MUCUS HYPERSECRETION AND CHRONIC RESPIRATORY DISEASE

Hypersecretion of mucus into the airways is an important contributor to morbidity and mortality in many patients with severe chronic lung diseases, such as chronic pulmonary obstructive disease (COPD), asthma, and cystic fibrosis.35. Nadmiar śluzu w drogach oddechowych może ograniczać przepływ powietrza, a jego obecność jest szczególnym czynnikiem ryzyka dla tych pacjentów z POChP, którzy są podatni na infekcje klatki piersiowej. POChP jest ciężką, przewlekłą chorobą zapalną dróg oddechowych, na którą składają się trzy schorzenia: przewlekłe zapalenie oskrzeli (długotrwała hipersekrecja śluzu w drogach oddechowych), choroba małych dróg oddechowych i rozedma płuc.36 Na całym świecie wzrasta częstość jej występowania i obciążenie ekonomiczne.37,38 W POChP pacjenci z przewlekłą hipersekrecją śluzu mają znacznie zwiększone ryzyko hospitalizacji i zgonu w porównaniu z pacjentami bez wyraźnego komponentu oskrzelowego.39,40 Obecne metody leczenia POChP mają charakter paliatywny i nie zatrzymują postępu choroby,41 nie ma natomiast specyficznego leczenia hipersekrecji śluzu.42 Wobec braku skutecznej terapii jakiegokolwiek aspektu patofizjologii POChP uzasadnione jest opracowanie metod leczenia hipersekrecji śluzu. Zdolność oczyszczania śluzu z płuc, poprzez ruch rzęsek w drogach oddechowych, zależy od jego lepkości i elastyczności. Właściwości te zależą od proporcji wagowej glikoprotein mucynowych zawartych w śluzie.43 MUC5AC i MUC5B są głównymi mucynami zarówno w prawidłowej, jak i patologicznej wydzielinie dróg oddechowych u ludzi.44 U chorych na POChP stężenie mucyn MUC5AC i MUC5B jest zwiększone w śluzie oddechowym, chociaż proporcjonalnie więcej wydzielane jest MUC5B.45 Mucyny są wydzielane do dróg oddechowych przez komórki ząbkowane w nabłonku i gruczoły surowicze w błonie podśluzowej.43 Jedną z możliwości hamowania wydzielania śluzu jest wykorzystanie hamującego działania endopeptydaz neurotoksyny klostridialnej na fuzję pęcherzyków, ukierunkowanego na komórki wydzielające mucyny w drogach oddechowych przy użyciu odpowiedniego ligandu celującego.

