NS2B-NS3 protease

Dane dotyczące struktury trójwymiarowej (3D) docelowego białka zostały ustanowione jako podstawowy wymóg w odkrywaniu leków. Zarówno struktury krystalograficzne X-ray, jak i modele homologiczne generowane dla białek docelowych były wykorzystywane do identyfikacji potencjalnych ligandów z chemicznych baz danych, ale struktury krystalograficzne 3D okazały się bardziej efektywne niż modele homologiczne generowane in silico. Dlatego struktura 3D proteazy DENV NS2B-NS3, która została zaproponowana jako główny cel terapeutyczny przeciwko infekcji DENV, została pobrana z banku danych białek (PDB) z PDB ID:2FOM40. Struktura krystaliczna NS2B-NS3pro została uzyskana w rozdzielczości 1,5 Å i zawierała dwa łańcuchy białkowe, tj. łańcuch A tworzący kofaktor NS2B i łańcuch B zawierający domenę NS3pro (Rys. 2a). Domena proteazy (NS3pro) w łańcuchu B (Rys. 2b) została wybrana do wirtualnych badań przesiewowych opartych na strukturze z wybranymi triterpenoidami z G. lucidum.

3D struktura proteazy DENV NS2B-NS3: (a) diagram wstęgowy dwóch łańcuchów białkowych; łańcuch A (zielony kolor) przedstawia kofaktor NS2B, a łańcuch B (czerwony kolor) reprezentuje domenę NS3pro, oraz (b) graficzne przedstawienie domeny NS3pro proteazy DENV oznaczone całkowitą liczbą reszt aminokwasowych, atomów, ciężkich atomów i ładunku netto, oraz przewidywane elementy struktury drugorzędowej (rurka = helisa alfa, strzałki = arkusze beta).

Wirtualne badania przesiewowe i analiza symulacji dokowania

Ostatnio wirtualne badania przesiewowe oparte na strukturze zyskały popularność w celu odkrycia nowych związków wiodących z dużych bioaktywnych bibliotek chemicznych przeciwko wybranym celom. Podejście to obejmuje symulację dokowania ligandów w regionie miejsca aktywnego wybranego receptora, a następnie ranking i ocenę punktową inhibitorów23. W niniejszej pracy przeprowadziliśmy wirtualne badania struktury 22 znanych przeciwwirusowych triterpenoidów z G. lucidum wobec NS3pro przy użyciu modułu Glide pakietu Schrodingera (Tabela S1). Inhibitory te były dalej analizowane przez protokół dokowania XP modułu Glide w celu zebrania informacji o energii wiązania, jak również dodatkowych wzorów wiązania z resztami miejsca aktywnego. Zaobserwowano, że wszystkie wybrane triterpenoidy wykazywały znaczące powinowactwa wiążące wobec NS2B-NS3pro z wyjątkiem kwasu ganoderowego G (Tabela S1). Również dokowanie molekularne inhibitora referencyjnego 1,8-dihydroksy-4,5-dinitroantrachinonu w stosunku do tego samego miejsca aktywnego dało wynik dokowania -5,377 kcal/mol. Dlatego do analizy oddziaływań molekularnych wybrano triterpenoidy z wynikami dokowania lepszymi niż próg -5 kcal/mol. Wybraliśmy w sumie cztery triterpenoidy, tj. Ganodermanontriol (-6,291 kcal/mol), Lucidumol A (-5,993 kcal/mol), kwas ganoderowy C2 (-5,948 kcal/mol) i kwas ganosporowy A (-5,830 kcal/mol) jako możliwe inhibitory dla domeny NS3pro proteazy DENV. Wyniki te zostały uznane za znaczące w porównaniu do znanego inhibitora 1,8-dihydroksy-4,5-dinitroantrachinonu (-5,377 kcal/mol) i zgłoszonych bioaktywnych cząsteczek Nimbiny (-5,56 kcal/mol), Desacetylnimbiny (-5,24 kcal/mol) i Desacetylsalanniny (-3,43 kcal/mol) z Azadirachta indica z DENV NS3pro41. Wyniki te wskazują na potencjał bioaktywnych triterpenoidów z G. lucidum jako inhibitorów proteazy DENV i sugerują, że mogą one być wykorzystane w rozwoju leków przeciwwirusowych w infekcji DENV.

