Konstrukcja plazmidu

Każda chimeryczna anty-HA scFv testowana w tym badaniu została skonstruowana przez zaszczepienie sześciu pętli CDR przeciwciała anty-HA 12CA5 na każdym wybranym rusztowaniu scFv. Plazmid został skonstruowany w dwóch etapach: (1) gblok scFv szczepiony pętlą CDR i wektor 15F11 H4K20me1 mintbody38 linearyzowany przez miejsca restrykcyjne EcoRI ligowano przez Gibson assembly (House prepared master mix); (2) linker łączący scFv i EGFP, jak również EGFP, zastąpiono gblockiem kodującym elastyczny (G4S) × 5 linker i mEGFP przez Gibson assembly przez miejsca restrykcyjne NotI. Dla pozostałych czterech chimerycznych plazmidów scFv, każdy gblok scFv szczepiony pętlą CDR był ligowany do wektora \(\chi _{15{mathrm{{F}}}11}^{mathrm{{HA}}}}\) linearyzowanego przez miejsca restrykcyjne EcoRI poprzez montaż Gibsona.

Plazmid docelowy 1 × HA-mCh-H2B został skonstruowany przez zastąpienie sfGFP z plazmidu Addgene sfGFP-H2B (plazmid # 56367) znaczonym epitopem 1 × HA gblockiem mCherry, w którym miejsce restrykcyjne NotI zostało wstawione między epitop 1 × HA i mCherry do następującego klonowania. 4 × HA-mCh-H2B został skonstruowany poprzez zastąpienie znacznika 1 × HA konstrukcji 1 × HA-mCh-H2B gblockiem z epitopem 4 × HA poprzez miejsca restrykcyjne AgeI i NotI. 10 × HA-mCh-H2B (smHA-mCh-H2B) został skonstruowany przez zastąpienie znacznika 1 × HA konstrukcji 1 × HA-mCh-H2B znacznikiem smHA amplifikowanym z plazmidu Addgene smHA-KDM5B-MS2 (plazmid # 81085) przy użyciu primerów NZ-098 i 099 (wszystkie sekwencje primerów są przedstawione w tabeli uzupełniającej 1). SmHA-H2B został skonstruowany przez zastąpienie 1 × HA-mCh konstrukcji 1 × HA-mCh-H2B amplikonem smHA z plazmidu smHA-KDM5B-MS2 przy użyciu primerów NZ-098 i 100.

Inny docelowy plazmid 4 × HA-mCh-β-aktyna został skonstruowany przez zastąpienie H2B konstrukcji 4 × HA-mCh-H2B amplikonem β-aktyny przez miejsca restrykcyjne BglII i BamHI. Amplikon β-aktyny został amplifikowany z plazmidu Addgene smFlag-ActinB-MS2 (plazmid # 81083) przy użyciu primerów NZ-073 i NZ-074.

Plazmid 4 × HA-mRuby-Kv2.1 został wygenerowany przez pierwszą amplifikację znacznika 4 × HA z 4 × HA-mCh-H2B przy użyciu primerów NZ-105 i 106. Następnie amplikon 4 × HA został wprowadzony do opublikowanego plazmidu pCMV-mRuby2-Kv2.161 (dar od dr Michaela Tamkuna), który został zlinearyzowany przez trawienie restrykcyjne AgeI, przy użyciu montażu Gibsona. Plazmid smHA-Kv2.1 został wytworzony przez amplifikację PCR sekwencji kodującej szczurzej Kv2.1 z pBK-Kv2.140, a następnie ligację do miejsc restrykcyjnych AsiSI i PmeI na plazmidzie smHA-KDM5B-MS2 przy użyciu primerów Kv2.1-1 i 2.

Plazmid H2B-mCh-1 × HA został skonstruowany w dwóch krokach: (1) zastąpienie znacznika 1 × HA w 1 × HA-mCh-H2B znacznikiem H2B przez miejsca AgeI i NotI, w którym H2B amplifikowano z 1 × HA-mCh-H2B przy użyciu starterów NZ-092 i 093; (2) zastąpienie H2B na C-końcu mCherry znacznikiem 1 × HA przez miejsca BglII i BamHI, w którym znacznik 1 × HA zsyntetyzowano przez nakładające się PCR przy użyciu starterów NZ-094 i 095. Mito-mCh-1 × HA został skonstruowany przez zastąpienie H2B w H2B-mCh-1 × HA przez Mito gblock23 w miejscach AgeI i NotI. Mito-mCh-smHA skonstruowano przez zastąpienie znacznika 1 × HA w Mito-mCh-1 × HA znacznikiem smHA amplifikowanym z smHA-KDM5B-MS2 przy użyciu primerów NZ-096 i 097. mCh-H2B został wygenerowany przez zastąpienie sfGFP z plazmidu sfGFP-H2B gblockiem mCherry przy użyciu montażu Gibsona.

