Zwykłe podejście do badania funkcji genów polega na wprowadzeniu lub inaktywacji genu w komórce lub osobniku i obserwowaniu zmian w biologicznym zachowaniu komórki lub fenotypów osobnika w celu zidentyfikowania jego funkcji.

Badanie funkcji genu może być zatem prowadzone zgodnie z następującymi dwoma rodzajami strategii:

• Utrata funkcji

• Zyskiwanie funkcji

Utrata funkcji

Nukanie genów jest jedną z najczęściej stosowanych metod badania utraty funkcji u myszy. Nokaut genowy odnosi się do odkrywania biologicznych funkcji genów docelowych poprzez badanie organizmów, które noszą inaktywowane (znokautowane) geny docelowe. Technika ta wymaga wprowadzenia zmian w częściowych sekwencjach genów docelowych, które wyłączają funkcje określonych genów i w ten sposób inaktywują część lub całość funkcji genów docelowych. Nokaut genowy można dalej podzielić na konwencjonalny nokaut genowy i warunkowy nokaut genowy.

Konwencjonalny nokaut genowy

• Konwencjonalny nokaut genowy (skrót: KO) odnosi się do nokautu pewnych istotnych eksonów, domen funkcjonalnych genu docelowego lub nawet wszystkich eksonów, we wszystkich komórkach myszy, powodując w ten sposób utratę ekspresji genu docelowego.Myszy

• KO przenoszą zmodyfikowane sekwencje genów docelowych we wszystkich tkankach i komórkach. Geny docelowe nie ulegają ekspresji u myszy homozygotycznych

• MyszyKO są zwykle używane do badania wpływu genów docelowych lub funkcji białek na fizjologię lub patologię.

Conditional Gene knockout

• Conditional Knockout (skrót: CKO) jest czasowo i przestrzennie specyficzną inżynierią genomu myszy poprzez ograniczenie inżynierii genowej do pewnych określonych typów komórek myszy lub do określonego etapu rozwoju

• Celowanie genowe jest stosowane u myszy CKO w celu oflankowania jednego lub kilku ważnych eksonów genu docelowego miejscami loxP. Ekspresja genu docelowego była prawidłowa przed skrzyżowaniem z rekombinazą Cre. Kiedy hoduje się myszy transgeniczne z rekombinazą Cre, gen docelowy może zostać znokautowany w określonej tkance lub typie komórek, a jego ekspresja pozostanie prawidłowa w innych tkankach lub typach komórek.

• Myszy KO są ogólnie używane do badania genów powodujących letalność embrionalną, funkcji docelowych genów lub białek w określonej tkance lub typie komórki, lub roli docelowych genów lub białek w określonym okresie lub etapie.

Przypadek: Zastosowanie modeli mysich Drd2 KO i Drd2 CKO w badaniach odpowiedzi immunologicznej mózgu

Zyskiwanie funkcji

Badanie funkcji genu poprzez obserwację zmian w cechach biologicznych komórki lub osobnika, do którego wprowadzono gen docelowy w celu wygenerowania nowego lub wyższego poziomu ekspresji.

Random transgene

Random insertion transgenesis jest losową integracją egzogennego genu do genomu myszy w celu wygenerowania modeli myszy z nadekspresją genu docelowego. Stosuje się ją do badania wpływu nadekspresji genów docelowych na fizjologię i patologię.

Nadekspresja genów docelowych

Egzogenna sekwencja DNA ulega stabilnej ekspresji u myszy po wbiciu jej do mysiego locus genowego Gt (ROSA) 26Sor znanego również jako Rosa26. Ekspresja egzogennego genu może być również specyficzna tkankowo lub indukowana lekami.

• Użyteczny do eksperymentów nadekspresji funkcji genów i białek

• Może być użyty do eksperymentów ratunkowych dla fenotypów KO

Knock-in genu

Knock-in (skrót: KI) odnosi się do wprowadzenia specyficznych mutacji lub egzogennych sekwencji DNA w miejscu docelowego genu.

(1) Wprowadzenie mutacji zasadowej do genu docelowego w celu naśladowania modelu choroby genetycznej u człowieka.

(2) Wprowadzenie genu reporterowego, takiego jak EGFP, RFP, mCherry, YFP, LacZ i Luciferase, do endogennego genu u myszy w celu obserwacji wzorca ekspresji genu docelowego.

.