Interakcje molekularne i analiza MM/GBSA

Ponieważ kontakty molekularne w zadokowanych kompleksach białko-ligand mogą prowadzić do lepszego zrozumienia mechanizmów molekularnych w układach biologicznych42, zbadano również profilowanie kontaktów molekularnych dla wybranych triterpenoidów i inhibitora referencyjnego z proteazą DENV. Kompleks NS3pro-Ganodermanontriol wykazywał interakcję poprzez umiarkowane pojedyncze i podwójne wiązania wodorowe w regionie aktywnym odpowiednio z resztami Lys73 (3 Å), Thr120 (2.94 Å) i Asn167 (3.26 Å, 2.86 Å). W kompleksie NS3pro-Ganodermanontriol odnotowano również dodatkowe atrakcje hydrofobowe przy resztach Trp50, Val72, Ile123, Val154, Val155 i Ala164. Również reszty His51, Thr118, Asn119, Thr120, Asn152, Asn167 i Gly153 wykazywały odpowiednio polarne i glicynowe oddziaływania z Ganodermanontriolem. W dokowanym kompleksie NS3pro-Ganodermanontriol odnotowano również oddziaływania z resztami o ładunku dodatnim (Lys73 i Lys74) i ujemnym (Asp75) (Rys. 3a,b).

3D i 2D zadokowane kompleksy domeny NS3pro wykazujące kontakty międzycząsteczkowe z odpowiednimi badanymi triterpenoidami; (a,b) kompleks NS3pro-Ganodermanontriol, (c,d) kompleks NS3pro-Lucidumol A, (e,f) NS3pro-Kwas ganoderynowy C2 (g,h) NS3pro-Kwas ganosporowy A. W kompleksach 2D reszty w kolorach zielonym, fioletowym, czerwonym, niebieskim i szarym reprezentują odpowiednio oddziaływanie hydrofobowe, dodatnie, ujemne, polarne i glicynowe, a różowe strzałki pokazują tworzenie wiązań wodorowych.

Profile interakcji NS3pro-Lucidumol A odzwierciedlały dwa pojedyncze wiązania wodorowe utworzone z resztami Asp75 (3,31 Å) i Asn152 (2,48 Å) oraz tworzenie podwójnych wiązań wodorowych przy Gly153 (2,11 Å, 2,84 Å), co również przyczynia się do interakcji glicyny z resztami Gly151. Ponadto, w zadokowanym kompleksie odnotowano również oddziaływania hydrofobowe (Val72, Leu128, Phe130, Pro132, Tyr150, Val154 i Tyr161) oraz polarne (His51, Ser135 i Asn152). Asp75 wykazuje oddziaływania o ładunku ujemnym w kieszeni aktywnej proteazy z Lucidumolem A (Rys. 3c,d). Również zadokowany kwas ganoderynowy C2 w kompleksie z NS3pro wykazywał umiarkowane tworzenie podwójnych wiązań wodorowych z Gly151 (2,73 Å, 3,12 Å), podczas gdy pojedyncze wiązania wodorowe obserwowano przy resztach Trp50 (2,66 Å) i Arg54 (1,93 Å). Ponadto w kompleksie tym odnotowano również tworzenie mostków solnych pomiędzy grupą hydroksylową C2 kwasu ganoderowego a reszt± Arg54 proteazy. Ponadto, w dokowanym kompleksie NS3pro – kwas ganoderowy C2 odnotowano również oddziaływania polarne (reszty His51 i Asn152), negatywne (reszty Asp75) i pozytywne (reszty Arg54) (Rys. 3e,f). W zadokowanym kompleksie NS3pro – kwas ganosporowy A stwierdzono trzy pojedyncze wiązania wodorowe utworzone przy resztach Thr120, Asn152 i Asn167, natomiast Trp50, Val72, Ile123, Val154, Val155 i Ala164 oznaczono jako wykazujące oddziaływania hydrofobowe (Rys. 3g,h). Ponadto, zadokowany NS3pro z kwasem ganosporerowym A wykazywał oddziaływania polarne (reszty Thr118,Asn119,Thr120, Asn152 i Asn167), dodatnie (Lys73 i Lys74) i o ładunku ujemnym (Asp75).