Plazmidy FB-mCh, FB-Halo, FB-SNAP zostały zbudowane przez zastąpienie mEGFP z plazmidu \(\chi _{15{\mathrm{{F}}}11}^{\mathrm{{HA}}}}\) odpowiednio blokami gbloków mCherry, HaloTag i SNAP-tag.

pET23b-FB-GFP, plazmid do ekspresji i oczyszczania rekombinowanego frankenbody, został utworzony przez Gibsona z amplikonu FB-GFP i opublikowanego plazmidu pET23b-Sso7d62,63 zlinearyzowanego przez miejsca restrykcyjne NdeI i NotI. Amplikon FB-GFP został amplifikowany z \(\chi _{15{mathrm{{F}}}11}^{{mathrm{{HA}}}}\) przez PCR ze starterami NZ-075 i 077.

Do testów translacyjnych, konstrukt reporterowy smHA-KDM5B-MS2 i SunTag-kif18b uzyskano z Addgene (plazmid # 81085 i # 74928), a plazmid SunTag scFv (plazmid # 60907) zmodyfikowano przez usunięcie epitopu HA zakodowanego w linkerze. Epitop HA został usunięty przez mutagenezę ukierunkowaną na miejsce za pomocą QuikChange Lightning (Agilent Technologies) zgodnie z instrukcją producenta przy użyciu starterów HAout-1 i 2.

Bloki g zostały zsyntetyzowane przez Integrated DNA Technologies, a plazmidy rekombinowane zostały zweryfikowane pod względem sekwencji przez Quintara Biosciences. Sekwencje starterów przedstawiono w Tabeli Dodatkowej 1. Wszystkie plazmidy użyte do translacji obrazowej przygotowano za pomocą zestawu NucleoBond Xtra Midi EF (Macherey-Nagel) o końcowym stężeniu około 1 mg mL-1.

Hodowla komórek U2OS

Komórki U2OS (ATCC HTB-96) hodowano w inkubatorze w temperaturze 37 °C, nawilżanym, z 5% CO2 w podłożu DMEM (Thermo Scientific) uzupełnionym 10% (v/v) płodową surowicą bydlęcą (Altas Biologicals), 1 mM l-glutaminą (Gibco) i 1% (v/v) penicyliną-streptomycyną (Gibco lub Invitrogen).

Transfekcja i ładowanie kulek

Do śledzenia lokalizacji białka, komórki zostały wyplantowane do 35 mm komory MatTek (MatTek) 2 dni przed obrazowaniem i zostały transfekowane przejściowo za pomocą odczynnika LipofectamineTM LTX z odczynnikiem PLUS (Invitrogen) zgodnie z instrukcją producenta 18-24 h przed obrazowaniem.

Do obrazowania translokacji za pomocą mRNA znakowanego białkiem MCP-Halo, komórki umieszczono w 35 mm komorze MatTek (MatTek) dzień przed obrazowaniem. W dniu obrazowania, przed załadowaniem kulek, pożywkę w komorze MatTek zmieniono na Opti-MEM (Thermo Scientific) z 10% płodową surowicą bydlęcą. Mieszaninę plazmidów (smHA-KDM5B-MS2/FB) i oczyszczone białko MCP-HaloTag17 załadowano kulkami zgodnie z wcześniejszym opisem6,17,26. W skrócie, po usunięciu Opti-medium z komory MatTek, 4 µL mieszaniny plazmidów (1 µg każdy) i MCP-HaloTag (130 ng) w PBS było pipetowane na wierzch komórek i ~106 µm szklane kulki (Sigma Aldrich) były równomiernie rozprowadzane na wierzchu. Następnie siedmiokrotnie mocno stuknięto w komorę i ponownie dodano Opti-medium do komórek. 3 h po załadowaniu kulek, komórki były barwione w 1 mL 0.2 nM ligandu JF646-HaloTag48 rozcieńczonego w pozbawionej fenolu czerwieni kompletnej DMEM. Po 20-minutowej inkubacji komórki przepłukano trzykrotnie w pozbawionym fenolu i czerwieni kompletnym DMEM, aby usunąć szklane kulki i niezwiązane barwniki. Następnie komórki były gotowe do obrazowania.

Do obrazowania translokacji bez znakowania mRNA, komórki umieszczone na komorze MatTek były transfekowane transientowo potrzebnymi plazmidami, smHA-KDM5B-MS2/FB z lub bez SunTag-kif18b/Sun (z usuniętym epitopem HA), przy użyciu odczynnika LipofectamineTM LTX z odczynnikiem PLUS (Invitrogen) zgodnie z instrukcją producenta w dniu obrazowania. 3 h po transfekcji pożywkę zmieniano na wolną od fenolu czerwonego kompletną DMEM. Komórki były wtedy gotowe do obrazowania.

