Zakażenie Giardia lamblia jest jedną z najczęstszych przyczyn chorób biegunkowych na świecie (22). Ten pierwotniak kolonizuje jelito cienkie i może przyczepiać się do nabłonka, ale nie wnika w błonę śluzową. Zakażenia mają zwykle charakter samoograniczający się, ponieważ immunokompetentni gospodarze mogą kontrolować i zazwyczaj eliminować G. lamblia, w procesie tym biorą udział komórki T CD4 oraz wytwarzanie wydzielniczej immunoglobuliny A (IgA) i innych, słabo poznanych czynników efektorowych (6, 8, 9, 18). Pomimo często ciężkich objawów klinicznych, biegunki, bólu brzucha, zaburzeń wchłaniania i utraty masy ciała, zakażeniu nie towarzyszy istotny stan zapalny błony śluzowej (12). Obserwacje te sugerują, że mediatory zapalenia mogą nie być istotne dla biegunki wywołanej przez pasożyta, chociaż mechanizmy rządzące biegunką w giardiazie są słabo poznane. Nie wykazano, aby Giardia uwalniała enterotoksyny, które mogłyby odpowiadać za zaburzenie wchłaniania lub wydzielania płynu jelitowego. Zmniejszenie powierzchni chłonnej z powodu utraty mikrofilmów nabłonka występuje po zakażeniu Giardia u myszy (16), co może prowadzić do osmotycznie napędzanej biegunki związanej z zaburzeniami wchłaniania, ale bezwzględne zmniejszenie powierzchni jest niewielkie w porównaniu z przewidywaną rezerwą anatomiczną jelita cienkiego. Ludzie zarażeni G. lamblia wykazują oznaki hipermobilności jelit w badaniu radiologicznym (15), zjawisko to zaobserwowano również u eksperymentalnie zarażonych myszoskoczków mongolskich (5). Mechanizmy leżące u podstaw tych odkryć i ich znaczenie funkcjonalne są obecnie niejasne. Dlatego celem obecnego badania było sprawdzenie hipotezy, że hipermobilność jelitowa reprezentuje mechanizm obronny gospodarza przeciwko Giardia, przy użyciu mysich modeli giardiazy.
Dorosłe myszy C57BL/6, SCID i myszy z niedoborem neuronalnej syntazy tlenku azotu (nNOS) zostały uzyskane z The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). W przypadku zakażeń Giardia muris, cysty oczyszczano przez flotację sacharozy, liczono w hemocytometrze pod mikroskopem z kontrastem fazowym i podawano doustnie w wodzie w ilości 104 cyst/mysz w 0,2 ml (9). W przypadku zakażeń G. lamblia, trofozoity szczepu GS/M (ATCC 50580) (11) hodowano w podłożu TYIS-33 i podawano doustnie w ilości 107 cyst/mysz w 0,2 ml tego samego podłoża (9). Ruchliwość jelita cienkiego określano zmodyfikowaną metodą posiłku testowego. Myszy poszczono na noc i podano im 0,2 ml zawiesiny 106 fluorescencyjnych kulek polistyrenowych (mikrosfery karboksylanowe Fluoresbrite YG o średnicy 10 μm; Polysciences, Inc., Warrington, PA) (19) i 6% barwnika karminowego w 5% gumie arabskiej w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Po 20 min jelito cienkie gwałtownie usuwano, a następnie rejestrowano położenie czoła barwnika karminowego i całą długość jelita cienkiego. Następnie jelito podzielono na osiem równej wielkości kawałków, z których każdy otwierano wzdłuż, umieszczano w 2 ml PBS i chłodzono na lodzie przez 10 min. Mieszaniny wstrząsano energicznie w celu oderwania trofozoitów i paciorków, które następnie liczono oddzielnie, używając odpowiednio mikroskopów fazowo-kontrastowych i fluorescencyjnych. Odległość przebytą przez czoło barwnika karminowego wyrażano jako procent całej długości jelita cienkiego. Liczbę kulek w każdym segmencie wyrażono jako procent całkowitej liczby kulek w jelicie cienkim. Aby ocenić wpływ hamowania motoryki jelita cienkiego na klirens giardialny, myszy zakażano najpierw doustnie G. muris lub G. lamblia GS/M i podawano im doustnie co drugi dzień, począwszy od 7 lub 4 dnia, odpowiednio, 30 mg/kg loperamidu lub PBS jako kontrolę. Liczbę trofozoitów jelitowych określano w 21 dniu dla G. muris i w 9 dniu dla G. lamblia.