Dodatkowo, inhibitor referencyjny, 1,8-dihydroksy-4,5-dinitroantrachinon, został również zadokowany w miejscu aktywnym proteazy NS3pro i odnotowano znaczące interakcje. Kompleks ten wykazuje tworzenie pojedynczego wiązania wodorowego przy reszcie Phe130, natomiast His51 wykazuje mostek solny i oddziaływanie pi-pi z inhibitorem. Ponadto w dokowanym kompleksie zaznaczono również oddziaływania hydrofobowe (Leu128, Phe130, Pr0132, Tyr150 i Tyr151), polarne (His51, Ser131 i Ser135) oraz glicynowe (Gly151 i Gly153).

Wyciągnięto wniosek, że wszystkie badane triterpenoidy wykazywały wiązanie wodorowe z NS3pro w triadzie katalitycznej (His51, Asp75 i Ser135), wraz z kilkoma innymi konserwowanymi resztami (Phe130, Tyr150, Asn152 i Gly153), które według doniesień odgrywają znaczącą rolę w wiązaniu substratów dla proteazy DENV43,44. Ponadto, niektóre dodatkowe reszty zostały również zarejestrowane jako posiadające wspólne wiązania wodorowe z różnymi ligandami. Obserwacje te sugerują, że wiązania wodorowe pomiędzy ligandem a jedną z reszt triady katalitycznej NS3pro mogą zaburzać transfer elektronów pomiędzy grupami karboksylowymi i imidazolowymi odpowiednio reszt Asp75 i His51. Według doniesień, takie zaburzenie prowadzi do przerwania ataku nukleofilowego na grupę hydroksylową (ß-OH) reszty Ser135, która jest niezbędna do inicjacji aktywności proteolitycznej43,44. W związku z tym stwierdzono, że badane triterpenoidy mogą wykazywać silne powinowactwo do domeny NS3pro DENV poprzez różne interakcje międzycząsteczkowe i zasugerowano, że mogą one działać jako leki przeciwko infekcji DENV poprzez inhibicję NS2B-NS3pro.

Ponadto, zadokowane kompleksy wszystkich czterech triterpenoidów, Ganodermanontriolu, Lucidumolu A, kwasu ganoderowego C2 i kwasu ganosporowego A z DENV NS3pro były również analizowane przy użyciu obliczeń MM/GBSA w celu obliczenia powinowactwa wiązania odpowiednich ligandów w miejscu aktywnym. Obliczenia te wykazały stosunkowo ujemne wartości MM/GBSA dla wszystkich czterech zadokowanych kompleksów, tj. NS3pro-Ganodermanontriol (-24.465 kcal/mol), NS3pro-Lucidumol A (-19.735 kcal/mol), NS3pro-Kwas Ganoderowy C2 (-19.039 kcal/mol) i NS3pro-Kwas ganosporowy A (-11,449 kcal/mol), podczas gdy kompleks inhibitora referencyjnego NS3pro-1,8-dihydroksy-4,5-dinitroantrachinon dawał większą wartość (-38,934 kcal/mol). Obserwacje te sugerują, że aktywność inhibicyjna wybranych triterpenoidów wobec NS3pro może być słabsza niż inhibitora referencyjnego, ale również sugerują, że silniejsze powinowactwo wiązania Ganodermanontriolu z NS3pro w porównaniu z innymi triterpenoidami było poparte przewidywanymi wynikami dokowania. Ponadto, przewidywane wartości ΔG oraz składowe fizykochemiczne, czyli ΔGBind Coulomb, ΔGBind kowalencyjne, ΔGBind vdW (siły van der Waalsa), ΔGBind Solv SA (powierzchnia dostępna dla rozpuszczalnika) oraz ΔGBind Solv GB (energia solwatacji uogólniona Borna) analiza dla wybranych triterpenoidów i kontroli pozytywnej kompleksowanych z białkiem DENV NS3pro wskazuje, że, w zależności od ligandu, ΔGBind Coulomba i/lub ΔGBind vdW miały największy wpływ na stabilność kompleksów triterpenoidów i inhibitorów wzorcowych z białkiem DENV NS3pro. (Rys. 4, S2, Tabela S2). Stąd, Ganodermanontriol został uznany za najbardziej obiecujący funkcjonalny triterpenoid dla białka DENV NS3pro i dalej analizowany wraz z innymi triterpenoidami przy użyciu dynamiki molekularnej i analizy in vitro.

Wolna energia wiązania (kcal/mol) obliczona metodą MMGBSA dla przesiewanych triterpenoidów tj. (a) Ganodermanontriolu, (b) Lucidumolu A, (c) kwasu ganoderowego C2 i (d) kwasu ganosporerowego A kompleksowanych z proteazą DENV NS2B-NS3 po symulacji dokowania molekularnego.

