Szybka chromatografia cieczowa białek (FPLC) i wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC): dwie metody chromatografii cieczowej w bezpośrednim porównaniu. W artykule omówiono różnice między tymi dwiema technikami, ze szczególnym uwzględnieniem wymagań dotyczących odpowiednich analitów.
Nazwy szybka chromatografia cieczowa białek (FPLC) i wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) stanowią wskazówkę dotyczącą różnic między tymi metodami chromatograficznymi. Podczas gdy HPLC wykorzystuje wysokie ciśnienie do analizy małych związków chemicznych, FPLC oczyszcza duże biomolekuły, takie jak białka czy DNA. Chromatografia biomolekuł jest bardzo wymagająca i delikatna, ponieważ nie są one odporne na wysokie temperatury, wysokie ciśnienia lub rozpuszczalniki zwykle używane w HPLC. Z tych powodów rozdzielanie biomolekuł wymaga podejścia alternatywnego do HPLC.
Do szybkiej chromatografii cieczowej białek powszechnie używa się kilku terminów, takich jak biochromatografia, bioseparacja lub biopuryfikacja. Ta specjalna forma chromatografii jest stosowana do oczyszczania dużych biomolekuł o masie kilku kilodaltonów (kDa), takich jak białka, nukleotydy lub peptydy (Rysunek 1). Celem użytkownika FPLC jest uzyskanie jak największej ilości czystego i natywnego produktu. Z drugiej strony, celem klasycznej HPLC jest identyfikacja i kwalifikacja analitów, zwykle małych związków o wielkości od kilku atomów do około 3000 Da.
Wyzwanie uzyskania czystego białka z ekstraktu komórkowego
Typowo, biomolekuły są oczyszczane z komórek bakteryjnych lub eukariotycznych, które są wypełnione białkami, DNA, RNA i błonami komórkowymi. Dlatego też, oczyszczenie interesującego nas białka z ekstraktu komórkowego może być bardzo trudne. Biochemicy stosują kilka sztuczek: jedną z nich jest użycie białek rekombinowanych, które są nadekspresjonowane przez komórki. Nadekspresja interesującego nas białka umożliwia oczyszczenie go w większych ilościach. Druga sztuczka polega na dodaniu do interesującego nas białka znacznika, który jest specyficznie rozpoznawany przez żywicę (materiał kolumny). Białka bez znacznika nie wiążą się z kolumną i są natychmiast eluowane, podczas gdy pożądane białko jest wzbogacane i może być łatwo rozdzielone.
Biomolekuły są oczyszczane z lizatów komórkowych, co oznacza znacznie większe objętości próbek niż w przypadku analitycznej HPLC. Dlatego do nastrzykiwania próbki stosuje się większe pętle próbkowe lub nawet pompy o większych prędkościach przepływu. Ponadto materiały, z których wykonane są kolumny FPLC i HPLC całkowicie się różnią. Do HPLC stosuje się kulki krzemionkowe o bardzo małych rozmiarach cząstek i dużej odporności na wysokie ciśnienia, podczas gdy FPLC wymaga do większości metod agarozy lub materiału polimerowego o większych rozmiarach cząstek. Żywice stosowane w FPLC nie są tak stabilne ciśnieniowo jak kulki krzemionkowe i są bardzo wrażliwe na pęcherzyki powietrza. Ponadto różni się nie tylko materiał kolumny, ale także jej wyposażenie. W klasycznej HPLC stosowane są odporne na ciśnienie kolumny ze stali nierdzewnej. Jak już wspomniano, stabilność ciśnienia nie jest istotna w przypadku FPLC i dlatego możliwa jest praca z przezroczystymi i biokompatybilnymi kolumnami szklanymi. Jest to ogromna zaleta, ponieważ użytkownik może sprawdzić, czy w kolumnie nie ma pęcherzyków powietrza lub monitorować stan materiału podczas przebiegu oczyszczania.
Diverse Biomolecules, Diverse Purification Methods
Różnice w materiale kolumn odzwierciedlają się również w metodach. W analitycznej HPLC, chromatografia w odwróconych fazach z hydrofobowymi fazami stacjonarnymi i polarnymi fazami ruchomymi jest metodą z wyboru, podczas gdy w FPLC stosuje się większą różnorodność metod (Rysunek 2). Jedną z metod FPLC jest chromatografia z wykluczeniem rozmiaru (SEC), w której cząsteczki są rozdzielane w zależności od ich wielkości. Mniejsze cząsteczki mogą dyfundować do porów perełek, podczas gdy większe cząsteczki przechodzą przez kolumnę prawie bez zatrzymania. Mniejsze cząsteczki eluują z kolumny później, generując gradient tych cząsteczek w zależności od ich wielkości. Inną metodą separacji jest chromatografia jonowymienna. Biomolekuły są rozdzielane i oczyszczane zgodnie z ich specyficznym ładunkiem, który zależy od pH buforu. Im bardziej naładowane jest białko, tym lepiej wiąże się ono z przeciwnie naładowaną żywicą. Aby wymyć białko z kolumny, stężenie jonów soli jest zwiększane podczas przebiegu. Jony soli konkurują z białkiem o wiązanie z żywicą. Inną ważną metodą FPLC jest chromatografia powinowactwa, w której interesująca nas cząsteczka może wiązać się specyficznie z kolumną, podczas gdy inne cząsteczki nie mogą i będą eluować bez wiązania. W tym przypadku stosowane są kolumny ze specjalnymi nośnikami, które rozpoznają pożądaną biomolekułę. Specjalną formą chromatografii powinowactwa jest immobilizowane powinowactwo do jonów metali (IMAC). Interesujące nas białko musi być genetycznie zmienione poprzez dodanie do niego znacznika, który zazwyczaj składa się z sześciu histydyn. Żywica IMAC specyficznie rozpoznaje ten „Hisâtag”. Elucja odbywa się poprzez zwiększenie stężenia imidazolu, który konkuruje z białkami znakowanymi His. Ponadto, białka mogą być również rozdzielane w oparciu o ich specyficzną hydrofobowość przy użyciu metody separacji oddziaływań hydrofobowych. Żywica jest skomponowana w taki sposób, że najbardziej hydrofobowe białka będą najsilniej wiązać się z kolumną i są eluowane poprzez zmniejszanie gradientu soli.
