DDRGK1 is required for ER homoeostasis

Aby zrozumieć komórkową funkcję DDRGK1, zbadaliśmy efekty knockdownu DDRGK1 przy użyciu mieszaniny dwóch siRNA, jak opisano wcześniej21. Stwierdziliśmy, że knockdown DDRGK1 indukował apoptotyczną śmierć komórek zarówno w komórkach MCF7, jak i HepG2, charakteryzowaną przez barwienie Annexin V/PI (ryc. 1a), aktywację kaspazy-3 i rozszczepienie PARP (ryc. 1b). Należy zauważyć, że możemy wykryć rozszczepienie kappazy-3 w komórkach HepG2 indukowane przez knockdown DDRGK1, ale nie w komórkach MCF7, ponieważ komórki MCF7 są pozbawione kaspazy-322. Ilościowa analiza real-time PCR (Q-PCR) wykazała, że knockdown DDRGK1 zwiększył ekspresję pro-apoptotycznych genów BAX, BAK, NOXA, DR5 i Bid, podczas gdy ekspresja anty-apoptotycznego genu Bcl-2 została zmniejszona (Rys. 1c,d). Co ważne, odkryliśmy, że knockdown of DDRGK1 w komórkach MCF7 i HepG2 indukował reakcje stresu ER, ze zwiększoną ekspresją genów BiP, HSPA8 i CHOP specyficznych dla stresu ER (Fig. 1e,f).

(a) Komórki MCF7 i HepG2 były transfekowane albo kontrolnym siRNA albo siRNA skierowanym przeciwko DDRGK1 przez 72 h. Komórki były następnie barwione Aneksyną V i PI i poddawane analizie cytometrycznej przepływu, po której następowała kwantyfikacja komórek apoptotycznych (Aneksyna V+). (b) Analiza Western blot PARP i rozszczepionej kaspazy-3 w kontrolnych i pozbawionych DDRGK1 komórkach MCF7 i HepG2 opisanych w a. (c,d) Analiza Q-PCR względnego poziomu ekspresji mRNA BAX, BAK, NOXA, Bid, DR-5 i Bcl-2 w kontrolnych i pozbawionych DDRGK1 komórkach MCF7 i HepG2. (e,f) Analiza Q-PCR względnego poziomu ekspresji mRNA BiP, HSPA8 i CHOP w kontrolnych i pozbawionych DDRGK1 komórkach MCF7 i HepG2. Wszystkie dane przedstawione są jako średnie±s.d. z trzech eksperymentów. *P<0,05, **P<0,01 i ***P<0,001 przez test t-Studenta.

Aby dodatkowo potwierdzić, że DDRGK1 jest zaangażowana w odpowiedź na stres ER, określiliśmy wpływ DDRGK1 na przeżycie komórek po traktowaniu induktorami stresu ER: thapsigargin (Tg) i tunicamycin (Tm). Znokautowanie DDRGK1 nasiliło apoptozę indukowaną stresem ER przez Tg w komórkach HepG2 i MCF7, ocenianą przez barwienie Aneksyną V/PI oraz rozszczepianie kaspazy-3 i PARP (Rys. 2a-c i Uzupełniające Rys. 1A-C). W przeciwieństwie do tego, nadekspresja DDRGK1 zmniejszyła indukowaną stresem ER śmierć komórek HepG2 (Rys. 2d-f). Ponadto, żywotność komórek MCF7 została oceniona testem MTT, a wyniki pokazały, że knockdown DDRGK1 sprawił, że komórki były bardziej wrażliwe na leczenie Tg lub Tm, z obniżoną żywotnością komórek (Supplementary Fig. 1D), podczas gdy nadekspresja DDRGK1 promowała przeżycie komórek po leczeniu Tg lub Tm (Supplementary Fig. 1E). Łącznie, nasze wyniki sugerują, że DDRGK1 odgrywa istotną rolę w regulacji homoeostazy ER.

(a). Komórki HepG2 poddano transfekcji z kontrolnym siRNA lub z siRNA przeciwko DDRGK1 przez 72 h, a następnie komórki traktowano DMSO (kontrola pojazdu) lub Tg (2,5 μM) przez 24 h przed zbiorem. Komórki barwiono aneksyną V i PI, a następnie poddawano analizie cytometrycznej. (b). Quantification of the apoptotic cells (Annexin V+) in a. (c) Western blot analysis of PARP and cleaved caspase-3 in the HepG2 cells described in a. (d) HepG2 cells were transfected with control vector or DDRGK1 for 36 h, and the cells were treated with DMSO or Tg (2.5 μM) for 24 h before harvesting. Komórki barwiono aneksyną V i PI, a następnie przeprowadzano analizę cytometryczną przepływu. (e) Quantification of the apoptotic cells (Annexin V+) in d. (f) Western blot analysis of PARP and cleaved caspase-3 in the HepG2 cells described in d. Wszystkie dane przedstawione są jako średnie±s.d. z trzech eksperymentów. **P<0,01 i ***P<0,001 testem t-Studenta.