Wyczyszczanie FB-GFP

Komórki E. coli BL21 (DE3) pLysS transformowane pET23b-FB-GFP hodowano w temperaturze 37 °C do gęstości OD600 0,6 w podłożu 2xYT zawierającym ampicylinę (100 mg L-1) i chloramfenikol (25 mg L-1) z wytrząsaniem. Dodawano izopropylo-β-d-tiogalaktozyd (IPTG) w celu indukcji ekspresji białka w końcowym stężeniu 0,4 mM, a temperaturę obniżano do 18 °C. Komórki zbierano po 16 h przez odwirowanie i ponownie zawieszano w buforze PBS uzupełnionym 300 mM NaCl, inhibitorami proteaz (ThermoFisher), 0,2 mM AEBSF (20 mL L-1 hodowli) i lizowano przez sonikację. Lizat klarowano przez odwirowanie. Supernatant załadowano na dwie połączone kolumny HisTrap HP 5 mL (GE Healthcare), przemyto i eluowano liniowym gradientem 0-500 mM imidazolu. Frakcje zawierające POI łączono, zatężano przy użyciu filtra wirówkowego Amicon Ultra-15 30 kDa MWCO (EMD Millipore) i ładowano na kolumnę HiLoad Superdex 200 PG (GE healthcare) w buforze opartym na HEPES (25 mM HEPES pH 7,9, 12,5 mM MgCl2, 100 mM KCl, 0,1 mM EDTA, 0,01% NP40, 10% glicerolu i 1 mM DTT). Frakcje zawierające białko FB-GFP zbierano, zatężano i przechowywano w temperaturze -80 °C po zamrożeniu za pomocą ciekłego azotu.

Immunostaining

Komórki U2OS transfekowano przejściowo 4 × HA-mCh-H2B lub 4 × HA-mCh-β-aktyna za pomocą odczynnika LipofectamineTM LTX z odczynnikiem PLUS (Invitrogen). 26 h po transfekcji komórki utrwalano 4% paraformaldehydem (Electron Microscopy Sciences) przez 10 min w temperaturze pokojowej, permeabilizowano w 1% Tritonie 100 w PBS, pH 7,4 przez 20 min, blokowano w Blocking One-P (Nacalai Tesque) przez 20 min i barwiono w temperaturze 4 °C przez noc oczyszczonym białkiem FB-GFP (0,5 µg mL-1 w 10% buforze blokującym). Następnego dnia rano komórki przemywano PBS, a POI obrazowano za pomocą mikroskopu konfokalnego Olympus IX81 z wirującym dyskiem (głowica CSU22) przy użyciu obiektywu olejowego ×100 (NA 1,40) w następujących warunkach: 488 nm (0,77 mW; mierzone na tylnej płaszczyźnie ogniskowej obiektywu; tutaj wszystkie pomiary mocy lasera odpowiadają tylnej płaszczyźnie ogniskowej obiektywu) i 561 nm (0,42 mW) obrazowanie sekwencyjne dla 50 punktów czasowych bez opóźnienia, szybkość wirowania 2 × 2, czas ekspozycji 100 ms. Obrazy uzyskano za pomocą kamery CCD Photometrics Cascade II przy użyciu oprogramowania SlideBook (Intelligent Imaging Innovations). Obrazy barwienia immunologicznego zostały wygenerowane przez uśrednienie 50 obrazów punktów czasowych dla każdego kanału przez Fiji64.

Western blots

Komórki U2OS zostały transfekowane przejściowo 4 × HA-mCh-H2B lub 4 × HA-mCh-β-aktyna za pomocą odczynnika LipofectamineTM LTX z odczynnikiem PLUS. 10 h po transfekcji, komórki zbierano i lizowano w 120 µL buforu RIPA z inhibitorem proteazy cOmplete (Roche). 6,5 µL każdego lizatu komórek ładowano na żel proteinowy NuPAGETM 4-12% Bis-Tris (Invitrogen) i prowadzono przez 60 min przy napięciu 100 V i 25 min przy napięciu 200 V. Białka przenoszono na membranę PVDF (Invitrogen), blokowano w buforze blokującym (5% mleko w proszku w 0,05% TBS-Tween 20) przez 1 h i barwiono przez noc albo oczyszczonym białkiem FB-GFP (0,5 µg mL-1 w buforze blokującym) albo macierzystym przeciwciałem anty-HA 12CA5 (Sigma-Aldrich Cat #11583816001; 2000-krotne rozcieńczenie z końcowym stężeniem 0,5 µg mL-1 w buforze blokującym). Dla przeciwciała pierwotnego 12CA5 przeprowadzono dodatkową inkubację przez 1 h z przeciwciałem anty-mysim/Alexa488 (Thermo Fisher Cat #A11001; 5000-krotne rozcieńczenie w buforze blokującym). POI wykrywano na podstawie fluorescencji GFP dla FB-GFP lub Alexa 488 dla przeciwciała anty-HA za pomocą Typhoon FLA 9500 (GE Healthcare Life Sciences) w następujących warunkach: długość fali wzbudzenia 473 nm, filtr LPB (≥510 nm), lampa fotopowielacza 300 V i rozmiar piksela 10 µm. Nieprzycięte i nieprzetworzone wydruki western blots przedstawiono na rycinie 3.