Analiza dynamiki molekularnej (MD)

Informacje o interakcjach przewidywanych na linii cel-ligand obliczone przy użyciu metody dokowania molekularnego mogą być dalej potwierdzone przez symulację dynamiki molekularnej i badania krystalograficzne38,41. W tym przypadku stabilność wybranych kompleksów triterpenoid-NS3pro została oceniona przy użyciu 10 ns symulacji MD pod względem odchylenia średniokwadratowego (RMSD), fluktuacji średniokwadratowej (RMSF) i analizy mapy kontaktu białko-ligand.

Analiza RMSD atomów C-alfa i szkieletu w DENV NS3pro skompleksowanym ze wszystkimi czterema ligandami wykazała stabilne i akceptowalne odchylenia podczas 10 ns symulacji MD (Rys. 5). Co ciekawe, końcowa fluktuacja dla receptora została zarejestrowana jako <2 Å RMSD, podczas gdy inhibitor Ganodermanontriolu wykazał stabilne i maksymalne odchylenie 6 Å w kompleksie z domeną NS3pro na końcu przedziału symulacji (Rys. 5a). Również RMSF obliczone zarówno dla poszczególnych reszt receptora jak i atomów liganda wykazywały tolerancyjne zmiany (poniżej 2.8 Å) podczas przedziału symulacji (Rys. S3a, S4a). Jednakże, nieistotne fluktuacje RMSF zaobserwowano również w przedziale czasowym od 5 do 7 ns w grupach ketonowych i metylowych pierścienia cyklopenta-fenantren-7-onu liganda (Rys. S3a).

RMSD dla atomów węgla alfa białka NS3pro i triterpenoidów z G. lucidum jako ligand, (a) NS3pro-Ganodermanontriol, (b) NS3pro-Lucidumol A, (c) NS3pro-Kwas ganoderynowy C2 i (d) NS3pro-Kwas ganosporowy A, w trajektorii 10 ns symulacji MD.

Podobnie, analiza RMSD dla kompleksu NS3pro-Lucidumol A ujawniła, że zarówno receptor jak i ligand wykazywały zmiany mniejsze niż 3 Å podczas przedziału symulacji 10 ns (Rys. 5b). Tymczasem analiza RMSF zarówno dla NS3pro jak i Lucidumolu A przewidywała zmiany <3 Å, dopuszczalne odchylenia odnotowano również dla grupy metylowej i hydroksylowej w regionie heptanowym liganda w przedziale symulacji 10 ns (Rys. S3b). Podobnie, ligand w kompleksie NS3pro – kwas ganoderynowy C2 wykazywał akceptowalne odchylenia podczas początkowych 2-5 ns, po których następowała stabilność, a końcowe odchylenie odnotowano na poziomie mniejszym niż 8 Å podczas przedziału symulacji 10 ns (Rys. S4b).

Kompleks NS3pro – kwas ganoderynowy C2 również wykazywał nieistotne odchylenia w receptorze pomiędzy 2-5 ns, po których następowała stabilność, a końcowe odchylenie odnotowano na poziomie mniejszym niż 1.75 Å podczas przedziału symulacji (Rys. 5c). Te akceptowalne odchylenia w ligandzie (mniej niż 6 Å) i receptorze (3 Å) zostały również potwierdzone przez obliczone RMSF dla odpowiednich kompleksów (Rys. S3c, S4c).

Na podstawie krzywych trajektorii symulacji wygenerowano również mapę oddziaływań białko-ligand opisującą udział poszczególnych reszt w wiązaniu międzycząsteczkowym (Rys. 6). Mapa oddziaływań białko-ligand dla kompleksu NS3pro-Ganodermanontriol wykazała udział reszt Met49, Val72, Lys73, Lys74, Asp75, Leu76, Trp83, Glu88, Thr118, Thr120, Ile123, Val147, Leu149, Asn152, Gly153, Val154, Val155, Ala164, Ile165, Ala166 i Asn167, tworzących wiązania wodorowe, atrakcje hydrofobowe, oddziaływania jonowe i mostki wodne (Rys. 6a). 6a). Reszty Leu149 i Asn152 zostały wyróżnione jako tworzące mostki wodne i przyciągające wiązania wodorowe w przedziale symulacji 10 ns (Rys. 6a). Rezydencja Asn152 była również przewidywana do tworzenia wiązań wodorowych w kompleksie dokowanym (Rys. 3a,b), co sugeruje znaczenie tej reszty w NS3pro dla interakcji z Ganodermanontriolem.

