Wprowadzenie: Defining Terms

Wcześniejsze dane dotyczące taksonomii Cannabis zostały wcześniej przejrzane (Russo, 2007), które zostaną tutaj streszczone i uzupełnione. Cannabis to dwupienny jednoroczny gatunek należący do rodziny Cannabaceae, do której tradycyjnie zalicza się chmiel, Humulus spp. Alternatywnie, na podstawie map miejsc restrykcyjnych chloroplastu (Weigreffe i in., 1998) oraz sekwencji chloroplastowego genu mat K (Song i in., 2001), Cannabis przypisano także do rodzin Moraceae, Urticaceae, a nawet Celtidaceae. Ostatnio do Cannabaceae zaliczono osiem rodzajów: Celetis, Pteroceltis, Aphananthe, Chaetachme, Gironniera, Lozanella, Trema i Parasponia, obejmujących 170 nieparzystych gatunków (McPartland, 2018), co zostało poparte analizą genetyczną czterech loci plastydowych (Yang i in., 2013). Obecne badania kopalnych próbek pyłku związane z ekologicznymi związkami Cannabis z towarzyszącymi gatunkami stepowymi (Poaceae, Artemisia, Chenopodiaceae), a Humulus (chmiel) z rodzajami leśnymi (Alnus, Salix, Populus), ustaliły, że chociaż Cannabis wydaje się pochodzić z Płaskowyżu Tybetańskiego co najmniej 19,6 miliona lat temu, był również autochtoniczny w Europie od co najmniej miliona lat (McPartland i in., 2018), i obalił konwencjonalną mądrość, że ten „zwolennik obozu” został przyniesiony tam przez człowieka.

Samo przypisanie gatunkowe Cannabis jest obarczone wielką debatą. Cannabis sativa, co oznacza „uprawiane Cannabis”, został tak nazwany przez Fuchsa, między innymi, w 1542 roku (Fuchs, 1999), przypisanie 211 lat przed systematyzacji botanicznych binomials Linnaeus w jego Species Plantarum (Linnaeus, 1753). Lamarck zasugerował następnie Cannabis indica, bardziej zdrobniałą odurzającą roślinę indyjską z Indii, jako oddzielny gatunek (Lamarck, 1783). Kwestia ta pozostała nierozstrzygnięta w kolejnych stuleciach, z dwoma przeciwstawnymi filozofiami. Ernest Small był orędownikiem koncepcji jednego gatunku (Small i Cronquist, 1976). Poliptypowe traktowanie Cannabis również zyskało zwolenników (Schultes i in., 1974; Anderson, 1980) na podstawie kryteriów morfologicznych sugerujących rozdzielenie Cannabis sativa L. Cannabis indica Lam. i Cannabis ruderalis Jan., schemat wspierany przez systematyczną chemotaksonomię. Analiza składowych głównych (PCA) 157 dostępów Cannabis z całego świata, w której oceniono częstotliwości allozymów w 17 loci genowych, sugeruje podział (Hillig, 2005b). Pule genów „sativa” z próbek ruderalnych z Europy Wschodniej były powiązane z wąskolistnymi europejskimi i środkowoazjatyckimi roślinami włóknistymi i nasiennymi, podczas gdy grupa „indica” obejmowała dalekowschodnie rośliny nasienne i włókniste oraz rośliny narkotyczne o szerokich liściach z większości pozostałych części świata, wraz z dzikimi dostępami z subkontynentu indyjskiego. Uważano, że próbki z Azji Środkowej (Cannabis ruderalis) reprezentują trzecią grupę. Badania chromatografii gazowej (GC) i elektroforezy w żelu skrobiowym również sugerowały rozdzielenie gatunkowe sativa i indica (Hillig i Mahlberg, 2004).

Czynniki agronomiczne w 69 próbkach sugerowały włączenie wschodnich konopi i roślin narkotycznych do Cannabis indica (Hillig, 2005a), podział poparty polimorfizmem długości fragmentów (Datwyler i Weiblen, 2006).