Odzyskiwanie fluorescencji po fotobieleniu

Aby zbadać powinowactwo wiązania FB do epitopów HA w żywych komórkach, przeprowadzono eksperymenty FRAP na komórkach transfekowanych przejściowo 4 × HA-mCh-H2B (1,25 µg) i FB-GFP (1,25 µg) 24 h przed FRAP. Obrazy uzyskano za pomocą mikroskopu konfokalnego Olympus IX81 z wirującym dyskiem (głowica CSU22) sprzężonego z urządzeniem do fotomanipulacji Phasor (Intelligent Imaging Innovations) z obiektywem olejowym ×100 (NA 1,40). Przed fotobieleniem pozyskiwano 20 lub 10 klatek z odstępem czasowym 1 lub 5 s. Obrazy rejestrowano przy użyciu lasera 488 nm (0,77 mW) z czasem ekspozycji 100 ms, a następnie lasera 561 nm (0,42 mW) z czasem ekspozycji 15 ms. Wirująca tarcza została ustawiona na szybkość wirowania 1 × 1. Po uzyskaniu obrazów pre-FRAP, laser p488 nm (z jednostki Phasor do fotobielenia) o mocy 17 mW z czasem ekspozycji 100 ms lub 4 mW z czasem ekspozycji 500 ms był używany do fotobielenia okrągłego obszaru w jądrze. Po fotobieleniu rejestrowano 30 obrazów bez opóźnienia lub z opóźnieniem 500 ms, a następnie 100 obrazów z opóźnieniem 1 s i 100 obrazów z opóźnieniem 5 s, przy takich samych ustawieniach obrazowania jak obrazy przed FRAP. Intensywność fluorescencji w czasie fotobielenia plamki została wyeksportowana przy użyciu oprogramowania Slidebook. Intensywność fluorescencji jądra i tła uzyskano za pomocą Fiji64 po skorygowaniu o ruch komórek za pomocą pluginu StackReg Fiji65. Krzywą FRAP i połowę uzyskano przy użyciu easyFRAP-web66, zgodnie z instrukcjami na stronie internetowej. Rysunek 4b, d wygenerowano za pomocą programu Mathematica (Wolfram Research).

Oczyszczanie MCP

MCP-HaloTag oczyszczono za pomocą chromatografii powinowactwa do immobilizowanych metali17. W skrócie, MCP-HaloTag znakowany Hisem oczyszczano przez kolumnę z Ni-NTA-agarozą (Qiagen) zgodnie z instrukcjami producenta, z niewielkimi modyfikacjami. E. coli wyrażająca zainteresowane białko była lizowana w buforze PBS z kompletem inhibitorów proteaz (Roche) i 10 mM imidazolu. Żywicę przemywano buforem na bazie PBS zawierającym 20 i 50 mM imidazolu. Następnie białko eluowano w buforze PBS z 300 mM imidazolu. Eluowany His-tagowany MCP był dializowany w buforze opartym na HEPES (10% glicerol, 25 mM HEPES pH 7,9, 12,5 mM MgCl2, 100 mM KCl, 0,1 mM EDTA, 0,01% detergent NP-40 i 1 mM DTT), zamrażany w ciekłym azocie, a następnie przechowywany w temperaturze -80 °C.

Przygotowanie komórek do śledzenia powstających łańcuchów

Plazmid reporterowy smHA-KDM5B-MS2 (plazmid Addgene #81085) i konstrukt FB były albo transfekowane transientowo bez białka MCP-HaloTag, albo obciążane koralikami z białkiem MCP-HaloTag do komórek U2OS umieszczonych na 35 mm komorach MatTek 4-6 h przed obrazowaniem. 3 h później, jeśli białko MCP-HaloTag zostało załadowane do paciorków, komórki barwiono ligandem JF646-HaloTag, a następnie przemywano kompletnym medium DMEM bez czerwieni fenolowej. Jeśli białko MCP-HaloTag nie było potrzebne, pożywka komórek została zmieniona na wolne od fenolu czerwonego kompletne medium DMEM 3 h po transfekcji. Komórki były wtedy gotowe do obrazowania.

Do obrazowania multipleksowego dwa plazmidy reporterowe, smHA-KDM5B-MS2 i SunTag-kif18b, a także dwie sondy, FB-mCh i Sun-GFP (z usuniętym epitopem HA), zostały transfekowane transientowo do komórek U2OS umieszczonych na komorze MatTek 4-6 h przed obrazowaniem. 3 h później, pożywkę dla komórek zmieniono na wolną od fenolu czerwonego kompletną pożywkę DMEM. Komórki były wtedy gotowe do obrazowania.

