Wyniki

Analiza próbek klinicznych.

We wrześniu 2006 r. wirus grypy A/Swine/Missouri/4296424/2006 (Sw/4296424) został wyizolowany od kilku 5- do 6-tygodniowych świń z wieloogniskowym zapaleniem oskrzeli w komercyjnej hodowli świń. Zmiany w płucach obejmowały umiarkowane, podostre do przewlekłego, ropne zapalenie oskrzeli i śródmiąższowe zapalenie płuc z zapaleniem oskrzelików i zapaleniem okołobłoniastym. Tkanka płuc była negatywna w kierunku wirusa zespołu rozrodczo-oddechowego świń (PRRSV), cirkowirusa świń typu 2 (PCV2) i Mycoplasma hyopneumoniae, ale była pozytywna w kierunku Streptococcus suis. Ze względu na charakterystyczne zmiany grypopodobne i objawy kliniczne zapalenia płuc, homogenat tkanki płucnej został zaszczepiony na komórki Madin-Darby canine kidney (MDCK). Efekt cytopatyczny stwierdzono w 3. dniu po inokulacji (p.i.). Gen nukleoproteiny (NP) wirusa grypy wykryto w zakażonych komórkach metodą RT-PCR. Wirus nie reagował z antysurowicami świń referencyjnych (A/Sw/IA/1973 H1N1, A/Sw/TX/1998 H3N2, A/Sw/NC/2001 H1N1) w testach zahamowania hemaglutynacji (HI), a multipleksowa RT-PCR nie wykryła genów H1N1 ani H3N2 (14). Wirus został przekazany do National Animal Disease Center (NADC) w lutym 2007 r. w celu określenia podtypu i sekwencjonowania.

Po określeniu podtypu i sekwencjonowaniu (opisanym poniżej) izolatu z września, wyszukiwanie w rejestrach przypadków ujawniło, że w kwietniu 2006 r. przekazano inny „nietypowy” izolat grypy. A/Swine/Missouri/2124514/2006 (Sw/2124514) został wyizolowany od 12-tygodniowej świni z chorobą układu oddechowego w innym komercyjnym gospodarstwie zajmującym się hodowlą i wykańczaniem świń. Zmiany w płucach były histopatologicznie charakterystyczne dla grypy świń (ciężkie, podostre zapalenie pęcherzyków płucnych i oskrzeli z martwicą komórek nabłonka oskrzelików i metaplazją). Płuco było negatywne na PRRSV, PCV2 i M. hyopneumonia, ale pozytywne na wirusa grypy A przez RT-PCR (specyficzne dla genu NP) i S. suis. Wirus został przekazany do NADC w marcu 2007 w celu określenia podtypu i sekwencjonowania.

Subtyping i analiza filogenetyczna.

W celu zidentyfikowania i scharakteryzowania obu wirusów grypy przeprowadzono sekwencjonowanie kwasów nukleinowych oraz analizę molekularną i filogenetyczną. Oba wirusy zostały bezpośrednio zsekwencjonowane z izolatów o niskim stopniu pasażowania przy użyciu komórek MDCK, a sekwencje zostały potwierdzone po oczyszczeniu płytek i resekwencjonowaniu. Zidentyfikowano je jako wirusy H2N3 na podstawie sekwencji nukleotydów i wyszukiwania BLAST w Influenza Sequence Database (www.flu.lanl.gov). Segment genu HA wirusa Sw/4296424 najbardziej pasował do segmentów genu H2 wirusów wyizolowanych od krzyżówek w Ameryce Północnej. Jego segment NA był blisko spokrewniony z segmentem NA wirusa ptasiej grypy (AIV) H4N3 wyizolowanego od teala niebieskoskrzydłego (98,3% identyczności). Z wyjątkiem genu kwasowej polimerazy (PA), jego wewnętrzne geny pochodziły od współczesnych potrójnie zakażonych wirusów grypy świń występujących obecnie w Stanach Zjednoczonych. Wirusy te posiadają wewnętrzne geny pochodzące z ludzkiego (PB1), ptasiego (PB2, PA) i świńskiego wirusa grypy (SI Tabela 4). Jego segment PA był w 99,2% identyczny z segmentem H6N5 AIV wyizolowanym od kaczek krzyżówek (Tabela SI 4). Wirusy Sw/2124514 i Sw/4296424 wykazywały 99,3-99,9% całkowitą identyczność sekwencji nukleotydów (Tabela SI 5). Oba izolaty były wielokrotnie klonowane plazmowo, ponownie testowane i potwierdzone przez sekwencjonowanie jako należące do podtypu H2N3. Podtyp H2N3 potwierdzono serologicznie testami zahamowania hemaglutynacji i zahamowania neuraminidazy. Analiza filogenetyczna oparta na genach HA i NA wykazała, że te dwa wirusy należą do amerykańskiej linii ptasiej, która różni się od szczepów ptaków euroazjatyckich i wirusów H2N2 wyizolowanych od ludzi po pandemii grypy w 1957 r. (ryc. 1).