W celu ustalenia, czy normalne dorosłe myszy są odpowiednim modelem do badania roli motoryki jelitowej w kontrolowaniu infekcji giardialnych, zainfekowaliśmy 8- do 10-tygodniowe myszy C57BL/6 cystami naturalnie występującego patogenu murine G. muris. Ruchliwość jelita cienkiego określano metodą posiłków testowych, stosując barwnik karminowy jako marker fazy ciekłej (14) oraz kulki polistyrenowe o średnicy 10 μm jako marker cząstek o wielkości porównywalnej do trofozoitów Giardia (19). Zakażenie G. muris przyspieszyło pasaż jelita cienkiego, ponieważ czoła zarówno barwnika karminowego (ryc. (ryc. 1A)1A), jak i kulek polistyrenowych (ryc. (ryc. 1B)1B) u myszy zakażonych przemieszczały się znacznie dalej niż u myszy niezakażonych. Analiza przebiegu czasowego tego zjawiska ujawniła, że hipermobilność wystąpiła w ciągu tygodnia po zakażeniu, ale osiągnęła szczyt w 2 do 3 tygodni, w czasie, gdy liczba trofozoitów była zmniejszona w porównaniu z liczbą w czasie maksymalnego zakażenia w 1 tygodniu (Fig. (Fig.1A).1A). Tak więc, maksymalne zmiany w motoryce jelita cienkiego były opóźnione w stosunku do szczytu obciążenia trofozoitami, co sugeruje, że zmiany te mogą być spowodowane przez mechanizm inny niż bezpośrednia stymulacja giardialna.
G. muris infekcja myszy typu dzikiego indukuje hipermotywność jelita cienkiego. (A) Dorosłe myszy C57BL/6 zakażono doustnie 104 cystami G. muris (tygodnie od 1 do 4) lub pozostawiono niezakażone jako kontrolę (tydzień 0). We wskazanym czasie po zakażeniu badano ruchliwość jelita cienkiego (-) i ładunek trofozoitów (○). Dane dotyczące ruchliwości są przedstawione jako odległość przebyta przez posiłek testowy zawierający barwnik karminowy w stosunku do długości całego jelita cienkiego w okresie 20 minut. Wartości to średnie ± błędy standardowe średnich (SEM) wyników dla czterech do siedmiu zwierząt. Gwiazdki oznaczają znaczący (P < 0,05, test t) wzrost ruchliwości w stosunku do niezakażonych kontroli. (B) Myszy zakażone przez 2 tygodnie G. muris (puste słupki) i kontrole niezakażone (wypełnione słupki) otrzymały posiłek testowy zawierający fluorescencyjne kulki polistyrenowe o średnicy 10 μm, a przemieszczanie się kulek oceniano po 20 min. Liczba kulek w każdym z ośmiu równej wielkości segmentów jelita cienkiego (które są ponumerowane w kolejności od proksymalnej dwunastnicy do dystalnej) jest podana jako procent całkowitej liczby kulek w jelicie cienkim. Nie stwierdzono istotnej różnicy między liczbą resztkowych paciorkowców w żołądkach myszy niezakażonych i zakażonych (odpowiednio 14,2% ± 5,7% vs 18,5% ± 3,4%). Wartości są średnimi ± SEM dla sześciu do siedmiu zwierząt. Gwiazdki reprezentują znaczący (P < 0,05, test t) wzrost w stosunku do niezakażonych myszy.
To odkrycie przypomina doniesienia o wywołanej przez Giardia utracie mikrokosmków nabłonka jelitowego, w których uznano, że odpowiedzialna za to jest adaptacyjna odpowiedź immunologiczna gospodarza (16, 17). Aby ocenić, czy podobne mechanizmy mogą być zaangażowane w powodowanie hipermotalności jelita cienkiego, ocenialiśmy myszy z ciężkim połączonym niedoborem odporności (myszy SCID). Myszy te nie posiadają funkcjonalnych komórek T i B z powodu defektu w katalitycznej podjednostce kinazy białkowej zależnej od DNA, PRKDC, która jest wymagana do prawidłowej rekombinacji V(D)J i nie mogą eradykować Giardia (9, 18). Zakażenie myszy SCID szczepem G. muris nie spowodowało zmian w tranzycie jelita cienkiego, co wyraźnie kontrastowało z obserwacjami u myszy immunokompetentnych (ryc. (ryc. 2).2). Wyniki te wskazują, że hipermobilność jelita cienkiego związana z giardiasis była zależna od indukcji normalnej adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej na patogen.