Warunki obrazowania dla translacji i badań kolokalizacyjnych

Do obrazowania pojedynczych mRNA i ich statusu translacji za pomocą FB użyto zbudowanego na zamówienie szerokopolowego mikroskopu fluorescencyjnego opartego na schemacie nachylonego oświetlenia (HILO)17,67. Krótko mówiąc, wiązki wzbudzające, lasery półprzewodnikowe 488, 561, 637 nm (Vortran), zostały sprzężone i skupione poza osią na tylnej płaszczyźnie ogniskowej obiektywu (APON 60XOTIRF, Olympus). Wszystkie podawane moce lasera były mierzone w płaszczyźnie ogniskowej tylnej części obiektywu. Sygnały emisyjne były rozdzielane przez ultrapłaskie lustro dichroiczne klasy obrazowej (T660lpxr, Chroma). Dłuższe sygnały emisyjne (daleka czerwień) po rozszczepieniu były przepuszczane przez filtr pasmowy (FF01-731/137-25, Semrock). Krótsze sygnały emisyjne (czerwony i zielony) po rozszczepieniu były przepuszczane przez filtr pasmowy dla czerwieni (FF01-593/46-25, Semrock) lub filtr pasmowy dla zieleni (FF01-510/42-25, Semrock) zainstalowany w kole filtracyjnym (HS-625 HSFW TTL, Finger Lakes Instrumentation). Dłuższe (dalekoczerwone) i krótsze (czerwone i zielone) sygnały emisyjne były wykrywane przez oddzielne dwie kamery EM-CCD (iXon Ultra 888, Andor) poprzez ogniskowanie za pomocą achromatycznego obiektywu dubletowego 300 mm (AC254-300-A-ML, Thorlabs). Połączenie obiektywu ×60 firmy Olympus, obiektywu rurowego 300 mm i iXon Ultra 888 daje obrazy ×100 z 130 nm pixel-1. Inkubator górny ze stolikiem dla temperatury (37 °C), wilgotności i 5% CO2 (Okolab) jest wyposażony w piezoelektryczny stolik (PZU-2150, Applied Scientific Instrumentation) do obrazowania żywych komórek. Lasery, kamery, piezoelektryczny stopień i koło filtrujące były synchronizowane przez mikrokontroler open source, płytkę Arduino Mega (Arduino). Akwizycja obrazu była wykonywana przy użyciu otwartego oprogramowania Micro-Manager (1.4.22)68.

Rozmiar obrazowania był ustawiony na środek 512 × 512 pikseli2 (66,6 × 66,6 µm2), a czas integracji kamery był ustawiony na 53,64 ms. Czas odczytu kamer wynikający z połączenia naszego rozmiaru obrazowania, trybu odczytu (30 MHz) i prędkości przesunięcia pionowego (1,13 µs) wynosił 23,36 ms, co dało nam częstotliwość obrazowania 13 Hz (70 ms na obraz). Sygnały czerwone i zielone były obrazowane naprzemiennie. Pozycja filtra emisyjnego była zmieniana w czasie odczytu z kamery. W celu zminimalizowania efektu „bleed-through”, sygnał dalekoczerwony był obrazowany jednocześnie z sygnałem zielonym. Aby uchwycić całą grubość komórek, przy użyciu stolika piezoelektrycznego wykonano 13 obrazów z krokiem 500 nm (w sumie 6 µm). Dzięki temu nasza całkowita szybkość obrazowania komórek wynosiła 1 Hz w przypadku obrazowania albo sygnałów czerwonych, albo zielonych, oraz 0,5 Hz w przypadku obrazowania zarówno sygnałów czerwonych, jak i zielonych niezależnie od obrazowania dalekiej czerwieni.

Na rycinach 1c, d, 2a, e pojedyncza płaszczyzna komórek była obrazowana w sposób ciągły z częstotliwością 6,5 Hz przez 100 punktów czasowych i uśredniana przez cały czas (lasery: 488 nm, 130 µW; 561 nm, 4 µW (ryc. 1c), 90 µW (ryc. 1d), 19 µW (ryc. 2a), 155 µW (ryc. 2e); 637 nm, 220 µW). Dla Rys. 2b (po lewej) komórka była obrazowana w sposób ciągły z częstotliwością 0,5 Hz, laserami 488 nm (100 µW) i 561 nm (10 µW) z 13 z-stackami w każdym punkcie czasowym i uśrednionymi w czasie. Uzyskane uśrednione 13 z-stacków zostało zdekonwolwencjonowane przy użyciu Fiji. Dla Rys. 6b, c, e i f, komórki były obrazowane co 10 s z 13 z-stackami na punkt czasowy (lasery: 488 nm, 13 µW (ryc. 6b), 18 µW (ryc. 6c); 561 nm, 172 µW (ryc. 6f); 637 nm, 150 µW (ryc. 6b, c), 35 µW (ryc. 6e)). Dla Rys. 7b, komórka była obrazowana w sposób ciągły z częstotliwością 0.5 Hz z 13 z-stackami w każdym punkcie czasowym (lasery: 488 nm, 130 µW; 561 nm, 172 µW). Na Rys. 8b, komórki były obrazowane co 14 s z 13 z-stackami w każdym punkcie czasowym (laser: 488 nm, 70 µW). Na Rys. 8c komórki były obrazowane co 40 s z 13 z-stackami w każdym punkcie czasowym (laser: 488 nm, 130 µW). W celu określenia prędkości ruchliwych plamek translacyjnych (ryc. 8e), neurony obrazowano w sposób ciągły z częstotliwością 1 Hz z 13 z-stackami w każdym punkcie czasowym.

