Wzrost i produkcja etanolu S. cerevisiae NCYC 2826 na hydrolizacie słomy pszennej

Figura 1A przedstawia wzrost S. cerevisiae National Collection of Yeast Cultures (NCYC) 2826 hodowanego w temperaturze 30°C przez 36 h w hodowli zawierającej hydrolizat o stężeniu glukozy 123 mM przygotowany zgodnie z opisem w sekcji „Metody”. Szczep S. cerevisiae wybrano ze względu na jego doniesienia o wysokiej tolerancji na etanol i odporności w fermentacjach przemysłowych. Rysunek 1A pokazuje, że gdy S. cerevisiae NCYC 2826 był hodowany na samym hydrolizacie słomy pszennej, tempo wzrostu μ wynosiło 0,036 h-1, a końcowa gęstość optyczna (OD) 0,8. Dodatek Yeast nutrient base (YNB) do pożywki spowodował wzrost μ do 0,135 h-1 i końcowej OD 1,5, podczas gdy dodanie 2,3 mg ml-1 mocznika do hydrolizatu słomy pszennej dało μ 0,99 h-1 i końcową OD 1,3. Wcześniejsze badania wykazały, że suplementy mocznika mogą zwiększyć produkcję etanolu w fermentacji drożdżowej, a sam mocznik jest niezbędnym składnikiem najbardziej minimalnych podłoży do wzrostu drożdży. Nasze wyniki wspierają te wcześniejsze ustalenia, potwierdzając wymóg mocznika dla prawie optymalnego wzrostu drożdży. Po 36 h, stężenie etanolu w hodowlach zostało zmierzone i wydajność etanolu uzyskanego z 123 mM glukozy wynosiła około 90% całkowitej teoretycznej wydajności dla wszystkich kultur. Podczas gdy etanol był produkowany z porównywalną wydajnością w tych trzech warunkach hodowli, wzrost był wolniejszy, a końcowa gęstość optyczna mniejsza w przypadku hydrolizatu słomy pszennej niż gdy do hodowli dodawano mocznik lub YNB. Sugeruje to, że chociaż glukoza była dostępna do fermentacji, hydrolizat nie zawierał wystarczającej ilości składników odżywczych, aby umożliwić kulturze dzielenie się z maksymalną szybkością i osiągnięcie optymalnej gęstości.

Aby zbadać przyczynę zmniejszonego wzrostu komórek na hydrolizacie słomy pszennej, S. cerevisiae NCYC 2826 hodowano na hydrolizacie wytworzonym przy użyciu 5%, 10%, 15% i 20% wyjściowego stężenia słomy i uzupełnionym mocznikiem w ilości 2,3 mg ml-1. Rysunek 1B pokazuje, że wraz ze wzrostem początkowego stężenia słomy faza lagowa wzrostu również się wydłużała do 20 h przy początkowym stężeniu słomy wynoszącym 20%. Końcowa OD również wzrastała wraz ze wzrostem stężenia słomy, co było spowodowane zwiększonym stężeniem uwalnianej glukozy. Wydłużenie fazy lag jest charakterystyczne dla hamowania wzrostu przez związki furanowe, często obecne w hydrolizatach słomy. Analiza zawartości furanów w hydrolizacie wykazała, że zawartość HMF była znikoma (dane nie pokazane), ale stężenie obecnego furfuralu wzrastało wraz z początkowym stężeniem słomy osiągając 0,5 mg ml-1 przy 20% początkowej zawartości słomy (Rysunek 2). Dane te sugerują, że wzrost S. cerevisiae NCYC 2826 na hydrolizacie słomy pszennej jest ograniczony przez stężenie furfuralu obecnego w hydrolizacie.

Stężenie glukozy (kwadraty) i furfuralu (trójkąty) obecne w hydrolizatach słomy pszennej wytworzonych zgodnie z opisem w sekcji „Metody” przy wzrastającym stężeniu początkowym słomy.