Molekularna analiza białek powierzchniowych HA i NA.

Wirusy grypy A zawierają dwa białka powierzchniowe: HA jest glikoproteiną wiążącą receptory i łączącą błony, a NA jest enzymem niszczącym receptory. Wirusowy HA jest krytycznym czynnikiem specyficzności gatunkowej wirusów grypy w stosunku do gospodarza (15). W celu scharakteryzowania pozostałości w obrębie HA, które mogą być związane z adaptacją wirusa ptasiego do gospodarza ssaczego, porównaliśmy sekwencje aminokwasowe HA świń z sekwencjami rzekomo referencyjnych wirusów ptasich. Molekularne porównanie cząsteczek HA dwóch świńskich izolatów H2N3 ujawniło, że różnią się one od putatywnego referencyjnego wirusa H2N3 wyizolowanego od krzyżówek sześcioma wspólnymi substytucjami aminokwasowymi (D36N, Q226L, T274I, V316I, L419I i L506V) (Tabela 6 SI). Substytucja Q226L została znaleziona w obu izolatach H2N3 świń, podczas gdy pozycja 228 zawierała G, identyczną z sekwencją konsensusową ptaków (Tabela 1) (16). W przeciwieństwie do tego, ludzkie cząsteczki HA podtypu H2 zawierają 226L i 228S, podczas gdy wczesne ludzkie izolaty H2 zawierają 226L i 228G (Tabela 1), podobnie jak izolaty świńskie. Pozycje 36N, 274I, 316I i 419I są unikalne dla dwóch świńskich izolatów H2N3 (tabela SI 6), podczas gdy odpowiednie pozycje w izolatach ludzkich i ptasich przedstawionych na ryc. 1 a to 36D, 274T, 316V i 419L. W przypadku izolatów grypy przedstawionych na rys. 1 a, pozycja 506V jest konserwowana wśród izolatów ludzkich, dwóch izolatów H2N3 świń i izolatów ptasich, z wyjątkiem A/mallard/Alberta/2004 (H2N3), jak pokazano w tabeli SI 6. Stwierdzono dwie wspólne zmiany aminokwasów w sekwencji aminokwasowej NA obu izolatów świń w porównaniu z referencyjnym wirusem H4N3 wyizolowanym od teala niebieskoskrzydłego: H47Y i H253Y (SI Tabela 7). Pozycja 47Y w obu świńskich izolatach H2N3 jest taka sama jak odpowiedni aminokwas w euroazjatyckich izolatach ptasich przedstawionych na ryc. 1 b; odwrotnie, pozycja w północnoamerykańskich izolatach ptasich to 47H. Pozycja 253Y jest unikalna dla świńskich izolatów H2N3, a pozycja 253H jest konserwowana w euroazjatyckich i północnoamerykańskich izolatach ptasich przedstawionych na ryc. 1 b. Co ciekawe, Sw/4296424 (H2N3), wyizolowany 5 miesięcy później niż Sw/2124514 (H2N3), miał dwie dodatkowe substytucje (P162S i L321V) w cząsteczce HA i trzy dodatkowe substytucje (V30I, I49T i A135T) w cząsteczce NA w porównaniu z HA i NA izolatu Sw/2124514 (SI Tabele 6 i 7). Pozycja 30I (Sw/4296424) w cząsteczce NA jest podobna do izolatów euroazjatyckich, podczas gdy pozycja 30V (Sw/2124514) jest zachowana w północnoamerykańskich izolatach ptaków.

