FRAP może być również stosowany do monitorowania białek poza błoną. Po tym jak białko zainteresowania staje się fluorescencyjne, zazwyczaj przez ekspresję jako białko fuzyjne GFP, mikroskop konfokalny jest używany do fotobielenia i monitorowania regionu cytoplazmy, wrzeciona mitotycznego, jądra lub innej struktury komórkowej. Średnia fluorescencja w tym regionie może być następnie wykreślona w zależności od czasu od fotobielenia, a uzyskana krzywa może dać współczynniki kinetyczne, takie jak te dla reakcji wiązania białka i/lub współczynnik dyfuzji białka w medium, w którym jest ono monitorowane. Często jedyną dynamiką braną pod uwagę jest dyfuzja i interakcje wiązanie/roz wiązanie, jednak w zasadzie białka mogą również poruszać się poprzez przepływ, tzn, Może to być spowodowane przepływem cytoplazmy lub nukleoplazmy, lub transportem wzdłuż włókien w komórce, takich jak mikrotubule, przez silniki molekularne.

Analiza jest najprostsza, gdy odzysk fluorescencji jest ograniczony albo przez szybkość dyfuzji do wybielonego obszaru, albo przez szybkość, przy której wybielone białka odczepiają się od swoich miejsc wiążących w wybielonym obszarze i są zastępowane przez białko fluorescencyjne. Przyjrzyjmy się tym dwóm ograniczeniom, dla powszechnego przypadku wybielania białka fuzyjnego GFP w żywej komórce.

Ograniczone dyfuzją odzyskiwanie fluorescencjiEdit

Dla okrągłej plamki wybielającej o promieniu w {{displaystyle w}

i zdominowanej przez dyfuzję regeneracji, fluorescencja jest opisana równaniem wyprowadzonym przez Soumpasisa (które obejmuje zmodyfikowane funkcje Bessela I 0 {displaystyle I_{0}}

oraz I 1 {displaystyle I_{1}}

) f ( t ) = e – 2 τ D / t ( I 0 ( 2 τ D / t ) + I 1 ( 2 τ D / t ) {{displaystyle f(t)=e^{-2tau _{D}/t}}left(I_{0}(2tau _{D}/t)+I_{1}(2tau _{D}/t)}

z τ D {{displaystyle \tau _{D}}

charakterystyczną skalą czasu dla dyfuzji, a t {displaystyle t}

jest czasem. f ( t ) {displaystyle f(t)}

jest znormalizowaną fluorescencją (zmierza do 1, gdy t {displaystyle t}

zmierza do nieskończoności). Skala czasu dyfuzji dla wybielonej plamki o promieniu w {displaystyle w}

wynosi τ D = w 2 / ( 4 D ) {displaystyle \a_tau _{D}=w^{2}/(4D)}

, gdzie D jest współczynnikiem dyfuzji.

Zauważ, że jest to dla natychmiastowego wybielania z profilem funkcji krokowej, tzn. frakcja f b {{displaystyle f_{b}}

białka, które ma być wybielone natychmiast w czasie t = 0 {displaystyle t=0}

jest f b ( r ) = b , r <w {displaystyle f_{b}(r)=b,~~r<w}

, oraz f b ( r ) = 0 , r > w {displaystyle f_{b}(r)=0,~~r>w}

, dla r {{displaystyle r}

jest odległością od środka wybielonego obszaru. Zakłada się również, że regeneracja może być modelowana przez dyfuzję w dwóch wymiarach, która jest jednorodna i izotropowa. Innymi słowy, że dyfuzja zachodzi w jednorodnym ośrodku, więc efektywna stała dyfuzji D jest wszędzie taka sama, oraz że dyfuzja jest izotropowa, tzn. zachodzi z taką samą szybkością wzdłuż wszystkich osi w płaszczyźnie.

W praktyce, w komórce żadne z tych założeń nie będzie ściśle prawdziwe.

1. Bielenie nie będzie natychmiastowe. Szczególnie jeśli wymagane jest silne wybielanie dużego obszaru, wybielanie może zająć znaczną część skali czasowej dyfuzji τ D {{D}}
   

   . Wówczas znaczna część bielonego białka będzie dyfundować poza bielony region w trakcie bielenia. Nieuwzględnienie tego faktu wprowadzi znaczący błąd do D.

2. Profil bielenia nie będzie radialną funkcją krokową. Jeżeli wybielana plamka jest efektywnie pojedynczym pikselem, wtedy wybielanie w funkcji położenia będzie zazwyczaj ograniczone dyfrakcyjnie i określone przez optykę stosowanego konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego. To nie jest radialna funkcja kroku i również zmienia się wzdłuż osi prostopadłej do płaszczyzny.
3. Komórki są oczywiście trójwymiarowe nie dwuwymiarowe, tak jak wybielona objętość. Zaniedbanie dyfuzji poza płaszczyzną (przyjmujemy, że jest to płaszczyzna xy) będzie rozsądnym przybliżeniem tylko wtedy, gdy fluorescencja odzyskuje głównie poprzez dyfuzję w tej płaszczyźnie. Będzie to prawdą, na przykład, jeśli wybielana jest cylindryczna objętość o osi cylindra wzdłuż osi z i ta cylindryczna objętość przechodzi przez całą wysokość komórki. Wówczas dyfuzja wzdłuż osi z nie powoduje odzyskiwania fluorescencji, ponieważ wszystkie białka są wybielane równomiernie wzdłuż osi z, a więc zaniedbanie jej, jak to robi równanie Soumpasisa, jest nieszkodliwe. Jednakże, jeśli dyfuzja wzdłuż osi z przyczynia się do odzyskiwania fluorescencji, to musi być uwzględniona.
4. Nie ma powodu, aby oczekiwać, że cytoplazma lub nukleoplazma komórki będzie całkowicie przestrzennie jednorodna lub izotropowa.

