Informacje podstawowe
Transfekcja DNA przez elektroporację jest uznaną techniką, która ma zastosowanie do prawdopodobnie wszystkich typów komórek. Daje ona wysoką częstotliwość stabilnych transformantów i ma wysoką wydajność przejściowej ekspresji genów. Obecnie wykazano, że elektroporacja jest skuteczna w dostarczaniu plazmidowego DNA in vivo do różnych typów tkanek. Elektroporacja wykorzystuje fakt, że błona komórkowa działa jak kondensator elektryczny, który nie jest w stanie przepuścić prądu (z wyjątkiem kanałów jonowych). Poddanie membran działaniu pola elektrycznego o wysokim napięciu powoduje ich tymczasowe rozbicie i powstanie porów, które są wystarczająco duże, aby umożliwić makrocząsteczkom (jak również mniejszym cząsteczkom, takim jak ATP) wejście lub wyjście z komórki. Ponowne zamknięcie porów membrany jest naturalnym procesem rozpadu, który jest opóźniony w temperaturze 0°C.
W czasie, gdy pory są otwarte, kwas nukleinowy może dostać się do komórki i ostatecznie do jądra. Liniowe DNA z wolnymi końcami jest bardziej rekombinogenne i bardziej prawdopodobne, że zostanie zintegrowane z chromosomem gospodarza w celu uzyskania stabilnych transformantów. Zwinięty DNA jest łatwiej pakowany do chromatyny i jest ogólnie bardziej skuteczny dla przejściowej ekspresji genów.
Użycie wstrząsów elektrycznych o wysokim napięciu do wprowadzenia DNA do komórek zostało po raz pierwszy wykonane przez Wonga i Neumanna przy użyciu fibroblastów (Wong i Neumann, 1982; Neumann et al., 1982). Technika ta została następnie uogólniona (Potter i in., 1984) na wszystkie typy komórek – nawet takie jak limfocyty, które w przeciwieństwie do fibroblastów nie mogą być transfekowane przy użyciu innych procedur (np, fosforan wapnia lub DEAE-dextran koprecypitaty DNA).
Oliver Smithies i współpracownicy użyli następnie elektroporacji do wprowadzenia DNA do embrionalnych komórek macierzystych (ES) i zaprojektowali wektory celujące, które pozwoliły wprowadzonemu DNA rekombinować z homologicznymi regionami w genomie i albo wprowadzić zmieniony gen albo sekwencję zakłócającą, aby wygenerować komórki ES z określonym genem „wbijanym” lub „wywalanym”. Zmienione komórki ES były następnie używane do generowania odpowiednich myszy knockin lub knockout. Elektroporacja była niezbędna dla tych zastosowań transferu genów, ponieważ wprowadza ona DNA do komórek w postaci nagiej, która może łatwo uczestniczyć w rekombinacji homologicznej. To rozszerzenie zastosowania elektroporacji sprawiło, że dr Smithies otrzymał w 2007 roku Nagrodę Nobla w dziedzinie medycyny lub fizjologii. Metodologia elektroporacji komórek ES jest zasadniczo taka sama jak w przypadku innych komórek ssaków. Jeśli pożądana jest homologiczna wymiana genów, wówczas należy zaprojektować wektory, które umożliwiają przesiewanie „pozytywno-negatywne” (Bronson i Smithies, 1994; Joyner 2000) w taki sposób, że jedna selekcja odzyskuje wszystkie komórki, w których elektroporowane DNA zostało wprowadzone do genomu, a druga selekcja jest skierowana przeciwko klonom ES, w których DNA zostało wprowadzone losowo. Myszy Knockin/out mogą być następnie wygenerowane przez fuzję wybranych sklonowanych komórek ES z embrionami, ponowną implantację w celu umożliwienia rozwoju i hodowlę powstałych chimer w celu wygenerowania myszy, w których wszystkie komórki noszą zmieniony gen.