Analiza wzrostu zestawu szczepów SGRP na furfural

W celu zidentyfikowania szczepów drożdży, które mogą być odporne na zanieczyszczający furfural, zestaw szczepów SGRP opisany w metodach był hodowany w YNB, 100 mM glukozy i obecności 1,5 mg ml-1 furfuralu. Tabela 1 przedstawia analizę tolerancji zestawu szczepów SGRP na 1,5 mg ml-1 furfuralu przy użyciu systemu punktacji opisanego w części „Metody”. System punktacji był wymagany zamiast średnich czasów opóźnienia, ponieważ repliki szczepu, które nie rosły, nie miały mierzalnej fazy opóźnienia, ale nadal musiały być włączone do zbioru danych.

Wcześniej zaobserwowaliśmy, że zwiększenie inokulum w hodowlach zawierających furfural prowadziło do zmniejszenia fazy lag, przypuszczalnie poprzez maksymalizację ilości żywych komórek drożdży wprowadzonych do podłoża, co prowadziło do szybszego ustanowienia fazy wykładniczej wzrostu (dane nie pokazane). Dlatego też, do tych doświadczeń użyto 5% objętości inokulum z hodowli nocnej. Dane w tabeli 1 pokazują, że wzrost na płytkach repliki był bardzo zmienny, a także zależny od szczepu, wykazując, że stężenie 1,5 mg ml-1 furfuralu jest wystarczające do rozróżnienia tolerancji na furfural u szczepów S. cerevisiae i S. paradoxus. Gdy wzrost szczepów testowano w YNB zawierającym 100 mM glukozy i 2,0 lub 3,0 mg ml-1 furfuralu, w żadnym z tych warunków nie zaobserwowano bardzo słabego wzrostu żadnego z analizowanych szczepów. W związku z tym postanowiono wybrać szczepy na podstawie danych z 1,5 mg ml-1 i poddać je bardziej szczegółowemu badaniu na obecność furfuralu. Analiza danych przedstawionych w tabeli 1 pokazuje, że ogólnie szczepy S. cerevisiae rosły lepiej niż szczepy S. paradoxus na furfuralu 1,5 mg ml-1. Prawie 20% badanych szczepów S. paradoxus nie uzyskało najwyższej oceny w systemie punktowym, podczas gdy dla S. cerevisiae było to mniej niż 10%, co znalazło również odzwierciedlenie w wyższej średniej ocenie ogólnej dla S. cerevisiae wynoszącej 2,5 ± 1,4 w porównaniu do 2,1 ± 1,4 dla S. paradoxus. W obrębie każdej grupy szczepów istniało jednak znaczne zróżnicowanie, a wyniki wahały się od 1,7 do 3,7 dla S. cerevisiae i od 0,3 do 3,0 dla S. paradoxus. Szczepy, które uzyskały wynik powyżej 2,9 przy odchyleniu standardowym mniejszym niż 1,5 uznano za wykazujące znaczną tolerancję na furfural. W związku z tym szczepy S. cerevisiae NCYC 3284 (ex gleba, USA), NCYC 3290 (ex wino bili, Afryka Zachodnia), NCYC 3312 (ex gleba, Holandia) i NCYC 3451 (ex brzeczka, Irlandia), wraz z S. paradoxus NCYC 3277 (ex kora dębu, Wielka Brytania) były dalej badane w bardziej szczegółowym badaniu na obecność furfuralu.

Wpływ rosnących stężeń furfuralu na wzrost i produkcję etanolu

Rysunek 3 przedstawia wzrost w obecności różnych ilości furfuralu (0,1 do 4,0 mg ml-1) dla szczepów S. cerevisiae NCYC 3284, NCYC 3290, NCYC 3312 i NCYC 3451 oraz szczepu S. paradoxus NCYC 3277 zidentyfikowanego w Tabeli 1 z zestawu szczepów SGRP jako posiadającego zwiększoną odporność na furfural. Plik dodatkowy 1: Rysunek S1 przedstawia odpowiednie dane dotyczące wzrostu wykreślone w skali logarytmicznej. Do celów porównawczych włączono również szczep kontrolny S. cerevisiae NCYC 2826. Dla wszystkich sześciu szczepów, wraz ze wzrostem stężenia furfuralu, krzywe wzrostu zaczęły wykazywać wzrost fazy lag, jak to wcześniej zaobserwowano we wzrostach zawierających furfural. Wszystkie badane szczepy były w stanie rosnąć na YNB uzupełnionym 100 mM glukozy i 0,1 do 1,5 mg ml-1 furfuralu. S. cerevisiae NCYC 2826, nasz szczep kontrolny, był w stanie rosnąć tylko na stężeniu do 1,5 mg ml-1, co prowadziło do 30% redukcji końcowej OD w porównaniu do wzrostu na 0,1 mg ml-1 furfuralu. Tabela 2 pokazuje, że produkcja etanolu przez NCYC 2826 w tych warunkach była znacznie obniżona w porównaniu do około 90% wydajności obserwowanej podczas wzrostu na YNB i samej glukozie lub na hydrolizacie słomy pszennej. S. cerevisiae NCYC 2826 został wyizolowany z moszczu winogronowego, a więc jest mało prawdopodobne, aby wykształcił zdolność do wzrostu i fermentacji podczas ekspozycji na furfural.

