Typy hemocytów u świerszczy

Rycina 1A przedstawia obraz hemocytów świerszcza w mikroskopie z różnicowym kontrastem interferencyjnym (DIC), ukazujący komórki o różnych rozmiarach i kształtach. W celu dokładnej identyfikacji tych hemocytów, około 1000 komórek zostało sklasyfikowanych na podstawie ich wielkości i morfologii (dane nie pokazane) w sześć typów (Ryc. 1B~G). Jak pokazano na Rys. 1B, typowy granulocyt był obserwowany w hemolimfie. Granulocyty miały zwykle okrągły lub owalny kształt, a w cytoplazmie obserwowano wiele polimorficznych ziarnistości. Na błonie plazmatycznej granulocytów obserwowano małe pseudopodia lub filopodia (ryc. 1B, oznaczone białymi strzałkami). Komórka przedstawiona na rycinie 1C została uznana za plazmocyt ze względu na jej typowy wrzecionowaty kształt i długie, włosowate struktury obserwowane na obu końcach błony plazmatycznej (wskazane białymi strzałkami). Rysunek 1D przedstawia prohemocyty, które są najmniejszymi okrągłymi komórkami obserwowanymi w hemolimfie owadów. J±dra były duże w stosunku do rozmiaru komórki i znajdowały się w jej ¶rodku (ryc. 1D). Tak więc cytoplazma i jądro prohemocytów były często nie do odróżnienia. Na rycinie 1E przedstawiono koagulocyt zawierający różne ziarnistości cytoplazmatyczne. Błony plazmatyczne koagulocytów były gładkie, bez żadnych struktur, a ich jądra były duże i łatwe do zaobserwowania. Największym obserwowanym typem hemocytu były enocytoidy, których w hemolimfie było niewiele (ryc. 1F). Oenocytoidy miały zwykle okrągły kształt smażonego jaja z licznymi ziarnistościami cytoplazmatycznymi. Rycina 1G przedstawia sferulocyty, które były okrągłe i średniej wielkości z wieloma małymi ciemnymi lub błyszczącymi ziarnistościami w cytoplazmie. Jak pokazano na ryc. 1D~G, na błonach plazmatycznych prohemocytów, koagulocytów, oenocytoidów i sferulocytów nie były widoczne żadne struktury, które optycznie były bardzo gładkie.

Sześć typów hemocytów obserwowanych we krwi świerszczy. Ogólny kształt i względna wielkość hemocytów w hemolimfie (A). Sześć typów hemocytów występujących u G. bimaculatus zostało sklasyfikowanych jako granulocyty (B ; GR), plazmocyty (C ; PL), prohemocyty (D ; PR), koagulocyty (E ; CO), enocytoidy (F ; OE) i sferulocyty (G ; AD) na podstawie wielkości i morfologii. Białymi strzałkami oznaczono wachlarzowate lub amebowate struktury na błonie plazmatycznej granulocytów i plazmocytów (B i C). Pasek skali = 25 µm (A) lub 10 µm (B~G).

Nodulacja i enkapsulacja przez hemocyty

W owadach, komórkowe odpowiedzi immunologiczne, takie jak nodulacja, enkapsulacja i fagocytoza są wykonywane przez hemocyty odpornościowe, takie jak granulocyty i plazmatycyty. Po ekspozycji na patogen, hemocyty te zmieniają swój kształt i rozwijają w swoich błonach plazmatycznych duże struktury przypominające ameby lub wachlarze. Aby obserwować te szybkie zmiany morfologiczne w czasie rzeczywistym, opracowaliśmy technikę, która pozwala nam hodować hemocyty owadów przez 7 dni, zachowując aktywność fizjologiczną (opisane w Materiałach i Metodach). Chociaż nie udało nam się stworzyć stabilnych linii hemocytów, które mogą być hodowane przez kilka lat, byliśmy w stanie obserwować morfologię hemocytów w odpowiedzi na patogeny in vitro. Uzupełniający film C pokazuje tylko hemocyty po 12 h inkubacji. Większość hodowanych komórek aktywnie się poruszała. Niektóre komórki wykazywały siatki wokół błony komórkowej podczas hodowli i były przytwierdzone do szkiełek hodowlanych. Hemocyty rzadko agregowały lub tworzyły duże skupiska.

