W ciągu ostatniej dekady techniki chemogenetyczne i optogenetyczne zrewolucjonizowały neurobiologię integracyjną, dostarczając nowych narzędzi do odwracalnego manipulowania aktywnością specyficznych populacji lub systemów neuroprzekaźnikowych z większą selektywnością (Sternson i Roth, 2014; Roth, 2016; Wiegert i in., 2017). W porównaniu z optogenetyką, która umożliwia szybką i fazową modulację neuronów z wysoką rozdzielczością czasową, chemogenetyka pozwala na bardziej rozciągniętą modulację układów, co jest szczególnie przydatne w badaniach skupiających się na zjawiskach tonicznych (np. badanie implikacji dopaminy w procesach motywacyjnych; Whissell i in., 2016). Wśród narzędzi chemogenetycznych szerokie zastosowanie znajdują receptory projektowane, aktywowane wyłącznie przez leki projektowane (DREADDs), określane jako biologiczny system „wytrychów” do selektywnej manipulacji aktywnością komórek poprzez szlaki sygnałowe białek G. Po raz pierwszy bardzo elegancko opracowany przez grupę Rotha (Armbruster i in., 2007), ten receptor sprzężony z białkiem G (GPCR) jest receptorem muskarynowym: zamek, który został zmutowany, aby reagować tylko na N-tlenek klozapiny (CNO), klucz, pochodny metabolit atypowego leku przeciwpsychotycznego klozapiny, w przeciwnym razie z, potencjalnie, żadną aktywnością farmakologiczną.

Jednakże od 2016 roku niektóre publikacje podnoszą niepokojące kwestie dotyczące stosowania CNO. Po pierwsze, stosunkowo wysokie dawki CNO (10 mg/kg) podawane systemowo mogą wykazywać farmakologiczną aktywność pozatargetową, o czym świadczy indukcja efektów behawioralnych u szczurów i myszy niemediowanych przez DREADDs (MacLaren i wsp., 2016; Gomez i wsp., 2017; Baerentzen i wsp., 2019). Ponadto Gomez i wsp. (2017) wykazali, że CNO nie przekracza łatwo bariery krew-mózg, może wykazywać niskie powinowactwo wiązania z DREADD i była wstecznie metabolizowana do klozapiny, stając się prawdziwym efektorem DREADDs. W oparciu o te uderzające obserwacje zasugerowali oni bezpośrednie użycie małych dawek klozapiny (0,1 mg/kg) do aktywacji DREADD zamiast CNO. Jednak stosowanie niskich dawek klozapiny zamiast dużych dawek CNO stopniowo przekształcających się w klozapinę prowadzi do dwóch poważnych ograniczeń. Po pierwsze, nie jest oczywiste, że klozapina, w ostrym wstrzyknięciu lub przedłużonej dyfuzji, działa na DREADDs w ten sam sposób (Mahler i Aston-Jones, 2018). Po drugie, ponieważ klozapina jest atypowym środkiem przeciwpsychotycznym, ma liczne endogenne cele, takie jak receptory serotoninergiczne, muskarynowe lub dopaminergiczne, o stosunkowo silnym powinowactwie (Meltzer, 1989; Schotte i in., 1993; Brunello i in., 1995; Ashby i Wang, 1996; Armbruster i in., 2007) i prawdopodobnie wywołuje efekty pozatargetowe, nawet przy niskich dawkach. Rzeczywiście, dawka 0,1 mg/kg klozapiny zalecana do eksperymentów DREADD okazała się znacząco zwiększać zachowanie związane z lękiem u myszy (Manzaneque i in., 2002), jak również u szczurów (efekt, który również zaobserwowaliśmy; R. Goutaudier i S. Carnicella, niepublikowane obserwacje), gdzie klozapina wpływa również na lokomocję poprzez potencjalną sedację i upośledza elastyczność poznawczą (Ilg i in., 2018).