Patogenność i zdolność przenoszenia wirusów grypy świń H2N3 u świń.

Aby zbadać stopień przystosowania świń do wirusa H2N3, zbadaliśmy jego patogenność u tego gospodarza, zaszczepiając 20 4-tygodniowych świń 2 × 106 50% dawką infekcyjną hodowli tkankowej (TCID50) wirusa Sw/4296424. Wybrano tylko jeden wirus H2N3, z powodu wysokiej identyczności między dwoma izolatami. Dwanaście świń kontrolnych było kpiąco zaszczepionych niezakażającym supernatantem z hodowli komórkowej. Oceniliśmy zdolność przenoszenia poprzez współmieszkanie 10 świń kontaktowych dopasowanych wiekowo ze świniami zaszczepionymi, począwszy od 3 dnia p.i. Wszystkie świnie użyte do badań były seronegatywne w dniu 0 dla przeciwciał przeciwko wirusom grypy świń H1N1, H1N2, H2N3, i H3N2 za pomocą testu HI. Pięć inokulowanych świń i trzy świnie kontrolne poddano eutanazji w celu przeprowadzenia sekcji zwłok w dniach 3, 5 i 7 p.i. 10 świń kontaktowych i 5 świń inokulowanych wirusem poddano badaniom serologicznym testem HI z H2N3 odpowiednio w 24 dniu po kontakcie lub w 27 dniu p.i.. Nie zaobserwowano żadnych ostrych objawów oddechowych. Sekcja zwłok ujawniła poważne makroskopowe zmiany w płucach (śliwkowy kolor, skonsolidowane obszary) u świń inokulowanych, ale nie ujawniła ich u świń kontrolnych (Tabela 2). Wynik histopatologiczny (0-3) wyrażający stopień uszkodzenia architektury płuc wynosił >2 u świń inokulowanych (Tabela 2). Płuca inokulowanych świń poddanych eutanazji w dniu 3, 5, lub 7 p.i. wykazywały łagodne do umiarkowanego śródmiąższowe zapalenie płuc i ostre do podostrego martwicze zapalenie oskrzeli z niewielkim limfocytarnym obkurczeniem oskrzeli i naczyń (Rys. 2). Wirus oznaczano w płynie z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (BALF) i izolowano z próbek wymazu z nosa. Miano wirusa w płucach wahało się od 104.3 do 106.5 TCID50/ml w dniach 3 i 5 p.i. (SI Tabela 8) i było ujemne w dniu 7 p.i. W grupie zaszczepionej H2N3, wirus został wyizolowany z próbek wymazu z nosa u 25% (5 z 20) świń w dniu 3, 67% (10 z 15) w dniu 5 i 20% (2 z 10) w dniu 7 p.i.; w grupie kontaktowej, 10% (1 z 10) próbek było dodatnich w dniach 5 i 7 po kontakcie. W przeciwieństwie do tego, 100% (10 z 10) świń kontaktowych było seropozytywnych po 24 dniach kontaktu z zaszczepionymi świniami (SI Tabela 9). Niektóre świnie kontrolne miały sporadycznie małe ognisko łagodnego śródmiąższowego zapalenia płuc (Tabela 2), ale były one negatywne na zakażenie wirusem grypy świń. Wszystkie świnie były negatywne dla PRRSV i M. hyopneumoniae przez PCR. Nasze wyniki wskazują, że wirus H2N3 jest patogenny u świń i jest przenoszony między świniami.

Patogenność wirusów grypy świń H2N3 u myszy.