Rysunek 2A przedstawia hemocyty hodowane z E. coli (patrz również Supplementary Movie 1). Zaobserwowano, że niektóre hemocyty były bardziej zagregowane i poruszały się. W miarę wydłużania się czasu inkubacji, sieci (włoski podobne do ameby lub pułapki zewnątrzkomórkowe) były wytwarzane przez określone hemocyty, a różne hemocyty gromadziły się w tych sieciach tworząc duże skupiska (Rys. 2A-1~A-6; włoski podobne do ameby lub pułapki zewnątrzkomórkowe zaznaczone czarnymi strzałkami). Jak pokazano na ryc. 2A-1, trzy grupy hemocytów (wskazane przez czarne kółka) zostały ostatecznie wciągnięte w jedno skupisko przez sieci (ryc. 2A-5 i A-6).

Obrazy żywych komórek hemocytów świerszczy zakażonych E. coli lub kulkami Sephadex. (A) Obrazy z mikroskopu świetlnego przedstawiające hemocyty hodowane z E. coli. W miarę wydłużania się czasu inkubacji, sieci (włoski podobne do ameby lub pułapki pozakomórkowe; wskazane czarnymi strzałkami) były wytwarzane przez określone hemocyty. Wszystkie sześć typów hemocytów było agregowanych w duże skupiska przez te sieci (A-1~A-6; wskazane przez czarne ramki). Film dostępny jako Film 1 (czas w minutach po inokulacji). (B) Obrazy z mikroskopu świetlnego pokazujące hemocyty hodowane z kulkami Sephadex. Kulki Sephadex wokół hemocytów zostały losowo oznaczone jako SP1, SP2, SP3, SP4 i SP5. Z czasem kulki Sephadexu (SP1, SP2, SP3 i SP4) zostały otoczone przez hemocyty i zamknięte przez różne rodzaje sieci (B-1~B-9; wskazane przez czarne strzałki). Film dostępny jako Film 2 (czas w minutach po inokulacji). Pasek skali = 25 µm (A i B). Film C pokazuje hemocyty hodowane samodzielnie, bez kulek Sephadex. Większość hemocytów poruszała się aktywnie. Kilka komórek było przyczepionych do szkiełek hodowlanych przez sieci błon plazmatycznych. Jednak duże skupiska hemocytów nie były obserwowane.

Nie można było jednak ustalić, czy gromadzenie się hemocytów opisane powyżej zostało wywołane przez E. coli. Aby odpowiedzieć na to pytanie, hemocyty aktywowano kulkami Sephadex (o średnicy 120 μm), które można łatwo obserwować za pomocą mikroskopu DIC (Fig. 2B, Supplementary Movie 2). Jak pokazano na rycinie 2A, kulki Sephadex były wychwytywane przez sieci generowane przez określone hemocyty (ryc. 2B; sieci zaznaczone czarnymi strzałkami w żółtych polach). Kulki Sephadexu wokół hemocytów były losowo oznaczane jako SP1, SP2, SP3, SP4 i SP5. Jak można zauważyć porównując Rys. 2B-2 i B-3, SP1, SP2 i SP3 zostały wciągnięte razem i do obszaru wskazanego przez żółtą ramkę. Ponadto, SP1 został ostatecznie całkowicie otoczony przez różne hemocyty (ryc. 2B-9). Kulka oznaczona jako SP4 również została włączona do skupiska z SP1, SP2 i SP3 (ryc. 2B-4~B-9; wskazana przez żółtą ramkę). Z czasem wszystkie kulki Sephadexu (SP1, SP2, SP3 i SP4) stały się otoczone przez wiele hemocytów. Natomiast pojedyncze hemocyty obserwowano w kontakcie z SP5, ale nie został on wciągnięty do obszaru wskazanego przez żółtą ramkę, mimo że znajdował się w podobnej pozycji jak SP1. Zatem nodulacja przez hemocyty wydawała się zachodzić losowo.