Ale występowanie tych efektów może zależeć od użytego gatunku, szczepu lub płci i może być bardzo dyskretne (ponieważ nie wszystkie wymiary behawioralne są dotknięte); mają one potencjał, aby znacząco zakłócić wydajność zwierząt w różnych zadaniach behawioralnych. Wysoki poziom stresu i lęku może być czynnikiem zakłócającym w badaniach nad pamięcią lub bólem, na przykład (Sousa i in., 2006; Sorge i in., 2014). Co więcej, zachowania związane z nadużywaniem leków lub zaburzeniami psychiatrycznymi, takimi jak schizofrenia, lęk czy elastyczność poznawcza, mogą modyfikować cały fenotyp (Floresco i in., 2009; Koob i Schulkin, 2018). W oparciu o te obserwacje konieczne są ważne środki ostrożności w przypadku klozapiny, aby uniknąć stronniczych badań behawioralnych.

Czy nowa cząsteczka zaprojektowana specjalnie dla DREADDs byłaby bardziej selektywna? Związek 21 (C21) jest syntetycznym ligandem DREADD, opracowanym w 2015 roku (Chen i in., 2015) i częściowo scharakteryzowanym in vitro, jak również in vivo w 2018 roku (Thompson i in., 2018). Ponownie, w niskich dawkach (<3 mg/kg), opisano, że jest on pozbawiony behawioralnych efektów off-target i zdolny do zmiany zachowania zwierząt wykazujących ekspresję DREADD. Badanie to zostało wzmocnione przez Jendryka i wsp. (2019), którzy przeprowadzili eksperymenty farmakokinetyczne i farmakodynamiczne z użyciem myszy i C21 (3 mg/kg). Wykazali, że 30 min po podaniu C21 stężenie cząsteczki w płynie mózgowo-rdzeniowym było >10 razy większe niż szacowane EC50 dla aktywacji DREADD (CSF = 40 nm i EC50DREADDs = 3 nm), i to bez wstecznej metabolizacji do klozapiny. Jednak wyniki niedawnego badania BioRxiv preprint u szczurów, myszy i makaków (Bonaventura et al., 2018) sugerują, że chociaż C21 wykazuje niską penetrację mózgu, dawka 1 mg/kg może już modyfikować funkcje mózgu u myszy typu dzikiego. Ponadto słabe powinowactwo i zajętość dla DREADDs zaobserwowano in vitro w plastrach mózgu szczura, a także in vivo u myszy i makaków w badaniu pozytonowej tomografii emisyjnej. W oparciu o te same badania eksperymentalne, co w przypadku C21, zaproponowali oni jako alternatywę dwa inne ligandy, JHU37152 i JHU37160, które posiadają wyższą siłę działania in vivo na DREADDs i potencjalnie mniej efektów off-target (Bonaventura i in., 2018). Chociaż ta nowa generacja ligandów DREADD wydaje się obiecująca, ze względu na ich nowość, są one nadal słabo scharakteryzowane i pozostają strukturalnie homologiczne do klozapiny i CNO. Wyczerpująca charakterystyka w badaniu komórkowym i behawioralnym będzie zatem kluczowa, aby wykluczyć potencjalne pułapki znalezione dla CNO.