W ostatnim czasie PCA zdawała się wskazywać na zawartość terpenoidów jako najbardziej przekonujące markery rozróżniające chemotaksonomiczne pomiędzy gatunkami putative sativa i indica (Elzinga i in., 2015). Podobnie, PCA była odczuwana do oddzielenia narkotycznych Cannabis od konopi (Sawler et al., 2015). Ostatnie badania wykazały demarkację Cannabis narkotycznych od dostępów konopi poprzez genotypowanie 13 mikrosatelitarnych loci w całym genomie, a nie tylko genów wpływających na produkcję kannabinoidów lub włókien (Dufresnes i in., 2017). Profesor Giovanni Appendino zgłosił obecność stereoizomeru cis-Δ9-THC tylko w dostępach konopi (Giovanni Appendino, komunikacja osobista). Jednak te rozróżnienia mogą zostać pominięte, biorąc pod uwagę obecną tendencję do krzyżowania konopi z odmianami narkotykowymi w celu uniknięcia ograniczeń prawnych dotyczących zawartości THC.

Kontrowersje dotyczące gatunków konopi, Cannabis sativa vs. indica vs. afghanica, trwają nieprzerwanie do dnia dzisiejszego, z beznamiętnymi argumentami wysuwanymi przez protagonistów (Clarke i Merlin, 2013, 2016; Small, 2015; McPartland i Guy, 2017; Small, 2017). Ten autor, będąc po każdej stronie problemu w tym czy innym czasie, zdecydował się uciec od niemożliwej do pogodzenia debaty taksonomicznej jako niepotrzebnego rozproszenia uwagi (Piomelli i Russo, 2016) i raczej podkreślić, że istotne są tylko biochemiczne i farmakologiczne rozróżnienia pomiędzy dostępami Cannabis. W swoim ostatnim przeglądzie McPartland zgodził się, że „kategoryzowanie Cannabis jako 'Sativa’ i 'Indica’ stało się ćwiczeniem bezcelowym. Wszechobecne krzyżowanie i hybrydyzacja sprawiają, że ich rozróżnienie jest bez znaczenia.” (McPartland, 2018) (s. 210).

Dodatkowa nie-sensowna kontrowersja nomenklaturowa odnosi się w potocznym języku do „szczepów” Cannabis, określenia, które jest odpowiednie dla bakterii i wirusów, ale nie roślin (Bailey i Bailey, 1976; Usher, 1996; Brickell i in., 2009), szczególnie tak jest w przypadku Cannabis, gdzie odmiana chemiczna, skrót „chemovar” jest najbardziej odpowiednim określeniem (Lewis i in., 2018).

Genom Cannabis i alternatywna produkcja biochemiczna gospodarza

2011 był przełomowym rokiem dla genomiki Cannabis, ponieważ Medical Genomics i Nimbus Informatics wydały raport online na temat kompletnej sekwencji genomowej 400 milionów par bazowych, do której wkrótce dołączył projekt genomu i transkryptomu (van Bakel i in., 2011).

Ten rozwój wywołał znaczący rozgłos i kontrowersje, co może zapowiadać. Podczas gdy ludzki genom został przeanalizowany około 20 lat wcześniej, implikacje dla Cannabis były przedmiotem wielkich spekulacji.

Wiadomości te stały się katalizatorem gorączki nowych badań, ale znaczny postęp został już osiągnięty w genetyce stosowanej Cannabis. Identyfikacji i syntezy Δ9-tetrahydrokannabinolu (THC) dokonano w Izraelu w 1964 r. (Gaoni i Mechoulam, 1964), ale dopiero znacznie później udało się sklonować enzym biosyntezy, syntazę kwasu tetrahydrokannabinolowego (syntaza THCA) (Sirikantaramas i in., 2004; Rysunek 1). Następnie przeprowadzono krystalizację enzymu (Shoyama i in., 2005). Syntaza kwasu kannabidiolowego, która katalizuje kwas kannabidiolowy (CBDA), prekursor kannabidiolu (CBD), została wcześniej zidentyfikowana i wyprodukowana w czystej postaci (Taura i in., 1996; Rysunek 1). Te wydarzenia pobudziły dodatkowe odkrycia, w tym archeologiczne odkrycie fitochemiczne syntazy THCA w liczącej 2700 lat skrytce konopi z grobowca w Azji Środkowej wraz z dwoma wcześniej niezgłaszanymi polimorfizmami pojedynczego nukleotydu (SNP) w sekwencji genu enzymu (Russo i in., 2008).