Dla ryc. 2b (po prawej) i 2c, kolokalizację obrazowano za pomocą opisanego wcześniej mikroskopu konfokalnego Olympus IX81 z wirującym dyskiem (głowica CSU22) przy użyciu obiektywu ×100 oil immersion (NA 1,40) w następujących warunkach: 488 nm (0,77 mW) i 561 nm (0,42 mW) obrazowanie sekwencyjne dla pięciu punktów czasowych bez opóźnienia z wieloma plasterkami z, aby pokryć całe ciało komórki dla każdego punktu czasowego, szybkość wirowania 1 × 1, czas ekspozycji dostosowany do jasności komórki. Obrazy zostały uzyskane za pomocą kamery CCD Photometrics Cascade II przy użyciu oprogramowania SlideBook (Intelligent Imaging Innovations). Wyświetlane obrazy na rycinach zostały wygenerowane przez uśrednienie pięciu punktów czasowych, a następnie maksymalna projekcja wszystkich plasterków z została wykonana przez Fiji64.

Śledzenie cząstek w miejscach translacji

Samodzielne wykrywanie i śledzenie miejsc translacji zostało wykonane na obrazach projekcji maksymalnej intensywności za pomocą niestandardowego kodu Mathematica (Wolfram Research)17. W skrócie, obrazy były przetwarzane z filtrem pasmowym w celu wyróżnienia cząstek, a następnie binaryzowane w celu wykrycia ich centroidów intensywności jako pozycji przy użyciu wbudowanej procedury Mathematica ComponentMeasurements. Wykryte cząstki były śledzone i łączone w czasie poprzez wyszukiwanie najbliższych sąsiadów. Dokładne współrzędne (superrozdzielcze lokalizacje) mRNA i miejsc translacji zostały wyznaczone przez dopasowanie (za pomocą wbudowanej w program Mathematica procedury NonlinearModelFit) oryginalnych obrazów do dwuwymiarowych Gaussianów o następującej postaci:

gdzie IBG to fluorescencja tła, I intensywność cząstki, (x0, y0) położenie cząstki, a (σx, σy) rozrzut cząstki. Przesunięcie między dwoma kamerami zostało zarejestrowane przy użyciu wbudowanej w Mathematica procedury FindGeometricTransform w celu znalezienia funkcji transformaty, która najlepiej wyrównała dopasowane pozycje kulek Tetraspeck o średnicy 100 nm równomiernie rozłożonych w polu widzenia obrazu.

Dla Fig. 6c, e, f, 7c, 8b, d, cząstki były śledzone przez niestandardowy kod Mathematica i dalej wykreślane przy użyciu Mathematica. Dla Rys. 7c, średnie średniokwadratowe przemieszczenia zostały obliczone z dopasowanych gaussowsko współrzędnych (z dwuwymiarowych obrazów projekcji maksymalnej intensywności). Stała dyfuzji została uzyskana przez dopasowanie pierwszych pięciu punktów czasowych do linii o nachyleniu m = 4D, gdzie D jest współczynnikiem dyfuzji. Pojedyncze zmotoryzowane plamki translacyjne (ryc. 8e) były śledzone przez wtyczkę Fiji TrackMate69 po max-projekcji i dalej wykreślane za pomocą Mathematica. Cały kod Mathematica jest dostępny na życzenie.

Śledzenie pojedynczych cząsteczek białek znakowanych 1×HA w komórkach

Dzień przed obrazowaniem, komórki umieszczono na komorze MatTek i transfekowano transientowo 1 × HA-mCh-H2B i FB-Halo przy użyciu odczynnika LipofectamineTM LTX z odczynnikiem PLUS (Invitrogen) zgodnie z instrukcją producenta. 3 h po transfekcji pożywkę zmieniano na pełną DMEM. Przed obrazowaniem komórki wybarwiano za pomocą wodorotlenku sodu (NaBH4) traktowanego Halo ligandem TMR (Promega)45. W skrócie, 1 µL 1 mM barwnika Halo ligand TMR redukowano przez 10 min w 200 µL 50 mM roztworu NaBH4 (wstępnie rozpuszczonego w PBS przez 10 min, pH 7,4). Następnie 200 µL zredukowanego TMR rozcieńczano 800 µL DMEM wolnego od fenolu i otrzymywano 1 mL pożywki z zredukowanym TMR. Pożywkę z transfekowanych komórek zastępowano pożywką z zredukowanym TMR, a następnie komórki umieszczano w inkubatorze (5% CO2, 37 °C) na 30 min w celu wybarwienia. Następnie komórki przemywano trzykrotnie DMEM wolnym od fenolu i czerwieni. Pomiędzy płukaniami komórki inkubowano przez 5 min w inkubatorze (5% CO2, 37 °C).