Zależność hipermobilności jelitowej od nienaruszonych funkcji komórek T i B. Dorosłe myszy C57BL/6 (wild-type ) i SCID zakażono doustnie cystami G. muris lub pozostawiono bez zakażenia jako kontrolę, a ruchliwość jelita cienkiego (A) i liczbę trofozoitów (B) oceniano 2 tygodnie po zakażeniu. Wartości są średnie ± SEM dla czterech do sześciu zwierząt. Gwiazdka oznacza znaczący wzrost (P < 0,05, test t) w stosunku do niezakażonych kontroli.
Aby sprawdzić, czy obserwowana hipermobilność jelita cienkiego przyczynia się do klirensu Giardia, podawaliśmy myszom loperamid, lek, który hamuje tranzyt jelitowy poprzez aktywację receptorów μ-opioidowych w przewodzie pokarmowym (2, 13, 21). Leczenie lekami rozpoczęto w czasie szczytowego zakażenia G. muris (dzień 7), aby zapewnić, że farmakologicznie indukowane zmiany w motoryce nie zakłócą początkowego ustanowienia infekcji. Zahamowanie motoryki jelita cienkiego przez loperamid znacznie upośledziło klirens jelitowy, z 25-krotnie wyższą liczbą trofozoitów u myszy leczonych loperamidem niż u myszy kontrolnych leczonych PBS w 21 dniu (ryc. (ryc. 3).3). Leczenie loperamidem nie miało wpływu na rozwój odporności adaptacyjnej, ponieważ leczenie nie miało wpływu na miano antygardialnej IgA w wydzielinach błony śluzowej jelita (dane nie pokazane). Co więcej, ta strategia eksperymentalna wykazała podobny efekt hamujący na zakażenie myszy G. lamblia GS/M, ludzkim patogenem giardialnym, który może zakażać normalne dorosłe myszy (3, 9). Myszy, którym podawano PBS, w znacznym stopniu pozbyły się zakażenia do 9 dnia, podczas gdy myszy, którym podawano loperamid od 4 dnia, nadal miały znaczną liczbę trofozoitów G. lamblia w jelicie cienkim (Rys. (Rys.3).3). Tak więc, zahamowanie motoryki jelita cienkiego upośledzało klirens Giardia u żywiciela murine, niezależnie od gatunku giardii. Jako dodatkowe podejście do określenia znaczenia motoryki jelitowej w obronie antygardialnej gospodarza, zastosowaliśmy podejście genetyczne, w którym zaburzenie genu dla nNOS zakłóca skuteczny napęd w jelicie u myszy (20). Analiza ruchliwości potwierdziła, że myszy z niedoborem nNOS wykazywały konstytutywne opóźnienie w tranzycie żołądkowo-jelitowym w porównaniu z ich miotami typu dzikiego (Fig. (Fig.4A).4A). Równocześnie myszy z nokautem nie były w stanie normalnie usuwać infekcji G. lamblia (ryc. (ryc. 4B).4B). Tak więc, stosując podejście farmakologiczne i genetyczne, stwierdziliśmy, że zmniejszona ruchliwość jelitowa była związana z upośledzeniem obrony gospodarza przed Giardia.
Farmakologiczne hamowanie ruchliwości jelitowej upośledza klirens giardialny. Dorosłe myszy C57BL/6 zakażono doustnie 104 cystami G. muris lub 107 trofozoitami G. lamblia GS/M. Po 7 dniach (G. muris) lub 4 dniach (G. lamblia) myszom podawano loperamid (Lop) lub PBS doustnie co drugi dzień. Liczbę trofozoitów w jelicie cienkim określano we wskazanym czasie po zakażeniu. Wartości są średnimi ± SEM dla ośmiu do dziesięciu zwierząt. *, P < 0,05, jak określono testem t.
Myszy pozbawione nNOS wykazują zmniejszony tranzyt przez przewód pokarmowy i zwiększoną podatność na zakażenie Giardia. (A) Dorosłe myszy z niedoborem nNOS (nNOS-/-) i ich odpowiedniki typu dzikiego (WT) były badane pod kątem motoryki przewodu pokarmowego przy użyciu karminowego barwnika testowego. Wartości są średnimi ± SEM dla co najmniej trzech zwierząt. *, P < 0,05 (test t), w stosunku do wyników dla myszy typu dzikiego. (B) Myszy zakażono doustnie 107 trofozoitami G. lamblia GS/M, a liczbę trofozoitów w jelicie cienkim oznaczono we wskazanym czasie po zakażeniu. Wartości są średnimi ± SEM dla trzech do czterech zwierząt. *, P < 0,05, w odniesieniu do liczby w dniu 4.