Aktywacja granulocytów przez modyfikowane karboksylanem kulki lateksu polistyrenowego

Następnie zbadaliśmy, które hemocyty produkowały sieci i uczestniczyły w różnych etapach odpowiedzi immunologicznej, w tym enkapsulacji i nodulacji. W tym celu w miejsce patogenów zastosowano modyfikowane karboksylanami kulki lateksowe z polistyrenu, które można łatwo obserwować za pomocą mikroskopu DIC, i zbierano obrazy hemocytów w czasie rzeczywistym. Rysunek 3A przedstawia hemocyty stymulowane przez 12 h kulkami lateksu polistyrenowego modyfikowanymi karboksylanami (Supplementary Movie 3). Sieci wytwarzane przez hemocyty (wskazane przez czarne strzałki) aktywnie poruszały się wokół kulek lateksowych (wskazanych przez czerwone strzałki) (Figura 3A-1). Z czasem kulki były pochłaniane przez sieci i w końcu mogły być widoczne w cytoplazmie hemocytów (Rys. 3A-2~A-4). Jednakże, nie każda zmodyfikowana karboksylanem polistyrenu kulka lateksowa, która napotkała sieć, była fagocytowana. Tak więc, ruch aktywowanych hemocytów nie wydawał się dokładnie odpowiadać ruchowi kulek.

Obrazy żywych komórek granulocytów stymulowanych kulkami lateksu polistyrenowego modyfikowanymi karboksylanem. (A) Obrazy w mikroskopie świetlnym przedstawiające hemocyty hodowane z modyfikowanymi karboksylanami polistyrenowymi kulkami lateksowymi przez 12 h. A-1~A-4, hodowane hemocyty po 12~18 min. Siatki produkowane przez hemocyty (czarne strzałki) mogą być widoczne jako tworzące się wokół kulek lateksowych (wskazane przez czerwone strzałki). Kulki lateksowe zostały pochłonięte przez sieci i ostatecznie zostały wychwycone w cytoplazmie hemocytów (A-4). Film dostępny jako Film 3 (czas w minutach po stymulacji). Pasek skali = 40 µm. (B) Powiększone obrazy. (B-1) Po 4 h, wiele modyfikowanych karboksylanami polistyrenowych kulek lateksowych zostało wychwyconych przez hemocyty (kulki lateksowe, czerwone strzałki; i specyficzne hemocyty, białe kółka). (B-2~B-6) Hodowane granulocyty w 0, 2, 4, 12, i 48 h po stymulacji. (B-2) Granulocyty w stanie spoczynku, które są okrągłe lub owalne. (B-3) W 2 h po stymulacji, granulocyty zaczęły wykazywać zmiany morfologiczne i widoczne są wachlarzowate lub podobne do ameby struktury błony plazmatycznej (białe strzałki). (B-4 i -5) Duża liczba kulek lateksowych nagromadziła się w cytoplazmie granulocytów w 4 i 12 godzinie po infekcji. (B-6) Do 48 h po infekcji, wiele kulek lateksowych zgromadziło się w cytoplazmie granulocytów, ale sieci nie były już obserwowane, a wiele granulocytów wydawało się być obojętnymi. Pasek skali = 15 µm (B-1) lub 10 µm (B-2~B-6).

Szczegółowe obserwacje przeprowadzono przy użyciu mikroskopu konfokalnego o dużym powiększeniu (ryc. 3B). W 4 h po infekcji, modyfikowane karboksylanami polistyrenowe kulki lateksowe można było zaobserwować wewnątrz niektórych hemocytów (Fig. 3B-1; kulki oznaczone czerwonymi strzałkami, a specyficzne hemocyty białymi kółkami). Następnie obserwowaliśmy, które specyficzne komórki pochłaniały kulki lateksowe bardziej szczegółowo (Figura 3B-2~B-6). Rysunek 3B-2 pokazuje spoczynkowe granulocyty, które były zwykle okrągłe lub owalne w kształcie, z wieloma polimorficznymi ciemnymi granulkami w cytoplazmie. W 2 h po stymulacji modyfikowanymi karboksylanami kulkami lateksu polistyrenowego granulocyty zaczęły wykazywać zmiany morfologiczne, w tym wachlarzowate lub amebowate wypukłości błony plazmatycznej (Fig. 3B-3; wskazane białymi strzałkami). Modyfikowane karboksylanami polistyrenowe kulki lateksowe obserwowano w cytoplazmie granulocytów w 4 h po stymulacji, a duża liczba kulek lateksowych zgromadziła się w cytoplazmie wielu granulocytów do 12 h po stymulacji (Fig. 3B-4 i B-5; kulki oznaczone czerwonymi strzałkami, a sieci oznaczone białymi strzałkami). Ponadto obserwowano, że sieci te z czasem stawały się coraz większe i szersze (ryc. 3B-4 i B-5). W 48 h po stymulacji wiele kulek lateksowych zgromadziło się w cytoplazmie granulocytów, ale sieci nie można już było zobaczyć, a wiele granulocytów wydawało się być obojętnych (Figura 3B-6; kulki wskazane przez czerwone strzałki).