Komórki obrazowano za pomocą zbudowanego na zamówienie mikroskopu fluorescencyjnego o szerokim polu widzenia, opartego na schemacie nachylonego oświetlenia (HILO)17,67. Pole widzenia obrazowania zostało ustawione na 256 × 256 pikseli2 (33,3 × 33,3 µm2), a czas integracji kamery został ustawiony na 30 ms. Komórki obrazowano za pomocą lasera o mocy 7,7 mW 561 nm z szybkością obrazowania 43,8 ms na obraz przez łącznie 10 000 punktów czasowych (7,3 min). Podczas obrazowania, laser o mocy 6,2 mW 405 nm był włączany na 50 ms raz na 10 s w celu fotoaktywacji zredukowanego liganda Halo-TMR. Pojedyncze cząsteczki były śledzone przy użyciu wtyczki Fiji TrackMate69. Aby upewnić się, że ślady reprezentują FB-Halo związany z 1 × HA-mCh-H2B, ślady były dalej filtrowane w programie Mathematica. Filtr wyeliminował ścieżki o długości mniejszej niż 16 klatek. Ponadto, wszystkie skoki między klatkami musiały być mniejsze niż 220 nm. To kryterium zostało użyte przez innych do odróżnienia czynników transkrypcyjnych, które są związane z chromatyną od tych, które są niezwiązane46. Wreszcie, w programie Mathematica, ścieżki były oznaczone kolorami zgodnie z czasem, w którym zostały pozyskane (jak na ryc. 5) lub średnią wielkością przeskoku między klatkami (jak na ryc. 5).

Poddawanie działaniu puromycyny

Komórki U2OS transfekowane przejściowo smHA-KDM5B-MS2 i FB lub obciążone koralikami smHA-KDM5B-MS2, FB i MCP-HaloTag były obrazowane jak wyżej, z 10-sekundowymi odstępami między klatkami. Po uzyskaniu 5 lub 10 punktów czasowych jako obrazów przed leczeniem, komórki poddawano działaniu końcowego stężenia 0,1 mg mL-1 puromycyny tuż przed uzyskaniem 6. lub 11. punktu czasowego. Po dodaniu puromycyny, komórki były obrazowane w tych samych warunkach, jakie zastosowano do obrazowania przed leczeniem, aż do zniknięcia plamek translacyjnych.

Hodowla neuronów i transfekcja

Neurony korowe szczura uzyskiwano z odrzuconych korowych części płodów w dniu embrionalnym (E)18, które wcześniej poddano sekcji w celu uzyskania hipokampa, i zamrażano w podłożu Neurobasal (ThermoFisher Scientific) zawierającym 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS, Atlas Biologicals) i 10% DimethylSulfoxide (Sigma-Aldrich, D8418) w ciekłym azocie. Kriokonserwowane neurony korowe szczurów umieszczano w gęstości ∼ 15 000-30 000 komórek na cm2 na płytkach MatTek (MatTek) i hodowano w podłożu Neurobasal zawierającym 2% dodatek B27 (ThermoFisher Scientific), 2 mM l-alaniny/l-glutaminy i 1% FBS (Atlas Biologicals). Transfekcje przeprowadzono po 5-7 dniach hodowli przy użyciu Lipofectamine 2000 (ThermoFisher Scientific) zgodnie z instrukcjami producenta. Neurony z koekspresją 4 × HA-mRuby-Kv2.1 i FB-GFP obrazowano 1-2 dni po transfekcji (ryc. 2b). Neurony współekspresjonujące smHA-Kv2.1 i FB-GFP były obrazowane 1-7 dni po transfekcji (Supplementary Fig. 2 po lewej). W przypadku testów translacyjnych, neurony były obrazowane 4-12 h po transfekcji. Wszystkie eksperymenty z obrazowaniem neuronów przeprowadzono w kontrolowanej temperaturze (37 °C), w nawilżonym, 5% CO2 środowisku, w pożywce Neurobasal bez czerwieni fenolowej (ThermoFisher Scientific). Tożsamość neuronów została potwierdzona przez śledzenie procesów emanujących z ciała komórki, które miały być obrazowane przez setki mikronów, aby upewnić się, że są to prawdziwe neuryty.