W celu oczyszczenia pożądanego białka, zwykle stosuje się kombinację metod. W pierwszym etapie, tak zwanym etapie „wychwytywania”, białko jest oczyszczane z surowego ekstraktu. Zazwyczaj do tego pierwszego etapu oczyszczania stosuje się chromatografię powinowactwa. Drugi etap, „pośredni”, usuwa dalsze zanieczyszczenia poprzez chromatografię jonowymienną lub interakcję hydrofobową. Celem końcowego etapu „polerowania” – zwykle jest to etap chromatografii wykluczania wielkości – jest pozbycie się wszystkich pozostałych zanieczyszczeń w celu uzyskania produktu o wysokiej czystości. Ta strategia oczyszczania białek zależy całkowicie od konkretnej biomolekuły. W niektórych przypadkach, dwuetapowe oczyszczanie może być wystarczające. Im więcej metod jest połączonych, tym więcej interesującego nas białka jest tracone podczas oczyszczania, ale można osiągnąć wyższą czystość.
Po oczyszczaniu uzyskaną próbkę można analizować pod względem czystości, stężenia i funkcji lub aktywności enzymu za pomocą HPLC, elektroforezy w żelu poliakrylamidowym z dodecylosiarczanem sodu (SDS-PAGE), testów aktywności enzymu lub spektrometrii masowej.
Wymagania dotyczące FPLC
Białka składają się z aminokwasów ułożonych w łańcuch. Łańcuch ten jest złożony w trójwymiarową strukturę, która jest kluczem do funkcji i aktywności każdego białka. Dlatego bardzo ważne jest zachowanie tej struktury białka podczas procesu oczyszczania. Czynniki zewnętrzne, takie jak wysoka temperatura, wysokie ciśnienie, ekstremalne pH lub rozpuszczalniki mogą zaburzyć strukturę białka i dlatego unika się ich w FPLC. Temperatura robocza dla białek wynosi zazwyczaj 4 °C. Z tego powodu urządzenie FPLC jest często umieszczane w zimnej komorze lub zimnym pomieszczeniu, gdzie jest narażone nie tylko na niską temperaturę, ale również na skraplającą się wilgoć. Komponenty systemu FPLC muszą być specjalnie zaprojektowane do pracy w takich warunkach. Ponadto, komponenty FPLC napotykają na dodatkowe wyzwanie, a mianowicie roztwory buforowe soli, które są używane jako eluenty. Zazwyczaj wybiera się izosmotyczne pH i stężenia soli zbliżone do środowiska komórkowego. Systemy chromatograficzne są zazwyczaj wykonane ze stali nierdzewnej. Z jednej strony, sól zawarta w buforach może prowadzić do korozji, a z drugiej strony jony metali ze stali nierdzewnej mogą interferować z białkiem i zaburzać jego strukturę. Dlatego ważne jest, aby podczas wykonywania FPLC unikać stali nierdzewnej i używać materiałów biokompatybilnych, takich jak ceramika z polieteroeteroketonu (PEEK) lub tytanu. Podobnie jak systemy HPLC, systemy FPLC są również kontrolowane przez oprogramowanie. Istnieją znaczne różnice pomiędzy oprogramowaniem FPLC i HPLC. To ostatnie jest głównie używane do analizy próbek i zawiera wiele narzędzi analitycznych. W FPLC natomiast nie potrzeba wielu narzędzi analitycznych i powszechne jest generowanie metod w oparciu o objętość lub nawet objętość kolumny (Rysunek 3). Dla większości zastosowań FPLC preferowane są metody oparte na objętości kolumny, co ułatwia skalowanie. Oprogramowanie FPLC jest przeważnie bardzo intuicyjne i przyjazne dla użytkownika oraz obejmuje bezpośrednią kontrolę, która umożliwia dostosowanie parametrów podczas przebiegu. Dzięki temu użytkownik może bardzo spontanicznie reagować na różne sytuacje.
Jasne jest zatem, że pomiędzy tymi dwoma obszarami chromatograficznymi istnieją zasadnicze różnice (Tabela 1). Metody, sprzęt i oprogramowanie różnią się znacznie w zależności od tego, czy cząsteczka jest analizowana czy oczyszczana. W przypadku zastosowań FPLC, wrażliwa natura próbek i dążenie do utrzymania ich w jak najbardziej natywnym stanie jest dodatkowym wyzwaniem. Ogólnie rzecz biorąc, obie techniki są bardzo interesującymi obszarami, o których każdy pracujący w tej dziedzinie powinien wiedzieć.
Stephanie Runde ukończyła Uniwersytet Techniczny w Monachium, Niemcy, uzyskując dyplom z biochemii. Uzyskała tytuł doktora na Freie Universität Berlin, Niemcy, a obecnie pracuje w Knauer Wissenschaftliche Geräte GmbH jako menedżer produktu dla FPLC.