Bacterial isolation and RdFucI identification

Kolonię, która wyrosła w podłożu zawierającym l-fukoidan pochodzący z Laminaria Japonica (Carbosynth, Compton, Berkshire, UK) jako jedyne źródło węgla, wyizolowano z jelita abalone zebranego w Korei Południowej (plik dodatkowy 1: Fig. S1). Porównanie identyczności sekwencji opartej na 16S rybosomalnym RNA z bazą danych NCBI wykazało, że izolat był filogenetycznie bliski członkom rodzaju Raoultella (plik dodatkowy 1: Rys. S1). W związku z tym wyizolowany szczep zidentyfikowano jako Raoultella sp. KDH14. Po wykonaniu pełnego sekwencjonowania genomu, RdFucI został zidentyfikowany z Raoultella sp. KDH14 na podstawie identyczności sekwencji genu.

RdFucI składa się z 595 aminokwasów o masie cząsteczkowej 65,5 kDa i punkcie izoelektrycznym 5,5. Wyniki BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) wskazują na wysoką identyczność sekwencji RdFucI (> 90%) z innymi l-FucI pochodzącymi z różnych bakterii należących do rodzin Raoultella, Klebsiella i Citrobacter.

Zidentyfikowany RdFucI został nadprodukowany w E. coli BL21(DE3) z N-końcowym znacznikiem heksa-histydynowym i oczyszczony przez chromatografię powinowactwa do his-tag. Podczas analizy metodą elektroforezy w żelu dodecylosiarczanu sodu-poliakrylamidowym (SDS-PAGE), pojedyncze pasmo pojawiło się przy 65 kDa, zgodnie z obliczoną masą cząsteczkową podjednostki monomeru.

Katalizowana przez RdFucI reakcja sprzyja tworzeniu l-fukozy

Aby zbadać aktywność izomerazy RdFucI, reakcję enzymatyczną przeprowadzono z l-fukozą lub l-fukulozą jako substratem (ryc. 2). Określono aktywność enzymu dla reakcji forward (l-fukoza do l-fukozy) i reverse (l-fukoza do l-fukozy). Wytwarzanie l-fukozy z l-fukozy potwierdzono metodą chromatografii cienkowarstwowej (TLC) i chromatografii gazowej/spektrometrii masowej (GC/MS) (plik dodatkowy 2: Rys. S2). W procesie interkonwersji pomiędzy l-fukozą i l-fukozą nie zaobserwowano żadnego produktu ubocznego, co oznacza, że jeden substrat daje jeden produkt (plik dodatkowy 2: Rys. S2). Dlatego uważamy za rozsądne posługiwanie się obliczoną ilością stężenia l-fukozy poprzez eksperymentalny pomiar ilości l-fukozy.

Enzymatyczna konwersja a l-fukozy do l-fukozy (reakcja w przód) i b l-fukozy do l-fukozy (reakcja odwrotna) przez RdFucI. Reakcję enzymatyczną przeprowadzono przy użyciu 3 µg RdFucI z a l-fukozą lub b l-fukozą w stężeniu 10 mM jako substratem wyjściowym w temperaturze 30 °C przez 10 min w 20 mM fosforanu sodu (pH 7,0) w obecności 1 mM Mn2+. Stężenie l-fukozy mierzono doświadczalnie, a stężenie l-fukozy obliczano odejmując doświadczalnie oznaczone stężenie l-fukozy od całkowitego stężenia cukru (10 mM). Dane doświadczalne przedstawiają średnie ± odchylenia standardowe trzech powtórzeń

Reakcja odwrotna była 6,6 razy szybsza niż reakcja postępowa, a aktywność specyficzna dla l-fukulozy (63,9 U/mg) była wyższa niż dla l-fukozy (9,6 U/mg). W obu reakcjach stosunek równowagowy pomiędzy l-fukozą i l-flukozą, który wyznaczono doświadczalnie, wynosił ok. 9:1, co pozwoliło uzyskać stałą równowagi (Keq) równą 0,11. Wartość Keq została również wyznaczona teoretycznie jako 0,23, w oparciu o termodynamiczną zależność standardowej zmiany energii swobodnej reakcji Gibbsa i Keq w stanie równowagi, \(\mathop \Delta \limits_{r} G^{ \circ } = – RT\ln K_{text{eq}}), gdzie R i T oznaczają odpowiednio stałą gazową (8,314 J/mol K) i temperaturę (K). \(\mathop \Delta \limits_{r} G^{ \circ }}) reprezentuje standardową zmianę energii swobodnej Gibbsa dla reakcji l-fukozy na l-fukozę (0,859993 kcal/mol), która jest wymieniona w bazie danych BioCyc (https://biocyc.org). Wystąpiła pewna rozbieżność pomiędzy doświadczalnymi i teoretycznymi wartościami Keq. Wartość Keq < 1 wskazuje, że reakcja odwrotna jest faworyzowana. Katalizowana przez RdFucI izomeryzacja faworyzowała reakcję odwrotną, produkując l-fukozę z l-fukozy z około 90% wydajnością w 30 °C i pH 7.

