16+CD56+ specyficznie kwantyfikował komórki NK w obrębie populacji limfocytów. Mieszaninę inkubowano w temperaturze pokojowej przez 15 minut w ciemności, a następnie poddawano działaniu 2,5 ml buforu do lizy krwinek czerwonych (Sigma-Aldrich) przez 10 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Mieszaninę przemywano dwukrotnie buforem PBS, ponownie zawieszano i utrwalano w 0,5 ml PBS zawierającym 0,9% formaldehydu (Sigma-Aldrich) i analizowano za pomocą systemu cytometru przepływowego FACSCanto II (BD Biosciences) przy użyciu oprogramowania FACSDiva™ w wersji 8.0 (BD Biosciences). Analizie poddano co najmniej 20 000 komórek w bramce P1 z każdej próbki.
2.1. Analiza statystyczna
Dane dyskretne zostały wyrażone jako liczba przypadków (procenty) i przeanalizowane przy użyciu testu lub dokładnego testu Fishera, wraz z ilorazem szans (OR) i 95% przedziałem ufności (95% CI), w zależności od tego, co miało zastosowanie. Dane ciągłe zostały przedstawione jako współczynniki i były analizowane przy użyciu testu -test. Obszar pod krzywą ROC (Receiver Operating Characteristic) został wykorzystany do przedstawienia wartości predykcji. Do analizy statystycznej użyto programu SPSS 24.0 (IBM Corp., Armonk, NY). Wyniki
W założonym okresie badania do naszego szpitala przyjęto 2714 chorych na CRC. Zgodnie z założonymi kryteriami włączenia do badania włączono 66 chorych w I stopniu zaawansowania, 60 w II stopniu zaawansowania, 70 w III stopniu zaawansowania i 68 w IV stopniu zaawansowania. Grupę kontrolną stanowiło 60 osób zdrowych, dobranych pod względem wieku i BMI. Nie stwierdzono istotnych różnic w wieku, płci, masie ciała, wzroście i BMI pomiędzy zdrowymi osobami z grupy kontrolnej a chorymi na CRC ani pomiędzy poszczególnymi grupami (, Tabela 1).
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
# test wśród wszystkich grup. Test ANOVA między wszystkimi grupami. $ test między zdrową grupą kontrolną a innymi odpowiednimi grupami. -test między zdrową grupą kontrolną a innymi odpowiednimi grupami. Wartość $$ zdrowych vs. przypadków CRC, test lub -test.
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
3.1. The Predictive Value of Circulating CD16+CD56+ NK Cells in CRC
Występowała istotna różnica w ilości krążących komórek NK CD16+CD56+ pomiędzy grupą zdrową a przypadkami CRC (, Tabela 1). Odsetek krążących komórek CD16+CD56+ NK w limfocytach był ujemnie skorelowany z występowaniem CRC.
Krzywą ROC (Receiver Operating Characteristic) posłużono się w celu przedstawienia roli komórek CD16+CD56+ NK w przewidywaniu CRC. Porównując zdrowe kontrole z przypadkami CRC jako całością (Rycina 1), obszar pod krzywą (AUC) wynosił 0,725 (Tabela 2). Stosując optymalną wartość odcięcia 19,7%, OR wynosił 0,08 (0,04, 0,15), , czułość wynosiła 80,0%, swoistość 76,9%, pozytywna wartość predykcyjna (PPV) wynosiła 44,0%, a negatywna wartość predykcyjna (NPV) wynosiła 94.4%.
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
AUC: obszar pod krzywą. Liczba przypadków powyżej progu/całkowita liczba przypadków w odpowiednich grupach.
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
3.2. Circulating CD16+CD56+ NK Cells in Different Stages of CRC Cases
Nie było różnic w krążących komórkach CD16+CD56+ NK między grupą zdrową a grupą CRC w stadium I lub II (i , odpowiednio), ale istotne różnice istniały między grupą zdrową a grupą CRC w stadium III lub IV (, i , odpowiednio, Tabela 1). Ponieważ nie było różnic w liczbie komórek NK CD16+CD56+ między grupą zdrową a grupą CRC w stadium I lub II, porównując pulę zdrowych kontroli + przypadki CRC w stadium I+II z pulą przypadków CRC w stadium III+IV (ryc. 2), AUC wyniosło 0,892 (tab. 2). Przy zastosowaniu optymalnej wartości odcięcia 15,6%, OR wynosił 0,07 (0,04, 0,12), czułość 84,4%, swoistość 72,5%, PPV 80,5%, a NPV 77,5%.