Jak pokazano na Figurze 2, granulocyty wydawały się dołączać nie tylko do innych granulocytów, ale także do różnych typów hemocytów za pomocą tych sieci. Nie zaobserwowaliśmy fagocytozy w żadnym innym typie komórek, z wyjątkiem niewielkiej liczby plazmocytów (dane nie pokazane). Ponadto nie zaobserwowaliśmy żadnej aktywności immunologicznej ani zmian morfologicznych w żadnym typie komórek innych niż granulocyty i niewielka liczba plazmocytów.

Lizosomy granulocytów zostały aktywowane przez wstrzyknięcie cząstek E. coli

Aby zbadać, czy wakuole obserwowane w granulocytach były fagosomami związanymi z patogenami, świerszczom wstrzykiwano cząstki E. coli, które są głównie używane jako markery fagocytozy i fluoryzują na zielono, gdy docierają do zakwaszonych organelli, takich jak wewnątrzkomórkowe lizosomy. W tym samym czasie hemocyty wybarwiono czerwienią LysoTracker Red, która znakuje lizosomy. Jak pokazano na Rys. 4A-1, zielony sygnał fluorescencyjny (fagocytowane cząstki E. coli) był obserwowany w cytoplazmie granulocytów bezpośrednio po wstrzyknięciu cząstek. W tym samym czasie obserwowano również sygnał czerwonej fluorescencji, który wskazuje na aktywowane tworzenie lizosomów (ryc. 4A-2). W 4 h po iniekcji w wielu granulocytach można było zaobserwować wysoce polimorficzne wakuole (ryc. 4A-4 i A-5). Pokazano połączone obrazy zielonego sygnału fluorescencyjnego (fagocytowane cząstki E. coli) i czerwonego sygnału fluorescencyjnego (aktywowane lizosomy) (Fig. 4A-6). W 12 h po iniekcji, sygnał zielonej fluorescencji zaczął przygasać, podczas gdy sygnał czerwonej fluorescencji pozostał (Fig. 4A-7~A-9). W 24 h po iniekcji, oba sygnały fluorescencyjne przygasły (Rys. 4A-10~A-12). Jednak czerwony sygnał fluorescencyjny w granulocytach był ponownie obserwowany w 48 h po wstrzyknięciu (Fig. 4A-13~A-15). Figura 4Aa~Ao pokazuje wstawki w panelach A-1~A-15 (oznaczone białymi polami) w większym powiększeniu. Świerszcze, którym wstrzyknięto tylko bufor PBS, były negatywne dla czerwonej i zielonej fluorescencji we wszystkich punktach czasowych po wstrzyknięciu (Figura 4B).