Do 2011 roku zidentyfikowano enzymy do produkcji głównych fitokannabinoidów. Podobnie, selektywna zaawansowana hodowla mendlowska dała odmiany Cannabis bogate w konkretne pojedyncze składniki. W ten sposób wyprodukowano rośliny o wysokiej zawartości THC i CBD do celów rozwoju farmaceutycznego (de Meijer i in., 2003; de Meijer, 2004), z analogiczną hodowlą linii o wysokiej zawartości kannabigerolu (CBG) (de Meijer i Hammond, 2005) i kannabichromenu (CBC) (de Meijer i in., 2009a). Selektywna hodowla objęła również analogi propylowych fitokannabinoidów, tetrahydrokannabiwarynę (THCV), kannabidiwarynę (CBDV), kannabigeriwarynę (CBGV) i kannabichromiwarynę (CBCV) (de Meijer, 2004). Dostępność roślin o wysokim mianie tych „pomniejszych kannabinoidów” zapowiada nowe interesujące zastosowania farmaceutyczne (Russo, 2011; Russo i Marcu, 2017).

Dostęp do genomu Cannabis może uprościć produkcję roślin pozbawionych THC za pomocą technologii CRISPR (clustered regularly-interspaced short palindromic repeats). Choć mogłoby to być atrakcyjne dla hodowli konopi przemysłowych, już wcześniejsze pokolenie hodowców roślin dało odmiany konopi, które z łatwością spełniają międzynarodowe restrykcje wymagające zawartości THC na poziomie 0,1% lub mniejszym (Wirtshafter, 1997; McPartland i in., 2000; Small i Marcus, 2003). W rzeczywistości, Cannabis bez kannabinoidów, bez funkcjonalnej syntazy kwasu kannabigerolowego (Rysunek 1) również został wyprodukowany w sposób konwencjonalny (de Meijer i in., 2009b). Nie jest więc jasne, czy inżynieria genetyczna konopi jest w ogóle konieczna w przypadku tej rośliny, której niezwykła plastyczność już wykazuje ogromną różnorodność biochemiczną. Wprowadzenie genetycznie zmodyfikowanych organizmów (GMO) Cannabis wywołałoby znaczne kontrowersje wśród niektórych segmentów populacji i prawdopodobnie sprowokowałoby lawinę prawnych uwikłań dotyczących praw patentowych i hodowlanych.

Można sobie łatwo wyobrazić różne dodatkowe scenariusze science fiction. W latach 90. w Internecie krążyła plotka, że apokryficzny profesor Nanofsky wprowadził geny do produkcji THC do pomarańczy (Citrus x. sinensis (L.) Osbeck). Mimo, że jest to technologicznie osiągalne, taki wysiłek byłby niczym więcej niż laboratoryjnym karnawałem w świetle niesamowitej produkcji kannabinoidów z samych konopi. Bardziej logicznym wyborem dla takich podziemnych, wywrotowych mrzonek może być ukradkowy chemowar mięty pieprzowej (Menthax piperita Lamiaceae), który zawiera nielegalne fitokannabinoidy w gruczołowych włośnikach swoich liści i wysyła kłącza i rozłogi wzdłuż cieków wodnych na całym świecie.

Pierwsze twierdzenia o produkcji kannabidiolu z chmielu (Humulus lupulus L. Cannabaceae) i lnu (Linum usitatissimum L. Linaceae) są nieuzasadnione, ale kwas kannabigerolowy i kannabigerol zostały wykryte w południowoafrykańskim Helichrysum umbraculigerum Less. Asteraceae (Bohlmann i Hoffmann, 1979; Appendino et al., 2015; Russo, 2016; Rysunek 1), ale bez odniesienia do jego stężenia. To twierdzenie zostało ostatnio potwierdzone śladowymi ilościami obserwowanymi z wysuszonych próbek części powietrznych (Mark Lewis, komunikacja osobista).