Przy porównaniu puli przypadków CRC w stadium I i II z pulą przypadków CRC w stadium III i IV (Rycina 3), AUC wyniosła 0,878 (Tabela 2). Przy zastosowaniu optymalnej wartości odcięcia 15,6%, OR wynosił 0,06 (0,03, 0,11), czułość 86,5%, swoistość 72,5%, PPV 74,2%, a NPV 85,5%.
4. Dyskusja
Ogólnie rzecz biorąc, na podstawie ekspresji CD56, komórki NK można podzielić na CD56bright i CD56dim. Pierwsze z nich związane są z immunoregulacją i produkcją cytokin prozapalnych, natomiast drugie są komórkami cytotoksycznymi. CD16 (FcγRIII) na komórkach NK pośredniczy w cytotoksyczności zależnej od przeciwciał, a obecność CD16 wyklucza zatem udział niektórych komórek NK skorelowanych z komórkami T lub B .
Ostatnio dwa badania wykorzystały CD3-CD56+ jako markery dla komórek NK. W jednym z badań odnotowano obecność podzbiorów komórek NK u chorych na CRC, z wnioskiem, że „odsetek komórek podobnych do NKT CD16+ był niezależnie związany z krótszym przeżyciem wolnym od choroby u chorych na CRC”. Jednak autorzy badania włączyli do niego ograniczoną liczbę pacjentów, a stratyfikacja według różnych stadiów zaawansowania oraz podział populacji komórek NK CD56bright i CD56dim dodatkowo osłabiły moc danych. Co więcej, niektórzy z tych pacjentów otrzymali leczenie radiologiczne jeszcze przed pobraniem komórek NK, co może wprowadzić heterogeniczność (mieszaninę pacjentów leczonych początkowo i pacjentów po leczeniu) do zbiorczej populacji pacjentów. W innym badaniu odnotowano ujemną korelację między obwodowymi komórkami NK a stopniem zaawansowania TNM CRC, z istotną różnicą w liczbie komórek NK między zdrowymi a stopniem I i II oraz zdrowymi a stopniem IV, ale nie między zdrowymi a stopniem III . Ten niespójny trend może być spowodowany małą liczbą pacjentów w każdej grupie. In our study, we collected more patients, and only patients without previous treatment were enrolled for analysis, which might show the natural body condition under the burden of CRC. Thus, our data, as homogeneous as such, is applicable as a screening test before initial treatment.
Another power of our study resides in the exclusion of viral or bacterial infection cases. Istnieją receptory aktywujące i receptory hamujące na powierzchni komórek NK. Receptory aktywujące komórki NK, jak na przykład Ly49H, KIR2DL3, lub KIR3DS1, są niezbędne do oczyszczenia infekcji wirusem cytomegalii, wirusem zapalenia wątroby typu C lub wirusem Epsteina-Barr, odpowiednio. Z drugiej strony, receptory hamujące komórki NK, jak na przykład CD94-NKG2A , czy KIRs , są również zaangażowane w przypadku infekcji wirusowych. Równowaga między receptorami aktywującymi i hamującymi jest utrzymywana dzięki wiązaniu receptor-ligand. Bezpośrednie receptory Toll-podobne (TLRs) mogą być aktywowane przez lipopolisacharyd, składnik bakterii gram-ujemnych. Stwierdzono, że pobudzenie TLR na komórkach NK jest również zaangażowane w aktywację komórek NK. Dlatego wykluczenie przypadków zakażeń wirusowych lub bakteryjnych zmniejszy heterogenność tych przypadków w analizie przypadków CRC.
Były doniesienia o prognozowaniu CRC w oparciu o barwienie immunohistochemiczne w celu wykrycia mutacji lub polimorfizmu genów lub aktywacji, co jest możliwe tylko po zabiegach chirurgicznych. Jedna kategoria krążących biomarkerów dla CRC należy do zakresu regulacji genów (mikroRNA lub metylacja). Inną kategorię stanowi analiza metabolomiki surowicy. W tym sensie krążące komórki NK CD16+CD56+ odgrywają rolę predykcyjną zarówno w badaniach przesiewowych, jak i w ocenie zaawansowania przed zabiegami chirurgicznymi.
5. Wnioski
Podsumowując, stwierdziliśmy, że odsetek krążących komórek NK CD16+CD56+ był ujemnie skorelowany z występowaniem CRC i stagingiem CRC. Używając wartości odcięcia 19,7% i 15,6%, odsetek krążących komórek CD16+CD56+ NK był w stanie zróżnicować przypadki zdrowe i CRC lub przypadki w stadium I+II i III+IV, odpowiednio.
Dostępność danych
.