Czerwone znakowanie lizosomów granulocytów u świerszczy wstrzykniętych z zielonymi fluorescencyjnymi cząstkami E. coli. (A) Rozwój lizosomów granulocytów w 0 h, 4 h, 12 h, 24 h i 48 h po wstrzyknięciu cząstek E. coli. (A-1, A-4, A-7, A-10, i A-13) Cząsteczki E. coli, które są używane jako markery fagocytozy, fluoryzują na zielono, gdy docierają do zakwaszonych organelli, takich jak lizosomy wewnątrzkomórkowe. (A-2, A-5, A-8, A-11, i A-14) Konfokalne obrazy mikroskopu fluorescencyjnego granulocytów barwionych LysoTracker Red (marker lizosomalny). (A-1 i A-2) Zielone i czerwone sygnały fluorescencyjne można było zaobserwować w cytoplazmie granulocytów począwszy od 1 h po iniekcji. (A-4 i A-5) Wiele granulocytów wykazywało zieloną i czerwoną fluorescencję w wysoce polimorficznych wakuolach granulocytów w 4 h po iniekcji. (A-7 i -8) W 12 h po wstrzyknięciu zielony sygnał fluorescencyjny przygasł, ale czerwony sygnał fluorescencyjny pozostał. (A-10 i A-11) W 24 h po iniekcji, sygnał zielonej i czerwonej fluorescencji prawie zanikł. (A-13 i A-14) W 48 h po wstrzyknięciu, sygnał zielonej fluorescencji całkowicie zanikł, ale ponownie zaobserwowano sygnał czerwonej fluorescencji. Pokazano połączone obrazy sygnałów zielonej i czerwonej fluorescencji (A-3, A-6, A-9, A-12 i A-15). (a~o) Wstawki w panelach A-1 ~A-15 (oznaczone białymi polami) w większym powiększeniu. (B) Czerwony sygnał fluorescencyjny w granulocytach świerszczy, którym wstrzyknięto PBS (kontrola ujemna). (C) Analiza cytometryczna przepływu przy 1 h~48 h po iniekcji. (C-1 i C-2) Sygnał zielonej fluorescencji wynosił 2,08% w 1 h po iniekcji i wzrósł do 24,6% w 4 h po iniekcji. (C-3~C-5) Sygnał zielonej fluorescencji stopniowo spadał, do 10,87% w 12 h, 3,98% w 24 h i 1,74% w 48 h. (C-1-1~C-4-1) Sygnał czerwonej fluorescencji wzrósł do 69,54% w 12 h po iniekcji i spadł do 5,78% w 24 h po iniekcji. (C-5-1) Sygnał czerwonej fluorescencji wzrósł ponownie, do 30,25%, w 48 h po iniekcji. (C-1-2~C-5-2) Czerwony sygnał fluorescencyjny w granulocytach świerszczy, którym wstrzyknięto tylko bufor PBS. (D) Analizy cytometrii przepływowej powtórzono trzykrotnie.

Aby ocenić ilościowo sygnały zielonej i czerwonej fluorescencji u świerszczy zakażonych PBS- lub E. coli, hemocyty analizowano za pomocą cytometrii przepływowej w 0~48 h po iniekcji (ryc. 4C). W 0 h po iniekcji, 2,08% hemocytów było pozytywnych dla zielonej fluorescencji, i to wzrosło do 24,36% w 4 h po iniekcji (Rys. 4C-1 i C-2). Sygnał zielonej fluorescencji stopniowo zmniejszał się do 10,87% hemocytów w 12 godzinie, 3,98% w 24 godzinie i 1,74% w 48 godzinie (Rys. 4C-3~C-5). Wyniki te wskazują, że cząsteczki E. coli były aktywnie pochłaniane i trawione przez granulocyty i zostały całkowicie oczyszczone do 48 h po wstrzyknięciu. W 12 h po iniekcji 69,54% było pozytywnych dla czerwonej fluorescencji, a sygnał zmniejszył się do 5,78% hemocytów w 24 h po iniekcji (ryc. 4C-1-1~C-4-1). Zgodnie z naszymi obserwacjami mikroskopowymi, sygnał czerwonej fluorescencji wzrósł do 30,25% hemocytów w 48 h po iniekcji. Dla kontrastu, świerszcze, którym wstrzyknięto PBS były negatywne dla zielonej i czerwonej fluorescencji we wszystkich punktach czasowych (Rys. 4C-1-2~C-5-2). Analizę cytometrii przepływowej powtórzono trzykrotnie (Fig. 4D).