Wpływ temperatury i pH na aktywność RdFucI i równowagę

Reakcje enzymatyczne przeprowadzono w różnych temperaturach od 10 do 80 °C i pH od 4 do 11, używając l-fukozy jako substratu (Rys. 3). Izomeryzacja l-fukulozy do l-fukozy przez RdFucI była wysoce zależna od temperatury, a maksymalną lub zbliżoną do maksymalnej aktywność (> 80% maksimum) wykazywano w temperaturach od 30 do 50 °C (Rys. 3a). Aby zbadać wpływ temperatury na równowagę izomeryzacji l-fukozy do l-fukozy, zbadano stosunek równowagi w temperaturach 30, 40 i 50 °C, w których wykazano maksymalne lub zbliżone do maksymalnych aktywności (> 80% maksimum). W rezultacie nie stwierdzono istotnej różnicy w stosunku równowagi pomiędzy tymi trzema temperaturami (l-fukoza/l-fukoza = 9:1; p > 0,05). Innymi słowy, l-fukoza była syntetyzowana z l-fukulozy z wydajnością około 90% we wszystkich badanych temperaturach (plik dodatkowy 3: Fig. S3a).

Wpływ temperatury a i pH b na względną aktywność RdFucI wobec l-fukulozy. Reakcje enzymatyczne przeprowadzono a w różnych temperaturach w zakresie od 10 do 80 °C i b w różnych pH w zakresie od 4 do 11. Użyto następujących buforów: 50 mM octanu sodu (pH 4, 5 i 6), 50 mM fosforanu sodu (pH 6, 7 i 8), 50 mM Tris-HCl (pH 7, 8 i 9) oraz 50 mM glicyny-NaOH (9, 10 i 11). Dane doświadczalne reprezentują średnie ± odchylenia standardowe z trzech powtórzeń

Badano wpływ pH. Wysoką aktywność RdFucI (> 70% maksimum) obserwowano w pH zasadowym i zbliżonym do obojętnego (pH 9, 10, i 11 oraz pH 6, 7, i 8). Poniżej pH 6 aktywność enzymu gwałtownie spadała, a niewielką aktywność obserwowano przy pH 4. Pomimo wysokich aktywności specyficznych w warunkach zasadowych, wydajność l-fukozy w stanie równowagi (60 min inkubacji) była znacznie niższa przy pH 10 (54%) niż przy pH 7 (88%) (plik dodatkowy 3: ryc. S3b). Względne aktywności przy pH 7, 8 i 9 były znacznie niższe w buforze Tris-HCl niż aktywności w buforze octanu sodu lub glicyny-NaOH, co sugeruje, że Tris silnie hamował aktywność enzymatyczną RdFucI. Poprzednie eksperymenty enzymatyczne w tej pracy zostały przeprowadzone w mieszaninach reakcyjnych zawierających Tris w stężeniu 1 mM, który pochodził z etapu zmiany buforu po oczyszczeniu enzymu. Aby zbadać, czy Tris w mieszaninie reakcyjnej może hamować RdFucI, porównano aktywności izomeryzacji z reakcji zachodzących w nieobecności i obecności 1 mM Tris (plik dodatkowy 4: Rys. S4). Nie było widocznej znaczącej różnicy w aktywnościach enzymatycznych z dwóch reakcji, co wskazuje, że 1 mM Tris nie hamował aktywności RdFucI.

