3.4 Inosine Modification and mRNA Turnover

Modyfikacja mRNA z adenozyny na inozynę (A-I) jest katalizowana przez deaminazy adenozyny, które działają na enzymy RNA (ADAR). Enzymy te preferują regiony dwuniciowego RNA, a konwersja A-I (w tym rozdziale opisana również jako edycja) zmieni właściwości parowania zasad zmodyfikowanych zasad, ponieważ będą one teraz parować podobnie do guaniny. Podobnie jak poprzednio, oddzielimy bezpośrednie efekty działania inozyny na stabilność mRNA od tych, które wynikają z efektów pośrednich. Wprowadzenie inozyny do dwuniciowych regionów RNA może wywołać degradację poprzez rekrutację rybonukleaz specyficznych dla RNA zawierającego inozynę. Pierwszym enzymem, który zaproponowano do pośredniczenia w tym efekcie jest nukleaza Tudor-staphylococcal (SN), która promowała rozszczepianie hiperedytowanego dwuniciowego RNA w ekstraktach. Większość wyników opisanych w tej pracy wykazuje biochemiczną aktywność Tudor-SN na hiperedytowanych substratach in vitro. Nie jest jednak jasne na podstawie tych badań, jaka część mRNA zawierającego inozynę podlega rozszczepieniu przez Tudor-SN in vivo i czy Tudor-SN był bezpośrednią endonukleazą, czy też nie. Stwierdzono, że Tudor-SN lokalizuje się w cytoplazmatycznych ziarnistościach stresowych, więc możliwe jest, że niektóre z docelowych transkryptów mogą być preferencyjnie regulowane podczas warunków stresowych. Drugą nukleazą, o której wiadomo, że jest specyficzna dla RNA zawierającego inozynę, jest ludzka endonukleaza V (hEndoV), która może rozszczepiać różne substraty RNA zawierające inozynę in vitro. Jedno z badań sugeruje, że hEndoV jest rzeczywistą endonukleazą inozyny, a Tudor-SN zapewnia aktywność stymulującą dla hEndoV. Co ciekawe, hEndoV lokalizuje się również w cytoplazmatycznych ziarnistościach stresowych, sugerując funkcję podobną do Tudor-SN w potencjalnej regulacji poziomów mRNA zawierającego inozynę podczas stresu. Podsumowując, chociaż jest jasne, że aktywność specyficznych dla inozyny nukleaz istnieje w komórkach eukariotycznych (Rys. 5), ich udział w rozszczepianiu i obrocie mRNA pozostaje słabo poznany. Dlatego fizjologiczny wpływ rozszczepiania hiperedytowanego dsRNA przez Tudor-SN i/lub hEndoV wymaga dokładniejszego zbadania.

Ezymy ADAR mogą również odgrywać ważną rolę w stabilności mRNA poprzez regulację wiązania białek wiążących RNA, które wpływają na rozpad mRNA. Wpływ ADAR na poziom ich docelowego mRNA był mierzony globalnie i ogólnie ich wpływ na poziom mRNA nie koreluje dobrze z ich zdolnością do promowania tworzenia inozyny w tych mRNA. Wydaje się raczej, że główny wpływ ADAR na stabilność mRNA odbywa się poprzez rekrutację białka wiążącego RNA – HuR (ELAVL1), które jest głównym regulatorem rozpadu mRNA. ADAR1 oddziałuje z HuR w sposób zależny od RNA, a większość mRNA ulegających degradacji przy braku ADAR1 zawiera miejsca wiążące HuR. Tak więc, ADAR1 wydaje się wpływać na stabilność swoich celów mRNA poprzez rekrutację HuR do miejsc docelowych zlokalizowanych w pobliżu. ADAR mogą również regulować poziom kilku mRNA i ncRNA poprzez zapobieganie wiązaniu czynnika rozpadu PARN, który jest specyficzną nukleazą poli(A)-ową. Ta funkcja również wydaje się niezależna od redagowania, ponieważ katalitycznie nieaktywny mutant ADAR jest w stanie spełniać funkcje enzymu w kontroli rozpadu. Tak więc, wpływ ADAR na stabilność ich celów mRNA wydaje się być w większości niezależny od ich zdolności do promowania tworzenia inozyny.