Reaktywacja lizosomów granulocytów w 48 h po infekcji

Reaktywacja lizosomów granulocytów w 48 h po infekcji była dalej badana przez obserwację mikroskopową (Fig. 5A i B). Jak pokazano na ryc. 4A, zielony sygnał fluorescencyjny (fagocytowane cząstki E. coli) i czerwony sygnał fluorescencyjny (aktywowane lizosomy) były widoczne w 4 h po iniekcji (ryc. 5A-1~A-3). Sygnały fluorescencyjne przygasły do 24 h po infekcji (ryc. 5A-4~A-6). W 24 h po infekcji zaobserwowaliśmy, że komórki mogą być widoczne w cytoplazmie granulocytów (Fig. 5A-4~A-6; wskazane białymi strzałkami). Zjawisko to było bardziej widoczne w 48 h po infekcji (ryc. 5A-7~A-9; oznaczone białymi strzałkami). Ponadto, lizosomy wokół tych pochłoniętych komórek w 48 h po zakażeniu były aktywowane (Rys. 5A-8). Jak pokazano na ryc. 4A-14, 4C-5-1, te obserwacje mikroskopowe wydają się wyjaśniać wzrost czerwonego sygnału fluorescencyjnego w 48 h po infekcji. Aby to potwierdzić, jądra granulocytów barwiono 4′,6-diamidino-2-fenyloindolem (DAPI) w 48 h po zakażeniu. Jak pokazano na Fig. 5B-1, granulocyty z dwoma jądrami były często obserwowane. Sporadycznie obserwowano również granulocyty zawierające więcej niż dwa jądra lub zdeformowane jądra (Fig. 5B-2 i B-3; wskazane przez białe strzałki).

Reaktywacja lizosomów granulocytów w 48 h po wstrzyknięciu. (A) Fluorescencyjne obrazy mikroskopowe granulocytów w 4 h, 24 h i 48 h po iniekcji. (A-1 i A-2) Granulocyty wykazywały zielone i czerwone sygnały fluorescencyjne w wysoce polimorficznych wakuolach w 4 h po wstrzyknięciu. (A-4 i A-5) W 12 h po wstrzyknięciu, zielony sygnał fluorescencyjny przygasł, ale czerwony sygnał fluorescencyjny pozostał. Ponadto, w cytoplazmie granulocytów zaobserwowano kilka komórek (białe strzałki). (A-7 i A-8) Zjawisko to było częściej obserwowane w 48 h po iniekcji. Ponadto lizosomy otaczające te pochłonięte komórki były aktywowane (A-8). Pokazano połączone obrazy zielonego i czerwonego sygnału fluorescencyjnego (A-3, A-6, i A-9). (B) Granulocyty barwione DAPI w 48 h po iniekcji. (B-1) W cytoplazmie granulocytów zaobserwowano dwa jądra. (B-2 i B-3) Sporadycznie obserwowano dwa lub więcej jąder lub zdeformowane jądra w cytoplazmie granulocytów (wskazane przez białe strzałki). Pasek skali = 10 µm (A) lub 20 µm (B).

Śmierć komórek granulocytów związana z martwicą w 48 h po zakażeniu

Jak pokazano na ryc. 3B-6 i 5A-8, nagromadzenie fagosomów w granulocytach zmieniało ich kształt i indukowało śmierć komórek. W 48 h po zakażeniu hemocyty barwiono izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC) sprzężonym z aneksyną V i jodkiem propidium (PI), aby potwierdzić apoptotyczną lub nekrotyczną śmierć komórek (Fig. 6A). Sygnał zielonej fluorescencji (aneksyna V) tylko nieznacznie wzrósł między 12 a 48 godziną (Rys. A-10, A-7 i A-10), ale sygnał czerwonej fluorescencji (PI) wykazywał silne zabarwienie w 12 godzinie po infekcji (Rys. 6A-5). W 24 i 48 h po infekcji sygnał czerwonej fluorescencji utrzymywał się (ryc. 6A-8 i A-11). Pokazano połączone obrazy sygnału czerwonej fluorescencji (PI) i obrazy DIC (Rys. 6A-3, A-6, A-9, i A-12). Figura 6Aa~Ad pokazuje wstawki w panelach A-3, A-6, A-9, i A-12 wskazane przez ramki w większym powiększeniu. Wyniki te wskazują, że akumulacja fagosomów w granulocytach nie indukowała typowej apoptotycznej śmierci komórkowej, ale śmierć komórkową związaną z nekrozą. W celu ilościowego określenia zabarwienia PI, hemocyty były barwione i badane metodą cytometrii przepływowej w 0 h, 12 h, 24 h i 48 h po infekcji. W 12 h po infekcji 71,29% granulocytów było zabarwionych PI, w porównaniu z 13,52% w 0 h (Fig. 6B-1 i B-2). W 24 h po zakażeniu wybarwienie PI nieznacznie się zmniejszyło, do 45,97%, ale ponownie wzrosło do 76,24% w 48 h (ryc. 6B-3 i B-4). Analizę cytometrii przepływowej powtórzono trzykrotnie (ryc. 6C).