Wpływ jonów metali na aktywność RdFucI

Izomerazy cukrowe, w tym izomerazy l-fukozy, wymagają kationów dwuwartościowych, takich jak Mn2+ i Co2+, jako kofaktorów dla ich aktywności izomeryzacji . Aby zbadać wpływ kationów dwuwartościowych na aktywność katalityczną RdFucI na l-fukozie, aktywność enzymu badano w nieobecności i obecności 1 mM różnych jonów metali lub kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) (Tabela 1). Natywny enzym RdFucI nie poddany działaniu jonów metali lub EDTA wykazywał niską aktywność, a chelatowanie metali przez EDTA obniżało aktywność enzymu. Spośród badanych jonów metali, Mn2+, Mg2+, Co2+, Cd2+ i Zn2+ powodowały wyraźny wzrost aktywności enzymu. W szczególności, dodatek Mn2+ maksymalnie zwiększył aktywność RdFucI około 7,4-krotnie. Dla kontrastu, Ca2+, Cu2+ i Fe3+ raczej hamowały aktywność RdFucI.

Swoistość substratowa i parametry kinetyczne RdFucI

Ogólnie, izomerazy cukrowe i cukrowo-fosforanowe wykazują szeroką swoistość wobec różnych substratów. Aby ocenić, czy ketozo-faworyzująca aktywność RdFucI wykazana z l-fukozą była również widoczna z innymi substratami, zbadano specyficzność substratową RdFucI wobec różnych cukrów aldozowych (l-fukozy, d-arabinozy, d-altrozy, d-galaktozy, d-mannozy i d-glukozy) i odpowiadających im cukrów ketozowych (l-fukozy, d-rybulozy, d-psicozy, d-tagatozy i d-fruktozy) (ryc. 4). Spośród wszystkich tych substratów, w tym cukrów aldozowych i ketozowych, najwyższą aktywność zaobserwowano dla l-fukulozy (115,3 U/mg) i d-rybulozy (127,3 U/mg), które są cukrami ketozowymi. Aktywności RdFucI dla l-fukulozy i d-rybulozy były znacznie wyższe niż dla pozostałych substratów. Spośród cukrów aldozowych aktywność dla l-fukozy była najwyższa (21,0 U/mg), a pozostałe substraty dawały aktywności specyficzne w zakresie od 4,7 do 7,9 U/mg. Cukry ketozowe inne niż l-fukoza i d-rybuloza wykazywały specyficzne aktywności od 0,0 do 10,8 U/mg. Tak więc, l-fukuloza i d-rybuloza były preferowanymi substratami dla RdFucI, a aktywność ketozo-faworyzująca RdFucI została wykazana tylko z l-fukulozą i d-rybulozą.

Swoistość substratowa RdFucI. Reakcje enzymatyczne przeprowadzono wobec 10 mM różnych substratów aldozowych i ketozowych w temperaturze 40 °C i pH 10. Dla substratów aldozowych stosowano l-fukozę, d-arabinozę, d-altrozę, d-galaktozę, d-mannozę i d-glukozę. Dla substratów ketozowych zastosowano l-fukozę, d-rybulozę, d-psicozę, d-tagatozę i d-fruktozę. Dane doświadczalne przedstawiają średnie ± odchylenia standardowe z trzech powtórzeń

Parametry kinetyczne wyznaczono stosując jako substraty l-fukulozę i d-rybulozę (plik dodatkowy 5: Tabela S1). Wartości Km (stała Michaelisa) i kcat (liczba obrotu substratu) dla l-fukulozy były odpowiednio 1,9- i 1,2-krotnie niższe niż dla d-rybulozy. Wydajność katalityczna RdFucI, reprezentowana jako kcat/Km, dla l-fukulozy, była 1,5-krotnie wyższa niż dla d-rybulozy, co wskazuje, że l-fukuloza jest preferowana jako substrat RdFucI.

Ogólna struktura krystaliczna RdFucI

Aby lepiej zrozumieć funkcję molekularną, określiliśmy strukturę krystaliczną RdFucI (plik dodatkowy 6: Tabela S2). Mapa gęstości elektronowej RdFucI była dobrze zdefiniowana od reszt Ser5-Arg591 dla sześciu podjednostek w jednostce asymetrycznej. Monomer RdFucI składa się z 19 α-helikali i 23 β-strandów obejmujących domeny N1, N2 i C (Rys. 5a). Domena N1 (Ser5-Met172) przyjmuje fałd α/β i jest zaangażowana w rozpoznawanie substratów w procesie tworzenia heksameru RdFucI. Domeny N2 (Lys173-Leu352) i C (Thr353-Arg591) zawierają reszty wiążące metale zaangażowane w aktywność katalityczną (Rys. 5a). W jednostce asymetrycznej podjednostki RdFucI tworzą formację heksameryczną ułożoną jako dimer trimerów o pseudosymetrii D3h (Rys. 5b). Jest to zgodne z wynikiem analitycznej chromatografii wykluczeniowej, w której wykazano, że RdFucI istnieje jako homoheksamer w roztworze (plik dodatkowy 7: Fig. S5).