Aby zbadać zdolność wirusa H2N3 Sw/4296424 do replikacji u myszy, zaszczepiliśmy 6- do 7-tygodniowe myszy BALB/c donosowo 102-106 TCID50. Myszy, którym zaszczepiono 104 TCID50 lub więcej wykazywały objawy choroby (np. ciężki oddech, szorstkie futro, utrata masy ciała i senność) (Tabela 10 SI). Siedemdziesiąt pięć procent myszy, które otrzymały 106 TCID50 zmarło, ale nie było zgonów przy niższych dawkach. Wirusowe RNA wykryto metodą RT-PCR w czasie rzeczywistym (17) w płucach myszy po inokulacji 106 lub 105 TCID50 (tabela SI 10). Pod względem histopatologicznym wirus H2N3 wywoływał liczne lub zlewające się ogniska śródmiąższowego zapalenia płuc i proliferacyjnego zapalenia pęcherzyków płucnych charakteryzujące się znacznym przerostem pneumocytów i naciekaniem ścian pęcherzyków płucnych mieszaną populacją makrofagów, limfocytów i neutrofilów (SI Fig. 3). Niektóre światła pęcherzyków płucnych zawierały skrzepy fibryny i lekkie mieszane wysięki leukocytarne. Łącznie wyniki te wskazują, że H2N3 jest patogenny u myszy bez wcześniejszej adaptacji.

Przenośność wirusa grypy świń H2N3 u fretek.

Aby wywołać pandemię, pojawiający się wirus grypy typu A musi zakażać ludzi i być skutecznie przenoszony wśród ludzi. Aby zbadać potencjał wirusa reasortanta H2N3 do przenoszenia się w systemach ssaków, zastosowaliśmy model kontaktowy fretki (18). Trzy 18-tygodniowe fretki, trzymane w oddzielnych klatkach, zaszczepiono 102,5 TCID50 wirusa H2N3 Sw/2124514. Po 24 godzinach w każdej klatce umieszczano po jednym zwierzęciu kontaktowym. W dniach 1, 4 i 7 p.i. pobierano wymazy z nosa i miareczkowano wirusa w zarodkach. Wirus wykryto u wszystkich zaszczepionych i kontaktowych fretek, ale u żadnej z nich nie wystąpiły wyraźne objawy kliniczne (Tabela 3). Wyniki te wskazują, że wirus grypy H2N3 zakażał fretki i był skutecznie przenoszony przez kontakt.

Serological Investigation of H2N3 Swine Influenza Viruses in Outbreak Farms.

Aby dokładniej zbadać rozprzestrzenianie się wirusów H2N3, przeprowadziliśmy ograniczone badania serologiczne zwierząt związanych z dwoma dotkniętymi systemami produkcji. W pierwszym badaniu, wiosną 2007 roku, pobrano próbki surowicy od loch z czterech gospodarstw, które dostarczyły prosięta do gospodarstw szkółkarskich podczas wybuchu epidemii we wrześniu 2006 roku. Dziewięćdziesiąt procent (54 z 60) było seropozytywnych na obecność przeciwciał dla Sw/4296424 (tabela SI 11). Niektóre z badanych zwierząt były obecne w czasie wystąpienia przypadku indeksowego i nie jest jasne, czy zostały one zarażone w tym czasie, czy też zostały zarażone później. Dane wskazują jednak, że wirus był obecny zarówno w gospodarstwach loch, jak i w gospodarstwach szkółkarskich i że wirus skutecznie przenosił się między zwierzętami. Wszystkie lochy w tej operacji miały miana przeciwciał >1:40 na wirusy grypy świń H1N1 i H3N2, ponieważ zostały wcześniej zaszczepione dwuwartościową szczepionką przeciwko grypie zabitej H1N1 i H3N2.

Próbki surowicy pobrano również wiosną 2007 r. od 30 loch i 90 odsadzonych świń związanych z wybuchem choroby w kwietniu 2006 r. i zbadano je na obecność przeciwciał przeciwko Sw/2124514 przy użyciu testu HI. Spośród 30 loch i 90 odsadzonych świń, od których pobrano próbki, odpowiednio 1 z 30 i 26 z 90 było seropozytywnych (tabela SI 11).