Alternatywnym rozwiązaniem dla poprawy selektywności podejść chemogenetycznych byłoby użycie innej kombinacji zamka i klucza. Jako taki, receptor κ-opioidowy-DREADD (KORD) jest zmutowanym hamującym GPCR wywodzącym się z ludzkiego receptora κ-opioidowego (Vardy i in., 2015). W porównaniu z klasycznymi DREADD, które wiążą klozapinę, CNO, C21 lub związki JHU, KORD jest angażowany przez salwinorynę B, narkotyczny metabolit selektywnego agonisty KOR – salwinoryny A. Chociaż to chemogenetyczne podejście zostało elegancko wykorzystane w połączeniu z aktywującym DREADD, aby stworzyć system „ON i OFF” w obrębie tej samej populacji neuronów (Vardy i in., 2015, Aldrin-Kirk i in., 2016), pozostaje ono marginalnie wykorzystywane, ponieważ jedynie zmniejsza aktywność neuronów w krótkim okresie czasu (Aldrin-Kirk i Björklund, 2019). Ponadto salwinoryna B wykazuje pewne powinowactwo do endogennego KOR w wysokich stężeniach i nie doczekała się jeszcze dogłębnej charakterystyki, jak to jest obecnie wykonywane w przypadku związków związanych z DREADD (Roth, 2016). Zastąpienie GPCR przez zmutowany kanał jonowy, inny alternatywnie zaprojektowany receptor zwany ligand-gated ion channels (LGICs) jest opcją opracowaną przez laboratorium Stensona (Magnus i in., 2011). W porównaniu z DREADDs, LGICs łączą domenę wiążącą ligand zmutowanego receptora nikotynowego z domeną porów jonowych innego wybranego receptora, tworząc chimeryczny kanał jonowy. Podobnie jak w przypadku DREADD, ten hybrydowy kanał jest aktywowany przez małego agonistę pochodzącego z chinuklidynylo-benzamidu, agonisty nikotynowego receptora acetylocholinowego α7, i umożliwia wymianę jonów przez błonę neuronu. Wśród innych ograniczeń specyficznych dla tego podejścia (Aldrin-Kirk i Björklund, 2019), dzieli ono również z DREADDs użycie farmakologicznego liganda, który może potencjalnie oddziaływać z endogennymi receptorami, w zależności od warunków eksperymentalnych. Wreszcie, wszystkie te blokady wywodzą się z endogennych receptorów i jako takie nie pozbywają się ograniczeń nieodłącznie związanych z farmakologią.

Poza tymi ostatnimi osiągnięciami i pytaniami, które pozostają, należy zadać kluczowe pytanie: czy kiedykolwiek zostanie znaleziony całkowicie selektywny i obojętny klucz? Prawdopodobnie nie. Należy pamiętać, że DREADDs są narzędziami chemogenetycznymi łączącymi genetykę i farmakologię. Chociaż podejścia genetyczne oferują potężną kontrolę ekspresji blokad (tj. DREADDs) w określonych populacjach komórek, lub subpopulacjach z podejściami warunkowymi, wywodzą się one z endogennych GPCRs i jako takie podlegają tym samym ograniczeniom, co klasyczna farmakologia dla klucza. Dlatego jest mało prawdopodobne, że zostaną znalezione cząsteczki, które będą wykazywać wysokie powinowactwo wiązania do DREADDs bez powinowactwa do niektórych z licznych receptorów, które są już obecne w mózgu i są blisko związane z DREADDs. Na przykład klozapina ma bardzo wysokie powinowactwo do DREADDs, ale także do receptora serotoninergicznego 5-HT2 (Ki = 10-8 dla obu; Armbruster i in., 2007; Gomez i in., 2017), a także wysokie powinowactwo do szerokiego zakresu innych GPCRs (Ki = 10-7 do 10-6; Armbruster i in., 2007). Nawet syntetyczne ligandy, które są specjalnie zaprojektowane dla tej techniki chemogenetycznej, wykazują znaczne powinowactwa do endogennych receptorów. Na przykład, chociaż JHU37152 i JHU37160 mają niższe powinowactwo do receptorów 5-HT niż klozapina, mają ogólnie podobny profil docelowy do tego leku, z jeszcze wyższym powinowactwem do receptorów muskarynowych (Bonaventura i in., 2018), co sugeruje potencjalnie silniejsze efekty off-target. C21 wykazuje również wyższe powinowactwo do histaminergicznego receptora H1 niż do DREADDs (Ki > 10-8 i Ki = 10-7,2, odpowiednio; Thompson i in., 2018) oraz większy potencjał wiązania do receptorów opioidowych niż klozapina (Bonaventura i in., 2018). Aby zminimalizować pułapki tego potężnego podejścia, niezależnie od kluczowego wyboru, należy podjąć krytyczne środki ostrożności (ryc. 1).