Pomimo, że całe rośliny lub tkanki liściowe zostały zgłoszone jako nadające się do transfekcji przez elektroporację, komórki roślinne muszą być generalnie przekształcone w protoplasty zanim DNA może być łatwo do nich wprowadzone (protokół alternatywny; Fromm et al., 1985; Ou-Lee et al., 1986). Podobnie jak komórki ssaków, protoplasty roślinne mogą być poddawane elektroporacji w różnych warunkach elektrycznych (parametry krytyczne). Zarówno wysokie napięcie z niską pojemnością (krótki czas trwania impulsu) lub niskie napięcie z wysoką pojemnością (długi czas trwania impulsu) zostały wykorzystane do osiągnięcia udanego transferu genów (Chu et al., 1991). EP in vivo została pierwotnie wykorzystana do dostarczania środków chemioterapeutycznych do guzów litych i przeszła od badań przedklinicznych do prób klinicznych (Gothelf, et al., 2003). Dostarczanie in vivo plazmidowego DNA za pomocą elektroporacji zostało po raz pierwszy opisane na początku lub w połowie lat 90-tych (Titomarov, et al., 1991; Heller, et al., 1996; Nishi, et al., 1996) i było logicznym postępem opartym na sukcesie transfekcji in vitro za pomocą elektroporacji i wykazaniu, że procedura ta może być bezpiecznie przeprowadzona in vivo przy dostarczaniu małych cząsteczek, takich jak środki chemioterapeutyczne. Wykorzystanie elektroporacji in vivo do dostarczania plazmidowego DNA odnotowało ogromny wzrost liczby prowadzonych badań przedklinicznych, a ostatnio zostało przeniesione do kliniki (Heller, et al., 2006a i Bodles-Brakhop, et al.,2009).
Szerokie zastosowanie elektroporacji stało się możliwe w dużej mierze dzięki dostępności komercyjnych aparatów, które są bezpieczne i łatwe w użyciu oraz dają niezwykle powtarzalne wyniki. Konstrukcje tych maszyn różnią się znacznie, ale należą do dwóch podstawowych kategorii, które wykorzystują różne środki kontroli czasu trwania impulsu i napięcia (dwa parametry elektryczne, które regulują tworzenie porów). Jeden rodzaj wykorzystuje system rozładowania kondensatora do generowania wykładniczo malejącego impulsu prądowego, a drugi generuje prawdziwą falę kwadratową (lub jej przybliżenie). Aparaty z rozładowaniem kondensatorowym ładują swój wewnętrzny kondensator do określonego napięcia, a następnie rozładowują go przez zawiesinę komórka-DNA. Zarówno wielkość kondensatora, jak i napięcie mogą być zmieniane. Ponieważ impuls prądu jest wykładniczo malejącą funkcją (1) napięcia początkowego, (2) ustawienia pojemności przyrządu oraz (3) oporności obwodu (w tym próbki), zmiana wielkości kondensatora w celu umożliwienia przechowywania większej (lub mniejszej) ilości ładunku przy danym napięciu spowoduje dłuższe (lub krótsze) czasy zaniku, a tym samym inny efektywny czas trwania impulsu. W przeciwieństwie do tego, generatory fali kwadratowej kontrolują zarówno napięcie, jak i czas trwania impulsu za pomocą półprzewodnikowych urządzeń przełączających. Mogą one również wytwarzać szybko powtarzające się impulsy. Do zastosowań in vivo preferowane są generatory fali kwadratowej. Oprócz czasu trwania impulsu i amplitudy, liczba impulsów i konfiguracja elektrod również wpływają na skuteczność dostarczania.
Większość naszych eksperymentów z elektroporacją in vitro wykorzystała Bio-Rad Gene Pulser, urządzenie do wyładowań kondensatorowych, ale są one bezpośrednio stosowane do innych urządzeń do wyładowań kondensatorowych, a z pewnymi dostosowaniami do generatorów fali kwadratowej. Urządzenia do rozładowywania kondensatorów są również dostępne w firmach GIBCO/BRL, BTX, Hoeffer Scientific i International Biotechnologies (adresy dostawców znajdują się w DODATKU 4). Urządzenia te, zarówno w pojedynczej jednostce, jak i jako komponenty dodatkowe, mogą zapewnić różnorodne warunki elektroporacji odpowiednie dla większości zastosowań. Generatory fali kwadratowej są dostępne w firmach BTX, Baekon, CytoPulse Sciences, Sonidel, Bio-Rad, Jouan i IGEA i oferują dużą kontrolę nad szerokością impulsu, umożliwiają wielokrotne, szybkie impulsy i mogą być bardziej skuteczne w przypadku komórek bardzo wrażliwych lub z innych względów trudnych do transfekcji. Wykorzystanie elektroporacji do przeprowadzenia terapii genowej u żywych zwierząt lub ludzi również wymaga dobrej kontroli parametrów elektroporacji, aby zapewnić efektywny transfer DNA przy minimalnym uszkodzeniu tkanek, a to z kolei wymaga generatorów fali kwadratowej. Generatory są dostępne w wersji umożliwiającej podawanie impulsów o stałym napięciu lub stałym prądzie. Oprócz generatorów fali kwadratowej, dostawcy ci oferują również elektrody odpowiednie do elektroporacji in vivo. Urządzenia te są z reguły droższe. Stało się oczywiste, że impulsy prądu zmiennego o częstotliwości ~100 kHz mogą być najbardziej efektywną formą fali do elektroporacji i ewentualnie elektroporacji (Chang, 1989).