Główna konsekwencja modyfikacji inozyny na obrót mRNA wynika z wpływu inozyny na regulację genów pośredniczoną przez mikroRNA. Obecność inozyny może wpływać na dwa główne etapy tego szlaku: (i) biogenezę mikroRNA oraz (ii) specyficzność ukierunkowania mRNA przez mikroRNA. Jeśli chodzi o wpływ inozyny na biogenezę mikroRNA, wykazano, że pierwotne prekursory mikroRNA mogą być edytowane przez ADAR1 lub ADAR2 . Obecność inozyny w tych prekursorach ma dwojaki szkodliwy wpływ na produkcję dojrzałych mikroRNA. Po pierwsze, inozyna zmniejsza wydajność przetwarzania pierwotnych prekursorów przez Drosha; po drugie, prekursory zawierające inozynę stają się teraz celem dla specyficznych dla inozyny rybonukleaz, takich jak Tudor-SN i/lub hEndoV. Te połączone efekty modyfikacji inozyną pierwotnych prekursorów mikroRNA prowadzą do obniżenia poziomu mikroRNA produkowanych z tych prekursorów, z jednoczesnym wzrostem docelowych mRNA. Proces ten może być regulowany, ponieważ wykazano, że prekursory mikroRNA miR-151 są edytowane podczas wczesnego rozwoju, co powoduje degradację prekursorów przez Tudor-SN . Bardziej ogólnie, prekursory mikroRNA zawierające inozynę są degradowane podczas stadiów postzygotycznych u myszy. Wyniki te wskazują, że redagowanie przez A-I prekursorów mikroRNA może regulować ich biogenezę podczas rozwoju, co z kolei bezpośrednio wpływa na ekspresję ich docelowych mRNA. Jednak wpływ ADAR na biogenezę mikroRNA jest złożony, ponieważ wykazano, że ADAR1 heterodimeryzuje z enzymem RNazy III Dicer w celu zwiększenia wydajności przetwarzania mikroRNA, odgrywając tym samym pozytywną rolę w biogenezie mikroRNA. Złożoność bezpośredniego i pośredniego wpływu ADAR na biogenezę małych RNA została również wykazana w całym genomie u Caenorhabditis elegans. Wreszcie, ADAR1 może również wiązać siRNA niezależnie od edycji RNA w komórkach ssaków, co ogranicza skuteczność leczenia siRNA. Dlatego też ADAR wydają się być mieczem obosiecznym dla wyciszania genów z udziałem mikroRNA i małych RNA, ponieważ supresyjny wpływ modyfikacji inozyną na przetwarzanie i stabilność prekursorów mikroRNA może być równoważony przez zdolność ADAR do promowania przetwarzania mikroRNA poprzez ich związek z Dicer i ich wpływ na dostępność siRNA. Niemniej jednak, enzymy te odgrywają kluczowe funkcje w kontroli różnicowania komórkowego poprzez edycję prekursorów mikroRNA. Na przykład, hiperedycja prekursora mikroRNA Let-7 przez ADAR1 w białaczce okazała się promować odnowę białaczkowych komórek macierzystych, podkreślając znaczenie precyzyjnego dostrajania edycji prekursorów mikroRNA podczas różnicowania komórek.

Inozyna wpływa również na regulację mRNA za pośrednictwem mikroRNA poprzez wpływ na tworzenie dupleksów RNA, co jest krytyczne w określaniu specyficzności interakcji mikroRNA-mRNA (ryc. 5). Po raz pierwszy wykazano, że wprowadzenie inozyny do mikroRNA miR-376 spowodowało represję innej grupy mRNA w stosunku do tych represjonowanych przez niezmodyfikowany miR-376 . Jeśli edytowane miejsce znajduje się w sekwencji nasiennej mikroRNA, modyfikacja powoduje zmianę specyficzności dla mikroRNA, ponieważ inozyna preferencyjnie paruje zasady z C. I odwrotnie, edycja A-I w sekwencjach 3′-UTR mRNA zmieni potencjalne ukierunkowanie tych UTR przez mikroRNA i może stworzyć nowe miejsca wiążące mikroRNA. Wykazano, że regulowana edycja jest potencjalnie ważna w regulacji onkogenów i genów supresorowych nowotworów poprzez mikroRNA podczas transformacji komórkowej .

Wreszcie, inozyna może wpływać na stabilność mRNA poprzez efekty pośrednie. Stwierdzono, że mRNA zawierające inozynę są ograniczone do jądra w komórkach odpornościowych stymulowanych przez LPS, co zapobiega ich ekspozycji na cytoplazmatyczną maszynerię rozpadu mRNA. Jądrowe zatrzymanie tych mRNA, jednakże, poddawałoby je preferencyjnej degradacji przez jądrowe szlaki degradacji, takie jak egzosom jądrowy. Może to skutkować zwiększeniem lub zmniejszeniem stabilności, w zależności od względnej wydajności każdego z tych szlaków degradacji w odniesieniu do konkretnego mRNA. Inozyna wpływa również na alternatywne splicing, co z kolei może prowadzić do powstania izoform mRNA o różnej stabilności. Jest to szczególnie prawdziwe, jeśli alternatywnie splicowane gatunki zawierają miejsca wiązania dla różnych białek wiążących RNA, które modulują ich stabilność. Dlatego inozyna i ADAR mogą wpływać na stabilność i ekspresję mRNA na wiele sposobów poprzez kombinację zarówno bezpośrednich, jak i pośrednich efektów.

.