W swoim badaniu genomiki populacyjnej, Liti i wsp. zidentyfikowali pięć dobrze zdefiniowanych, geograficznie izolowanych linii S. cerevisiae (malezyjską, północnoamerykańską, Saké, zachodnioafrykańską i „winno-europejską”), jak również wiele różnych rekombinowanych (mozaikowych) szczepów tych linii. Z wyników obecnego badania wynika, że odporność na furfural nie jest cechą fenotypową specyficzną dla jednego konkretnego szczepu S. cerevisiae. Spośród czterech zidentyfikowanych szczepów SGRP S. cerevisiae odpornych na furfural, NCYC 3284 (YPS128) należy do linii północnoamerykańskiej, NCYC 3290 (DBVPG 6044) do linii zachodnioafrykańskiej, NCYC 3312 (DBVPG 1373) do linii „winiarskiej/europejskiej”, natomiast NCYC 3451 (jednozarodnikowa pochodna NCYC 361) jest szczepem rekombinowanym.

S. cerevisiae NCYC 3451 wykazywał największą odporność na furfural (Rysunek 3F, Dodatkowy plik 1: Rysunek S1F) i był w stanie rosnąć w obecności do 3,0 mg ml-1 furfuralu. Ponadto, produkcja etanolu w tym szczepie nie wydaje się być hamowana przez furfural, z najwyższą wydajnością etanolu (95 ± 15%; Tabela 2) osiągniętą przy stężeniu (furfuralu) 3,0 mg ml-1. Jak już wspomniano, NCYC 3451 jest szczepem rekombinowanym i wykazano, że posiada mozaikowaty genom pochodzący z co najmniej trzech różnych linii, a mianowicie Saké, zachodnioafrykańskiej i „winnej/europejskiej” (Liti i in. ). Chociaż odnotowano, że szczep ten został wyizolowany z brzeczki jako drożdże psujące piwo, wysoce złożona struktura genomu tego szczepu zdecydowanie sugeruje, choć nie jest to udowodnione, że jest on pochodzenia przemysłowego (na przykład szczep piekarniczy lub piwowarski). Spośród czterech pozostałych badanych szczepów SGRP, szczepy S. cerevisiae NCYC 3290 i NCYC 3312 były w stanie rosnąć na furfuralu o stężeniu 2,5 mg ml-1 (rysunek 3D,C, plik dodatkowy 1: rysunek S1D i S1C, odpowiednio), podczas gdy S. cerevisiae NCYC 3284 (rysunek 3E, plik dodatkowy 1: rysunek S1E) i S. paradoxus NCYC 3277 (rysunek 3B, plik dodatkowy 1: rysunek S1B) mogły rosnąć tylko na furfuralu o stężeniu 2,0 mg ml-1. Ogólnie rzecz biorąc, obecność furfuralu nie miała znaczącego wpływu na produkcję etanolu w pięciu szczepach SGRP. W rzeczywistości, w przypadku NCYC 3312, obecność 0,5 mg ml-1 furfuralu spowodowała znaczny wzrost wydajności etanolu, z 41 ± 8% oczekiwanej wydajności do 75 ± 5% (Tabela 2). Zaobserwowano to również w przypadku szczepu psującego piwo NCYC 3451, ale w mniejszym stopniu (wzrost wydajności tylko o 14%; Tab. 2). Rzeczywiście, ostatnio wykazano, że niewielkie ilości alkoholu furfurylowego, produktu dehydratacji furfuralu w drożdżach, mogą w rzeczywistości prowadzić do zwiększenia produkcji etanolu.