Ponieważ złożoność czysto de novo biochemicznej syntezy kannabinoidów została uznana za nieopłacalną (Carvalho i in., 2017), zaproponowano alternatywne gospodarze mikrobiologiczne (Zirpel i in., 2017). W 2004 roku udało się sklonować cDNA syntazy THCA, umożliwiającej konwersję kwasu kannabigerolowego (CBGA) do THC (Sirikantaramas i in., 2004), a także wykazano 8% produkcję THCA w korzeniach włochatych tytoniu (Nicotiana tabacum cv.Xanthi Solanaceae) po podaniu CBGA (Rysunek 1). Enzym uległ również ekspresji w owadzie Spodoptera frugiperda (J.E. Smith) Noctuidae (mól jesienny) poprzez rekombinowany bakulowirus. Następnie grupa badawcza zwróciła się w kierunku drożdży Pichia pastoris (obecnie Komagataella phaffii Phaff Saccharomycetaceae) (Taura i in., 2007; Rysunek 1) i osiągnęła konwersję CBGA do THCA na poziomie 98% w ciągu 24 godzin, z wydajnością 32,6 mg/L pożywki. Rekombinowana forma syntazy THCA okazała się 4,5-krotnie wydajniejsza niż u Cannabis i 12-krotnie wydajniejsza niż u S. frugiperda. Proces ten został następnie zoptymalizowany z 64,5-krotną poprawą aktywności (Zirpel et al., 2018), z odnotowaną produkcją w K. phaffii 3,05 g/L THCA po 8 h inkubacji w 37°C. Prosta kalkulacja zapewnia, że taka wydajność mogłaby być również osiągnięta z ekstrakcji zaledwie 15 g 20% THCA ziołowego Cannabis.

Produkcja terpenoidów konopi jest podobnie możliwa w alternatywnych gospodarzach. Mutanty Saccharomyces cerevisiae Meyen ex E.C. Hansen Saccharomycetaceae z niedoborem enzymu syntazy difosforanu farnezylu gromadzą zamiast niego pirofosforan geranylu, który jest kierowany do produkcji medycznie użytecznego terpenoidu, linalolu (Oswald et al., 2007; Rysunek 1). Podobnie, inni badacze wykorzystali biosyntetyczne możliwości mitochondriów w S. cerevisiae do zwiększenia produkcji seskwiterpenoidów z difosforanu farnezylu (Farhi i in., 2011), choć nie tych wspólnych dla Cannabis.

Obecnie, istniejące sekwencje genomowe Cannabis nie są w pełni zanotowane. W związku z tym, aby uzyskać praktyczne dane na temat funkcji genetycznych w Cannabis, konieczne będzie zastosowanie wiedzy wstępnej i pracy detektywistycznej. Największy potencjał w takich badaniach będzie tkwił w sferze epigenetyki, leżącej u podstaw dziedzicznych zmian w ekspresji genów lub fenotypie rośliny. Najbardziej odczuwalnym brakiem jest brak wiedzy na temat regulacji produkcji kannabinoidów. Zrozumienie ścieżek biosyntezy i regulacji syntaz terpenowych produkujących terpenoidy Cannabis zostało ledwie zapoczątkowane (Booth i in., 2017) i pozostaje dojrzałym celem dodatkowych badań (Russo, 2011).

Dodatkowym problemem w hodowli Cannabis pozostaje brak okazów voucherowych (które są zabronione przez US Drug Enforcement Administration bez licencji Schedule I) i formalnych depozytów akcesji chemovar w repozytoriach nasion i tkanek. To ostatnie zostało zrealizowane przez GW Pharmaceuticals oraz niezależnie przez NaPro Research (Lewis i in., 2018) w National Collection of Industrial, Food and Marine Bacteria (NCIMB) w Szkocji. Wiele prywatnych firm unikało dzielenia się germlazmą ze względu na ograniczenia prawne i strach przed utratą własności intelektualnej.

Synergia konopi

W 1998 roku profesorowie Raphael Mechoulam i Shimon Ben-Shabat stwierdzili, że układ endokannabinoidowy wykazuje „efekt świty”, w którym różnorodne „nieaktywne” metabolity i ściśle powiązane cząsteczki znacznie zwiększają aktywność podstawowych endogennych kannabinoidów, anandamidu i 2-arachidonoyloglicerolu (Ben-Shabat i in., 1998). Postulowali oni również, że pomaga to wyjaśnić, dlaczego leki botaniczne są często bardziej skuteczne niż ich wyizolowane składniki (Mechoulam i Ben-Shabat, 1999). Chociaż synteza pojedynczej cząsteczki pozostaje dominującym modelem rozwoju farmaceutyków (Bonn-Miller i in., 2018), równolegle obszernie przedstawiono koncepcję synergii botanicznej, powołując się na farmakologiczny wkład „pomniejszych kannabinoidów” i terpenoidów Cannabis w ogólny efekt farmakologiczny rośliny (McPartland i Pruitt, 1999; McPartland i Mediavilla, 2001; McPartland i Russo, 2001, 2014; Russo i McPartland, 2003; Wilkinson i in., 2003; Russo, 2011). Ilustracją jest kilka trafnych przykładów efektu świty w konopiach indyjskich:

W randomizowanym, kontrolowanym badaniu z zastosowaniem oromukosowych ekstraktów na bazie konopi indyjskich u pacjentów z nieprzezwyciężonym bólem pomimo zoptymalizowanego leczenia opioidami, ekstrakt z przewagą THC nie odróżniał się korzystnie od placebo, natomiast ekstrakt z całej rośliny (nabiximols, vide infra) zawierający zarówno THC, jak i kannabidiol (CBD) okazał się statystycznie istotnie lepszy od obu tych substancji (Johnson i in., 2010), przy czym jedyną istotną różnicą była obecność CBD w tym ostatnim.

W badaniach analgezji na zwierzętach, czyste CBD wytwarza dwufazową krzywą dawka-odpowiedź, taką, że mniejsze dawki zmniejszają reakcje bólowe, aż do osiągnięcia szczytu, po którym dalsze zwiększanie dawki jest nieskuteczne. Co ciekawe, zastosowanie ekstraktu Cannabis o pełnym spektrum działania z równoważnymi dawkami CBD eliminuje odpowiedź dwufazową na korzyść liniowej krzywej dawka-odpowiedź, tak że ekstrakt botaniczny działa przeciwbólowo w każdej dawce bez obserwowanego efektu pułapowego (Gallily i in., 2014).

Niedawne badanie kilku ludzkich linii komórkowych raka piersi w hodowli i wszczepionych guzach wykazało wyższość leczenia ekstraktem z konopi indyjskich nad czystym THC, najwyraźniej przypisywaną w tym pierwszym przypadku obecności niewielkich stężeń kannabigerolu (CBG) i kwasu tetrahydrokannabinolowego (THCA) (Blasco-Benito i in., 2018).

Antykonwulsyjne działanie kannabidiolu zauważono u zwierząt w latach 70. XX wieku, przy czym pierwsze próby na ludziach przeprowadzono w 1980 roku (Cunha i in., 1980). W niedawnym eksperymencie na myszach z napadami wywołanymi przez pentylenetetrazol zastosowano pięć różnych ekstraktów Cannabis o równych stężeniach CBD (Berman i in., 2018). Chociaż wszystkie ekstrakty wykazały korzyści w porównaniu z nieleczonymi kontrolami, zaobserwowano istotne różnice w profilach biochemicznych kannabinoidów innych niż CBD, co z kolei doprowadziło do znaczących różnic w liczbie myszy, u których wystąpiły napady toniczno-kloniczne (21,5-66,7%) i przeżywalności (85-100%), podkreślając znaczenie tych „drobnych” składników. Badanie to podkreśla konieczność standaryzacji w rozwoju farmaceutycznym, i chociaż może być interpretowane jako wsparcie modelu terapeutycznego pojedynczej cząsteczki (Bonn-Miller i in., 2018), wymaga podkreślenia, że złożone substancje botaniczne mogą spełniać amerykańskie standardy FDA (Food and Drug Administration, 2015). Konkretnie, dwa leki na bazie Cannabis osiągnęły zatwierdzenie regulacyjne, Sativex®(nabiximols, US Adopted Name) w 30 krajach i Epidiolex® w Stanach Zjednoczonych.