Normalizowany wykres słupkowy dla kompleksów dokowanych, tj.(a) NS3pro-Gandomanontriol, (b) NS3pro-Lucidumol A, (cc) NS3pro-Ganoderic acid C2 i (d) NS3pro-Ganosporeric acid A z różnymi kontaktami i profilami interakcji obliczonymi podczas symulacji MD. Wartości frakcji interakcji >1.0 są prawdopodobne, ponieważ niektóre reszty tworzą wiele oddziaływań podobnego podtypu.

Mapa interakcji NS3pro-Lucidumol A wykazywała udział His51, Arg54, Val72, Lys73, Lys74, Asp75, Leu128, Asp129, Phe130, Pro132, Ser135, Tyr150, Gly151, Asn152, Gly153, Val154, Val155, Tyr161 i Asn167 w wiązaniach wodorowych, oddziaływaniach hydrofobowych i mostkach wodnych, przy czym reszty Asp75 i Gly153 miały największy udział odpowiednio w tworzeniu mostków wodnych i wiązań wodorowych (rys. 6b). 6b). Analiza dockingu molekularnego również sugerowała rolę Gly153 w wiązaniu wodorowym z ligandem (Rys. 3c,d), co wskazuje na znaczenie tej reszty w stabilności białko-ligand. Ponadto, reszty Tyr161, Asp75 i Leu128 również wykazały swój udział w oddziaływaniach z ligandem, odpowiednio: pośrednictwo wody, wiązanie wodorowe i oddziaływania hydrofobowe (Rys. 6b). Wyniki te sugerują, że Gly153, Tyr161, Asp75 i Leu128 były w znacznym stopniu odpowiedzialne za stabilną konformację kompleksu NS3pro-Lucidumol A w czasie symulacji.

W tym samym czasie kompleks NS3pro-Kwas ganoderynowy C2 wykazywał udział reszt Lys28, Ile36, Trp50, His51, Arg54, Val72, Lys74, Asp75, Leu128, Asp129, Phe130, Ser131, Pro132, Ser135, Tyr150, Gly151, Asn152, Gly153, Val155 i Tyr161 w różnych oddziaływaniach molekularnych w mapowaniu białko-ligand podczas symulacji (Rys. 6c). Co ciekawe, główne oddziaływanie międzycząsteczkowe było udziałem Arg54 poprzez tworzenie wiązań wodorowych, a następnie mostków wodnych i przyciągania jonowego (Rys. 6c). Ta reszta została również przewidziana w analizie dokowania molekularnego jako tworząca dwa wiązania wodorowe z kwasem ganoderowym C2 (Rys. 3e,f), co sugeruje, że jest ona kluczowym czynnikiem dla utrzymania stabilności ligandu docelowego podczas symulacji.

Podobnie profil interakcji NS3pro z kwasem ganoderonowym A wykazał, że reszty Try50, His51, Arg54, Asp71, Val72, Lys73, Lys74, Asp75, Thr118, Asn119, Thr120, Gly121, Thr122, Ile123, Gly151, Asn152, Gly153, Val154, Val155, Tyr161 i Asn167 aktywnie uczestniczyły w tworzeniu mostków wodnych, oddziaływań hydrofobowych i jonowych (Rys. 6d). Natomiast reszty Lys73, Lys74, Val155 i Asn167 miały największy wkład w stabilność NS3pro skompleksowanego z ligandem A kwasu ganosporowego poprzez wiązania wodorowe, a następnie mostki wodne, oddziaływania hydrofobowe i jonowe (Rys. 6d). Również Asn167 został oznaczony jako wykazujący tworzenie wiązań wodorowych z kwasem ganosporowym A w dokowanym kompleksie, ujawniając jego znaczący udział w stabilności kompleksu. Wyniki te potwierdziły i zasugerowały znaczącą stabilność każdego z triterpenoidów z domeną NS3pro proteazy DENV w zadokowanych kompleksach. Stąd, ponownie zasugerowano, że te triterpenoidy mogą być wykorzystane w formułowaniu leków przeciwko infekcji DENV.