Więc, równanie Soumpasis jest tylko użytecznym przybliżeniem, które może być użyte, gdy założenia wymienione powyżej są dobrymi przybliżeniami do prawdziwej sytuacji, i gdy odzysk fluorescencji jest rzeczywiście ograniczony przez skalę czasową dyfuzji τ D {{D}}

. Zauważ, że tylko dlatego, że Soumpasis może być odpowiednio dopasowany do danych, nie musi oznaczać, że założenia są prawdziwe i że dyfuzja dominuje w regeneracji.

Reaction-limited recoveryEdit

Równanie opisujące fluorescencję jako funkcję czasu jest szczególnie proste w innym ograniczeniu. Jeśli duża liczba białek wiąże się do miejsc w małej objętości, tak że tam sygnał fluorescencji jest zdominowany przez sygnał od związanych białek, i jeśli to wiązanie jest całe w jednym stanie z szybkością wyłączania koff, to fluorescencja w funkcji czasu jest dana przez

f ( t ) = 1 – e – k off t {{displaystyle f(t)=1-e^{-k_{text{off}}t}}

Zauważ, że odzysk zależy tylko od stałej szybkości odczepiania, koff,. Nie zależy on od szybkości wiązania. Chociaż zależy to od wielu założeń

1. Stopa on musi być wystarczająco duża, aby lokalne stężenie związanego białka znacznie przekraczało lokalne stężenie wolnego białka, co pozwala nam zaniedbać wkład do f wolnego białka.
2. Reakcja jest prostą reakcją bimolekularną, gdzie białko wiąże się z miejscami, które nie poruszają się znacząco podczas regeneracji
3. Wymiana jest znacznie wolniejsza niż dyfuzja (lub jakikolwiek mechanizm transportowy jest odpowiedzialny za mobilność), ponieważ tylko wtedy dyfundująca frakcja szybko się regeneruje, a następnie działa jako źródło białka fluorescencyjnego, które wiąże i zastępuje związane wybielone białko i w ten sposób zwiększa fluorescencję. Przy r – promieniu wybielonej plamki, oznacza to, że równanie jest ważne tylko wtedy, gdy czas życia związanego 1 / k off >> r 2 / D {{displaystyle 1/k_{off}}>>r^{2}}/D}
   

   .

Jeśli wszystkie te założenia są spełnione, to dopasowanie wykładniczej do krzywej odzyskiwania da stałą szybkości wyłączania, koff. Jednakże, inne dynamiki mogą dać krzywe odzyskiwania podobne do wykładniczych, więc dopasowanie wykładniczej niekoniecznie oznacza, że odzyskiwanie jest zdominowane przez prostą reakcję bimolekularną. Jednym ze sposobów rozróżnienia pomiędzy odzyskiwaniem z szybkością determinowaną przez niezwiązanie i odzyskiwaniem ograniczonym przez dyfuzję jest zauważenie, że szybkość odzyskiwania dla odzyskiwania ograniczonego przez niezwiązanie jest niezależna od rozmiaru wybielonego obszaru r, podczas gdy skaluje się jako r – 2 {{displaystyle r^{-2}}}

, dla odzyskiwania ograniczonego dyfuzją. Tak więc, jeśli mały i duży obszar są wybielane, jeśli odzyskiwanie jest ograniczone przez wiązanie, wtedy szybkość odzyskiwania będzie taka sama dla dwóch rozmiarów wybielanego obszaru, podczas gdy jeśli odzyskiwanie jest ograniczone przez dyfuzję, wtedy będzie znacznie wolniejsze dla większego wybielanego obszaru.

Dyfuzja i reakcjaEdit

W ogólności, odzyskiwanie fluorescencji nie będzie zdominowane ani przez prostą izotropową dyfuzję, ani przez pojedynczą prostą szybkość niewiązania. Będzie tam zarówno dyfuzja jak i wiązanie, i rzeczywiście stała dyfuzji może nie być jednolita w przestrzeni, i może być więcej niż jeden typ miejsc wiążących, a miejsca te mogą mieć również niejednolity rozkład w przestrzeni. Procesy przepływu mogą być również ważne. To bardziej złożone zachowanie sugeruje, że model z kilkoma parametrami jest wymagany do opisania danych; modele tylko z pojedynczą stałą dyfuzji D lub pojedynczą stałą szybkości wyłączania, koff, są nieodpowiednie.

Są modele zarówno z dyfuzją jak i reakcją. Niestety, pojedyncza krzywa FRAP może dostarczyć niewystarczających dowodów, aby wiarygodnie i jednoznacznie dopasować (prawdopodobnie zaszumione) dane eksperymentalne. Sadegh Zadeh et al. pokazali, że krzywe FRAP mogą być dopasowane przez różne pary wartości stałej dyfuzji i stałej szybkości reakcji, lub, innymi słowy, że dopasowania do FRAP nie są unikalne. Dzieje się tak w przypadku dopasowań trójparametrowych (stała on-rate, stała off-rate i stała dyfuzji). Dopasowania, które nie są unikalne, nie są ogólnie użyteczne.

Tak więc dla modeli z wieloma parametrami, pojedynczy eksperyment FRAP może być niewystarczający do oszacowania wszystkich parametrów modelu. Wówczas wymagana jest większa ilość danych, np. poprzez wybielanie obszarów o różnych rozmiarach, wyznaczanie niektórych parametrów modelu niezależnie, itp.

.