Wtedy pojawia się pytanie: Czy preparat Cannabis lub pojedyncza cząsteczka może być zbyt czysta, zmniejszając tym samym potencjał synergistyczny? Najnowsze dane potwierdzają, że jest to wyraźna możliwość. Anegdotyczne informacje od klinicystów wykorzystujących ekstrakty Cannabis o wysokiej zawartości CBD w leczeniu ciężkiej padaczki, takiej jak zespoły Dravet i Lennox-Gastaut, wykazały, że ich pacjenci wykazywali znaczną poprawę w zakresie częstotliwości napadów (Goldstein, 2016; Russo, 2017; Sulak i in., 2017) przy dawkach znacznie niższych niż te zgłaszane w formalnych badaniach klinicznych Epidiolexu, preparatu CBD o czystości 97% z usuniętym THC (Devinsky i in., 2016, 2017, 2018; Thiele i in., 2018). Obserwacja ta została niedawno poddana metaanalizie 11 badań obejmujących łącznie 670 pacjentów (Pamplona i wsp., 2018). Wyniki te wykazały, że u 71% pacjentów nastąpiła poprawa po zastosowaniu ekstraktów Cannabis z przewagą CBD vs. 36% na oczyszczonym CBD (p < 0,0001). Wskaźnik odpowiedzi przy 50% poprawie częstości napadów nie różnił się statystycznie w obu grupach, a obie grupy osiągnęły status wolny od napadów u około 10% pacjentów. Jednakże średnie dawki dobowe były znacząco rozbieżne w grupach: 27,1 mg/kg/d dla oczyszczonego CBD vs. tylko 6,1 mg/kg/d. dla bogatych w CBD ekstraktów Cannabis, dawka tylko 22,5% dawki dla samego CBD. Co więcej, częstość występowania łagodnych i ciężkich zdarzeń niepożądanych była ewidentnie wyższa u pacjentów z oczyszczonym CBD vs. z ekstraktem o wysokiej zawartości CBD (p < 0,0001), co autorzy przypisali stosowanej niższej dawce, która ich zdaniem została osiągnięta dzięki synergistycznemu wkładowi innych związków towarzyszących. Takie obserwacje wspierają hipotezę o większej skuteczności ekstraktów Cannabis łączących wiele składników przeciwdrgawkowych, takich jak CBD, THC, THCA, THCV, CBDV, linalool, a nawet kariofilen (Lewis i in., 2018).

Te badania i inne dostarczają solidnych podstaw dla synergii Cannabis, a także wsparcia dla rozwoju leków botanicznych w porównaniu z rozwojem pojedynczych składników (Bonn-Miller i in., 2018), lub produkcji za pomocą metod fermentacji w drożdżach lub innych mikroorganizmach. Przykład mocy konwencjonalnej hodowli selektywnej jest zilustrowany (Ryc. 2), w postaci chemowaru Cannabis nazwanego CaryodiolTM ze względu na zwiększoną zawartość kariofilenu (0,83%) jako agonisty CB2, wraz z wysoce korzystnym stosunkiem THC:CBD typu III wynoszącym 1:39,4. Taki preparat ma szansę znaleźć zastosowanie w leczeniu wielu schorzeń klinicznych, w tym: bólu, stanów zapalnych, zaburzeń włóknienia, uzależnień, lęków, depresji, chorób autoimmunologicznych, schorzeń dermatologicznych i nowotworów (Pacher i Mechoulam, 2011; Russo, 2011; Xi i in., 2011; Russo i Marcu, 2017; Lewis i in., 2018). Wytworzenie takiej kombinacji ze źródeł mikrobiologicznych mogłoby wymagać połączenia kannabinoidów pochodzących z wielu gatunków drożdży i w rezultacie stanowiłoby produkt kombinowany podlegający trudnej ścieżce regulacyjnej w porównaniu z preparatami Cannabis z ekstraktów jednego gatunku (np. nabiximols), który został zaakceptowany jako preparat jednostkowy w 30 krajach na całym świecie (Food and Drug Administration, 2015).

W niniejszym artykule krótko nakreślono ostatnio technologiczne próby „ponownego wynalezienia koła fitokannabinoidowego”. Uzasadnione argumenty przemawiają za tym, że można to zrobić, ale czy powinno się to zrobić? Dane potwierdzające istnienie synergii Cannabis i zdumiewająca plastyczność genomu Cannabis sugerują rzeczywistość, która wyklucza potrzebę alternatywnych gospodarzy, a nawet inżynierii genetycznej Cannabis sativa, udowadniając w ten sposób, że „roślina robi to lepiej.”

Wkład autora

Autor potwierdza, że jest jedynym autorem tej pracy i zatwierdził ją do publikacji.

Oświadczenie o konflikcie interesów

Jestem dyrektorem ds. badań w Międzynarodowym Instytucie Konopi i Kannabinoidów. Obsługujemy klientów zaangażowanych w handel konopiami indyjskimi.

Podziękowania

Autor docenia pomoc pracowników University of Montana Inter-Library Loan Office of Mansfield Library w dostarczeniu materiałów badawczych.

.