Nasze badanie pokazuje, że hipermobilność jelitowa jest ważną obroną gospodarza przed Giardia, wniosek ten został również osiągnięty w innym niedawnym raporcie (10). Ta obrona wydaje się zależeć od rozwoju normalnej adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej przeciwko pasożytowi, ponieważ nie wystąpiła u myszy pozbawionych komórek T i B, chociaż zasadniczo jest możliwe, że komórki T lub B przyczyniają się do hipermotalności niezależnie od ich roli w adaptacyjnej odporności antygardialnej. Zależna od układu odpornościowego hipermobilność działa w obronie żywiciela przed innymi pasożytami jelitowymi, szczególnie helmintami. Na przykład, eliminacja glisty Trichinella spiralis, która spędza znaczną część swojego cyklu życiowego w jelicie cienkim, jest wysoce skorelowana ze zwiększoną ruchliwością jelit (4, 23). Podobnie, wydaleniu tęgoryjca Nippostrongylus brasiliensis u szczurów towarzyszy hipermotywność jelita cienkiego, co sugeruje rolę w obronie gospodarza przed tym helmintem (7). Wspólną cechą wszystkich tych patogenów jelitowych jest ich pierwotna, jeśli nie wyłączna, lokalizacja w świetle jelita. Z anatomicznego punktu widzenia, to miejsce infekcji znajduje się poza nabłonkiem wyściełającym ciało właściwe i dlatego nie jest łatwo dostępne dla wielu efektorowych komórek odpornościowych i cząsteczek, takich jak neutrofile czy dopełniacz, które skutecznie działają w organizmie. W rzeczywistości, skuteczna obrona przeciwdrobnoustrojowa w świetle jelita stanowi szczególne wyzwanie dla gospodarza, który ma ograniczony repertuar mechanizmów obronnych w tym miejscu. Spośród nich, wydzielnicza IgA jest powszechnie uważana za główny luminalny mechanizm obronny, ale jej rzeczywiste znaczenie w oczyszczaniu jelit wydaje się być zmienne i może zależeć od słabo zdefiniowanych czynników gospodarza i pasożyta (6, 9, 18). Nasze dane i wcześniejsze prace z helmintami (4, 23) wskazują, że hipermobilność jelitowa jest kolejnym ważnym mechanizmem obronnym przed kolonizacją światła jelita.
Zależna od immunologii hipermobilność może stanowić mechanistyczne wyjaśnienie biegunki związanej z giardiozą, jak zauważono we wcześniejszych raportach (5, 15). W zasadzie biegunka może być spowodowana zmniejszonym wchłanianiem płynów lub zwiększonym wydzielaniem albo kombinacją tych dwóch mechanizmów. Niewiele jest dowodów na zwiększone wydzielanie jonów i płynów w giardiazie, co pozostawia upośledzone wchłanianie płynów jako prawdopodobną przyczynę. Oczekuje się, że skrócony czas kontaktu z płynami luminalnymi, które mogą być połknięte lub pochodzić z wydzieliny żołądka lub trzustki, może pogorszyć skuteczność transportu jonów przez nabłonek, szczególnie gdy hipermobilność jest połączona z opisywaną utratą chłonnych powierzchni nabłonka (16). Należy jednak zauważyć, że myszy nie wykazują szczerej biegunki po zakażeniu Giardia. Niemniej jednak, możliwe jest, że brak równowagi płynów jelitowych występuje zarówno u ludzi jak i u zwierząt, i że jest on kompensowany u myszy, ale nie u ludzi. Jeśli hipermobilność rzeczywiście przyczynia się do patogenezy biegunki, nasze odkrycie, że myszy SCID nie wykazywały hipermobilności wywołanej przez Giardia, sugerowałoby, że pacjenci z niedoborami odporności komórkowej związanymi ze zwiększoną podatnością na infekcje Giardia (np. przewlekły zmienny niedobór odporności) mogą być mniej podatni na rozwój biegunki związanej z infekcją. Ponadto, nasze wyniki sugerują, że ostrożność jest wskazana przy rozważaniu stosowania inhibitorów motoryki jelit w leczeniu biegunki wywołanej przez Giardia (1), ponieważ takie leczenie może przedłużyć infekcję leżącą u jej podłoża.
.