Monitorowanie rozwoju zeberek

Wszystkie eksperymenty z zeberkami zostały zatwierdzone przez Komitet Bezpieczeństwa Eksperymentów Genetycznych Tokyo Tech (I2018001), a postępowanie ze zwierzętami jest prowadzone zgodnie z wytycznymi. W celu wizualizacji FB-GFP w embrionie zebry, przygotowano mRNA dla FB-GFP i N × HA-mCh-H2B. Fragmenty DNA kodujące FB-GFP i N × HA-mCh-H2B wprowadzono do plazmidu zawierającego promotor T7 i poli A70. Kolejne plazmidy (T7-FB-GFP i T7-N × HA-mCh-H2B) linearyzowano z miejscem restrykcyjnym XbaI w celu transkrypcji in vitro przy użyciu zestawu mMESSAGE mMACHINE (ThermoFisher Scientific). RNA zostało oczyszczone przy użyciu RNeasy Mini Elute Cleanup Kit (QIAGEN) i ponownie zawieszone w wodzie. Przed mikroiniekcją jaja ryb zebrafish (AB) były dechorionowane przez moczenie w 2 mg mL-1 pronazie (Sigma Aldrich; P5147) w 0,03% soli morskiej przez 10 min. Mieszaninę (~0,5 nL) zawierającą mRNA (po 200 pg dla FB-GFP i N × HA-mCh-H2B) wstrzykiwano do żółtka (w pobliżu części komórkowej) zarodków w stadium jednokomórkowym. Dla kontroli negatywnej pominięto HA-mCh-H2B mRNA. 5-10 min po wstrzyknięciu mRNA wstrzyknięto znakowany Cy5 Fab specyficzny dla endogennej acetylacji histonu H3 Lys9 (CMA310)25 (100 pg w ~0,5 nL). Wstrzyknięte embriony inkubowano w temperaturze 28 °C do stadium czterokomórkowego i osadzano w 0,5% agarozie (Sigma Aldrich, A0701) w 0,03% soli morskiej, biegunem zwierzęcym w dół na 35-mm szalce ze szklanym dnem (MatTek). Obrazy fluorescencyjne były zbierane przy użyciu mikroskopu konfokalnego (Olympus; FV1000) wyposażonego w podgrzewany stolik (Tokai Hit) ustawiony na 28 °C i silikonowy obiektyw UPLSAPO ×30 (NA 1.05), obsługiwany przez wbudowane oprogramowanie FV1000 FLUOVIEW ver.4.2. Trzy kolorowe obrazy były sekwencyjnie pozyskiwane co 5 min przy użyciu laserów 488, 543 i 633 nm (640 × 640 pikseli; 0,662 µm pixel-1, pinhole 800 μm; 2,0 μs pixel-1) bez uśredniania. Projekcje o maksymalnej intensywności zostały utworzone z 20 z-stacków z 5 μm.

Jądra wewnątrz embrionów zebrafish były śledzone w 4D przy użyciu wtyczki Fiji TrackMate69. Wyniki zostały przetworzone i wykreślone za pomocą programu Mathematica. Aby określić ilościowo liczbę i powierzchnię jąder oraz średnią intensywność jądrową, cytoplazmatyczną i jądrowo:cytoplazmatyczną w czasie, zmierzono intensywność wszystkich jąder w projekcjach o maksymalnej intensywności za pomocą wbudowanej funkcji Mathematica ComponentMeasurements. ComponentMeasurements wymaga binarnych masek obiektów, które mają być mierzone. Binarne maski jąder zostały wykonane przy użyciu wbudowanej funkcji Mathematica Binarize z odpowiednim progiem intensywności, aby wyróżnić tylko jądra w obrazach z Fab znakowanych Cy5 (specyficznych dla endogennej acetylacji histonu H3 Lys9). Maski cytoplazmy wokół każdego jądra zostały wykonane przez rozszerzenie masek jądrowych o 4 piksele (za pomocą wbudowanego polecenia Dilation), a następnie odjęcie od rozszerzonej maski oryginalnych masek jądrowych rozszerzonych o 1 piksel. W ten sposób powstały pierścieniowe maski wokół każdego jądra, z których zmierzono średnią intensywność cytoplazmatyczną.

Powierzchniowy rezonans plazmonowy

Kinetyka wiązania oczyszczonego FB do znacznika epitopowego HA została zmierzona za pomocą powierzchniowego rezonansu plazmonowego (OpenSPR, Nicoyalife). Po wychwyceniu peptydu HA znakowanego biotyną przez chip czujnika Streptavidin (Nicoyalife), rozcieńczony oczyszczony FB-GFP w buforze bieżącym PBS, pH 7,4, był powoli przepuszczany przez chip czujnika przez 5 min, aby umożliwić interakcję. Następnie pozwolono na przepływ buforu przez 10 min w celu zebrania danych dotyczących dysocjacji. Krzywa niespecyficznego wiązania została uzyskana przez przepływ tego samego stężenia FB-GFP w tym samym buforze nad innym chipem sensora Streptavidin (Nicoyalife). Dane z kontroli zostały zebrane dokładnie tak jak w eksperymencie. Dla 100 i 30 nM FB-GFP, odpowiedź wiązania była znacząco wyższa niż w kontroli, z pomijalnie małą interakcją niespecyficznego wiązania. Dlatego wybraliśmy te dwa stężenia do dopasowania kinetyki wiązania. Po odjęciu kontroli uzyskano krzywą zależności odpowiedzi sygnału od czasu, jak pokazano na Suplementarnym Rys. 4. Parametry kinetyki wiązania uzyskano przez dopasowanie krzywej do modelu wiązania jeden do jednego przy użyciu oprogramowania TraceDrawer (Nicoyalife) (ryc. 4).

Podsumowanie

Dalsze informacje na temat projektu badań są dostępne w Nature Research Reporting Summary powiązanym z tym artykułem.