Większość naszych eksperymentów in vivo wykorzystywała generatory fali kwadratowej BTX T820 lub T830. Eksperymenty te wykorzystywały komercyjnie dostępne elektrody, takie jak układ 2-igłowy, elektrody suwmiarkowe i elektrody kleszczowe, jak również elektrody zaprojektowane na zamówienie. Jak wspomniano powyżej, główni dostawcy sprzętu do elektroporacji dysponują różnymi elektrodami penetrującymi i niepenetrującymi. Generatory fali kwadratowej pozwalają na lepszą kontrolę parametrów impulsu, co jest szczególnie ważne w przypadku podawania in vivo. Wzrost zastosowania elektroporacji in vivo jest bezpośrednio związany z jej efektywnym dostarczaniem do mięśni. Zastosowanie domięśniowego dostarczania genów za pomocą elektroporacji ma szczególne znaczenie dla celów szczepień (Abdulhagg, et al., 2008). Wykazano również, że mięśnie są doskonałym magazynem dla zastosowań zastępowania białek opartych na genach (Trollet, et al., 2006). Dostarczanie do mięśni może być również wykorzystane do dostarczania szczepionek przeciwnowotworowych (Bodles-Brakhop, et al., 2009). Dostarczanie do skóry również zyskało akceptację jako wszechstronny cel. Dostarczanie do skóry może być wykorzystywane do bezpośredniego leczenia chorób skórnych, dostarczania białek do krążenia w terapii ogólnoustrojowej, terapii przeciwnowotworowej oraz do dostarczania szczepionek DNA (Hirao, et al., 2008, Roos, et al., 2006, Glasspool-Malone, et al., 2000).
Elektroporacja może być łatwiejsza do przeprowadzenia niż alternatywne techniki, dlatego jest coraz częściej wykorzystywana. Jej wadą w przypadku analizy stanów przejściowych jest to, że potrzeba prawie pięciokrotnie więcej komórek i DNA niż w przypadku transfekcji z zastosowaniem fosforanu wapnia lub DEAE-dextranu (UNITS 9.1, 9.2 & 16.12). Główną różnicą między elektroporacją a procedurami koprecypitacji fosforanu wapnia jest stan zintegrowanego DNA po selekcji w odpowiednich pożywkach antybiotykowych. W przypadku fosforanu wapnia ilość DNA pobranego i zintegrowanego z genomem każdej transfekowanej komórki mieści się w zakresie 3 × 106 bp. W rezultacie, transfekowane DNA często integruje się jako duże tandemowe tablice zawierające wiele kopii transfekowanego DNA. Byłoby to korzystne, gdy pożądana jest transfekcja genomowego DNA do komórek biorcy oraz selekcja dla pewnej zmiany fenotypowej, takiej jak złośliwa transformacja; w tym przypadku duża ilość DNA zintegrowanego na komórkę biorcy jest niezbędna. W przeciwieństwie do tego, elektroporacja może być dostosowana tak, aby skutkować jedną do wielu kopii wprowadzonego DNA na komórkę biorcy. Byłoby to korzystne dla badań ekspresji genów, ponieważ tożsamość szczególnej kopii odpowiedzialnej za ekspresję genu może być kontrolowana oraz, jak omówiono powyżej, jest to niezbędne dla ukierunkowania genów komórek ES w celu wygenerowania transgenicznych myszy.
.