Overall structure of RdFucI. a Cartoon representation of the RdFucI monomer. Monomer RdFucI składa się z domen N1- (żółta), N2- (różowa) i C- (zielona). b Powierzchniowe przedstawienie heksameru RdFucI. Podjednostki A, B, C, D, E i F są oznaczone odpowiednio kolorem żółtym, różowym, cyjanowym, fioletowym, zielonym i pomarańczowym. Miejsce wiązania metalu w miejscu kieszeni wiążącej substrat jest zaznaczone czerwoną kropką

W formacji heksamerycznej, podjednostka A (całkowita powierzchnia: 23011.7 Å2) oddziałuje z czterema różnymi podjednostkami B (reszty w interfejsie: 47/powierzchnia spalona: 1909,6 Å2), C (58/1837,6 Å2), D (42/1482,9 Å2) i E (34/1086,2 Å2). Podjednostka A nie oddziałuje z pozostałą podjednostką F (Rys. 5b). Podjednostka A RdFucI ma całkowitą powierzchnię zakopaną 2569,1 Å2, co stanowi 27,45% całkowitej powierzchni. Ten zakopany interfejs jest stabilizowany przez oddziaływania obejmujące 59 wiązań wodorowych i 26 mostków solnych z innych podjednostek (plik dodatkowy 8: Tabela S3, plik dodatkowy 9: Tabela S4, plik dodatkowy 10: Tabela S5, plik dodatkowy 11: Tabela S6).

Miejsce wiązania substratu i miejsce aktywne RdFucI

Kieszonka wiązania substratu jest utworzona przez domeny N2 i C podjednostki A oraz domenę N1 podjednostki B (Rys. 6a-c) i ma łącznie sześć miejsc wiązania substratu w homoheksamerycznym RdFucI. Wejście kieszeni wiążącej substrat, do której zbliża się substrat, ma wymiary około 11 × 12,5 Å (Rys. 6a). Kieszeń wiążąca substrat, w której powstaje miejsce wiążące metal, ma ujemnie naładowaną powierzchnię o wymiarach około 4 × 5 Å (Rys. 6b). Odległość pomiędzy miejscem wiązania metalu a powierzchnią kieszeni wiązania substratu wynosi około 16,7 Å (Rys. 6d), co sugeruje, że centrum aktywne znajduje się głęboko w kieszeni. Wskazuje to, że zarówno otwarty łańcuch jak i forma pierścieniowa substratu są dostępne dla centrum miejsca aktywnego i odwrotnie, luźny sacharyd nie byłby dostępny dla miejsca aktywnego istniejącego we wnętrzu kieszeni wiążącej substrat.

Kieszonka wiążąca substrat i miejsce aktywne RdFucI. a Kieszeń wiążąca substrat powstaje w wyniku złożenia przez podjednostki A i C. b Powierzchnia elektrostatyczna kieszeni wiążącej substrat. c Prezentacja współczynnika B powierzchni wiążącej substrat. d Przekrojowy widok powierzchni kieszeni wiążącej substrat. e Mapa gęstości elektronowej 2Fo-F (szara siatka, konturowana przy 1.0 σ) na miejscach wiążących metal w RdFucI namoczonym w roztworze zawierającym 10 mM Mn2+. f Geometryczna analiza miejsc wiązania Mn2+ przez RdFucI