Aby zbadać, czy odpowiednio ukierunkowana endopeptydaza klostridialna rozszczepiałaby białka SNARE w ludzkich komórkach nabłonka dróg oddechowych, a tym samym hamowała wydzielanie śluzu, wytworzono białko fuzyjne z rekombinowanego genu kodującego domenę LHN BoNT/C i EGF, oznaczone EGF-LHN/C, w celu ukierunkowania na receptory EGF w komórkach wydzielających mucynę.34 EGF został wybrany jako prototypowy ligand do stworzenia takiego białka fuzyjnego, ponieważ receptory EGF są obecne na ludzkich komórkach nabłonka dróg oddechowych46,47 i są wyregulowane w nabłonku dróg oddechowych pacjentów z astmą i POChP,48 jak również palaczy.49 Rekombinowane białko fuzyjne EGF-LHN/C rozszczepia odpowiednie białko SNARE syntaksynę w ludzkiej linii komórkowej przerzutów śluzówkowo-śródbłonkowych, komórkach H292, in vitro w sposób zależny od stężenia.34 Wstępne traktowanie komórek H292 za pomocą EGF-LHN/C hamuje stymulowane uwalnianie mucyny w odpowiedzi na połączony bodziec EGF i czynnika martwicy nowotworów-α (TNFα) w sposób zależny od stężenia, z IC50 wynoszącym około 0,4 nM (ryc. 28-1). Porównuje się to bardzo dobrze z wcześniej opisanym hamującym wpływem EGF-LHN/C na stymulowane uwalnianie mucyny z innej linii komórek nabłonka oddechowego, ludzkiej linii komórek pęcherzykowych typu II A549, w odpowiedzi na ten sam bodziec.34 W obu typach komórek nie było wykrywalnego wpływu EGF-LHN/C na podstawowy poziom wydzielania mucyny. Hamowanie wydzielania mucyny przez EGF-LHN/C wynika z ukierunkowanego przekazywania aktywności endopeptydazy przez receptor EGF i nie jest wynikiem cytotoksyczności komórek, antagonizmu receptora lub jego redukcji.34 EGF-LHN/C jest również w stanie hamować stymulowane uwalnianie mucyny z komórek A549 w odpowiedzi na stymulujący koktajl cytokin, kombinację 1 ng/mL interferonu (IFN)-γ, TNFα i interleukiny (IL)-1β, zwaną cytomix (ryc. 28-2). Tak więc, wpływ EGF-LHN/C na stymulowane uwalnianie mucyny z komórek nabłonka oddechowego jest niezależny od dokładnej natury zastosowanego bodźca. Badanie histologiczne wykazuje, że mucyna jest zatrzymywana wewnątrz komórek poddanych działaniu substancji (ryc. 28-3). Komórki kontrolne zawierają wybarwioną mucynę wewnątrzkomórkową, podczas gdy komórki stymulowane wykazują znacznie zmniejszone wybarwienie, wskazujące na wydzielanie mucyny. Stymulowane komórki poddane działaniu EGF-LHN/C wykazują zachowane wewnątrzkomórkowe barwienie, wskazujące na hamowanie wydzielania przez EGF-LHN/C. Aby ocenić odpowiedź komórek na takie wewnątrzkomórkowe zatrzymanie mucyny, zmierzono wpływ wstępnego traktowania EGF-LHN/C na poziom mRNA MUC5AC jako wskaźnik syntezy mucyny. Wstępne traktowanie EGF-LHN/C wiąże się z zależnym od stężenia hamowaniem indukowanej przez EGF-TNFα ekspresji MUC5AC mRNA, z wartością IC50 wynoszącą ∼0,1 nM (ryc. 28-4). Podobnie jak w przypadku hamowania stymulowanego uwalniania mucyny z komórek, ten efekt EGF-LHN/C wynika z ukierunkowanego przekazywania jego aktywności endopeptydazowej przez receptor EGF, ponieważ ani LHN/C pozbawiony liganda EGF w celu skierowania go do receptora EGF, ani zmutowana postać białka fuzyjnego, w którym domena endopeptydazowa została unieczynniona przez zmianę trzech reszt w regionie katalitycznym (EGF-TE-LHN/C), nie hamują ekspresji mRNA MUC5AC. Ten wpływ EGF-LHN/C na ekspresję mRNA MUC5AC sugeruje istnienie możliwego mechanizmu ujemnego sprzężenia zwrotnego między uwalnianiem mucyny a syntezą mucyny w komórkach nabłonka oddechowego, a także, że ekspresja genu ulega zmniejszeniu w odpowiedzi na hamowanie wydzielania przez rekombinowaną endopeptydazę klostridialną.

Rekombinowane białka fuzyjne endopeptydaz klostridialnych, które mogą hamować wydzielanie śluzu, jak na przykładzie EGF-LHN/C, mają potencjał rozwoju jako białka terapeutyczne do leczenia POChP, przewlekłego zapalenia oskrzeli, mukowiscydozy i innych przewlekłych schorzeń układu oddechowego obejmujących nadmierne wytwarzanie śluzu w drogach oddechowych. Długotrwała aktywność białka oznaczałaby, że produkt wymagałby jedynie rzadkich inhalacji, co czyni go dobrze dostosowanym do leczenia przewlekłych chorób układu oddechowego tego typu.

.