RdFucI wymaga jonów metali dwuwartościowych do swojej aktywności katalitycznej w reakcji izomeryzacji z wykorzystaniem mechanizmu ene-diolu . Miejsce wiązania metalu przez RdFucI powinno być koordynowane z Mn2+ przez konserwowane reszty Glu337, Asp359 i His528 (plik dodatkowy 12: Fig. S6). Nie ma jednak na mapie gęstości elektronowej Fo-Fc (liczonej przy > 5σ), którą podejrzewa się o wiązanie z Mn2+ jako metalem niezbędnym do wiązania substratu (plik dodatkowy 13: Fig. S7a). Analiza współczynnika B wykazała, że współczynnik temperaturowy Mn2+ (70,53 Å2) jest wyższy niż średni współczynnik temperaturowy białka (36.22 Å2), co wskazuje, że Mn2+ jest obecny na RdFucI z niskim obłożeniem. Wynik ten był zgodny z rezultatem analizy biochemicznej, w której natywny enzym wykazywał niski poziom aktywności. Z drugiej strony, dodanie Mn2+ znacząco zwiększyło aktywność katalityczną RdFucI (Tabela 1). Spekulowaliśmy więc, że dodanie Mn2+ do kryształu RdFucI zwiększy zajętość wiązania Mn2+. Po namoczeniu kryształów RdFucI w roztworze 10 mM Mn2+ zaobserwowano wiarygodną gęstość elektronową Fo-Fc (> 6σ) na miejscu wiązania metalu, gdzie pozycja Mn2+ została wyjaśniona we wszystkich podjednostkach (Fig. 6e i plik dodatkowy 13: Fig. S7b). Jednakże, temperaturowy współczynnik B dla Mn2+ (76.56 Å2) był wyższy niż dla całego białka (60.69 Å2), co sugeruje, że jon Mn2+ nie jest jeszcze w pełni zajęty w miejscu wiązania metalu. Mn2+ był koordynowany przez atomy OE1 (średnia odległość: 2,62 Å) i OE2 (2,65 Å) atomu Glu337, OD1 (2,72 Å) i OD2 (2,72 Å) atomu Asp361, NE2 (2,52 Å) atomu His528 oraz cząsteczkę wody (2,79 Å) (Rys. 6e). Średnie kąty wiązań Glu337(OE1)-Mn2+-Asp361(OD2), Glu337(OE1)-Mn2+-His528(NE2) i Asp361(OD1)-Mn2+-His528(NE2) wynosiły odpowiednio 127.32°, 86.25° i 73.96°. Kąt wiązania pomiędzy ligandami i Mn2+ wykazywał zniekształconą koordynację oktaedryczną.

Porównanie strukturalne z innymi l-FucIs

Serwer DALI został użyty do poszukiwania strukturalnych homologów. Wyszukiwanie to ujawniło, że RdFucI jest podobny do l-FucIs z E. coli (EcFucI, kod PDB 1FUI, Z score: 60.6, rmsd: 0.3 dla 587 atomów Cαs), Aeribacillus pallidus (ApFucI, 3A9R, Z score: 56.6, rmsd: 0.7 dla 580 atomów Cαs), oraz Streptococcus pneumonia (SpFucI, 4C20, Z score: 55.9, rmsd: 0.7 dla 585 atomów Cαs). Superpozycja kieszeni wiążącej substrat wykazała, że reszty wiążące metal: Glu337, Asp361 i His528 (ponumerowane w RdFucI) są pozycyjnie identyczne z pozostałymi białkami, natomiast reszty rozpoznające substrat (Arg16, W88, Gln300, Tyr437, Trp496 i Asn524) różnią się nieznacznie konformacyjnie w swoich łańcuchach bocznych (Rys. 7a). W szczególności, pętla α7-α8 każdego l-FucI, która leży na powierzchni kieszeni wiążącej substrat, ma inną konformację. Wyrównanie sekwencji l-FucIs wykazało duże podobieństwo, ale sekwencja pętli α7-α8 każdego l-FucI była wysoce zmienna (Rys. 7b). Ponieważ pętla α7-α8 jest zaangażowana w tworzenie architektury kieszeni wiążącej substrat, każdy l-FucI tworzy unikalną kieszeń wiążącą substrat (Rys. 7c). l-FucI powszechnie mają ujemnie naładowaną powierzchnię wokół miejsca wiążącego metal, ale powierzchnia kieszeni wiążącej substrat wykazuje różne stany naładowania (Rys. 7c). W rezultacie, różnice strukturalne pętli α7-α8 będą powodować różnice w specyficzności substratowej l-FucIs.

Porównanie strukturalne RdFucI z innymi l-FucIs. Superpozycja a miejsca aktywnego i b powierzchni wiązania substratu RdFucI z EcFucI (kod PDB: 1FUI), ApFucI (3A9R) i SpFucI (4C20). Zbliżenie na dużą różnicę konformacyjną pętli α8-α9 z l-FucIs (po lewej). c Częściowe wyrównanie sekwencji dla regionu pętli α8-α9 dla RdFucI oraz EcFucI, ApFucI i SpFucI. d Elektrostatyczne przedstawienie powierzchni RdFucI, EcFucI, ApFucI i SpFucI. Głęboka kieszeń wiązania substratu i regiony pętli α8-α9 zaznaczone są odpowiednio liniami pomarańczowymi i czarnymi. Miejsce wiązania metalu jest zaznaczone żółtą gwiazdką

.