DDRGK1 moduluje UPR

Aby zrozumieć, w jaki sposób DDRGK1 reguluje homoostazę ER, najpierw przeanalizowaliśmy zmiany w poziomach białek trzech czujników UPR i ich celów downstream w komórkach pozbawionych DDRGK1. Wyniki wykazały, że knockdown DDRGK1 w komórkach MCF7 i HepG2 znacząco obniżył poziom całkowitego IRE1α, ale słabo obniżył poziom fosforylowanego IRE1α (p-IRE1α), co może wynikać z obniżonego poziomu całkowitego IRE1α (Rys. 3a). Poziomy ATF6 i rozszczepionego ATF6 nie uległy zmianie (Rys. 3a). Co ciekawe, knockdown z DDRGK1 nie wpłynął na poziomy całkowitej PERK, ale poziomy ufosforylowanej PERK (p-PERK) i BiP były znacząco zwiększone (Rys. 3a). Następnie zbadaliśmy wpływ deplecji DDRGK1 na substrat IRE1α – XBP1. Wyniki wykazały, że XBP1s, splicedowana forma XBP1, była znacząco obniżona w komórkach MCF7 pozbawionych DDRGK1 w sposób zależny od czasu (Rys. 3b), co było skorelowane ze zmianami w poziomie białka IRE1α (Supplementary Fig. 2A). Ponadto, pozbawienie DDRGK1 zwiększyło poziom fosforylacji eIF2α (p-eIF2α) oraz ekspresję CHOP zarówno w komórkach MCF7, jak i HepG2 (Supplementary Fig. 2B). Wyniki te wskazują, że pozbawienie DDRGK1 hamuje sygnalizację UPR-IRE1α i aktywuje ścieżkę apoptotyczną UPR-PERK, co w konsekwencji uruchamia apoptozę, jak zaobserwowano na ryc. 1 i 2. Jednakże poziom IRE1α był zwiększony w komórkach z nadekspresją DDRGK1 w sposób zależny od dawki (Rys. 3c), podczas gdy poziomy p-PERK, PERK, ATF6, p-IRE1α, BiP i splicowanej formy XBP1 nie były znacząco zmienione (Rys. 3c; Uzupełniające Rys. 2C i D). Aby zbadać funkcjonalny związek pomiędzy DDRGK1 a UPR, oceniliśmy dynamiczne zmiany IRE1α i PERK w komórkach MCF7 pozbawionych DDRGK1 oraz w komórkach kontrolnych po traktowaniu Tg w różnych punktach czasowych. Traktowanie Tg zwiększyło poziom IRE1α i p-IRE1α, p-PERK i BiP w komórkach kontrolnych, zgodnie z oczekiwaniami. Jednakże całkowity poziom IRE1α był znacząco obniżony (0-24 h), podczas gdy poziom p-IRE1α był umiarkowanie obniżony (4-24 h) w komórkach pozbawionych DDRGK1 w porównaniu z komórkami kontrolnymi (Rys. 3d). Równocześnie poziom XBP1s był obniżony w komórkach pozbawionych DDRGK1 w porównaniu z komórkami kontrolnymi (4-12 h) (Rys. 3e). Poziom całkowitej PERK nie uległ zmianie, ale p-PERK był znacząco zwiększony w komórkach pozbawionych DDRGK1 (0-12 h) (Rys. 3d). Podobne wyniki uzyskano w komórkach HepG2 (Supplementary Fig. 2E i F). Podsumowując, nasze wyniki sugerują, że pozbawienie DDRGK1 powoduje degradację IRE1α i aktywację PERK.

(a) Komórki MCF7 i HepG2 transfekowano kontrolnym siRNA lub siRNA skierowanym przeciwko DDRGK1 przez 72 h. Poziomy białek p-IRE1α, IRE1α, p-PERK, PERK, ATF6 i BiP oznaczono metodą western blot. (b) Komórki MCF7 transfekowano kontrolnym siRNA lub siRNA przeciwko DDRGK1, a komórki pobierano we wskazanym czasie do analizy RT-PCR splicingu XBP-1. (c) Komórki MCF7 i HepG2 transfekowano wektorami kontrolnymi lub DDRGK1 w różnych dawkach przez 36 h. Poziom białek p-IRE1α, IRE1α, p-PERK, PERK i ATF6 oznaczono metodą western blot. (d) Komórki MCF7 były transfekowane siRNA kontrolnym lub siRNA skierowanym przeciwko DDRGK1 przez 72 h. Komórki były zbierane na western blot po traktowaniu 2,5 μM Tg we wskazanym czasie. (e) Analiza RT-PCR splicingu XBP-1 w d. *Odpowiada niespecyficznemu pasmu.

DDRGK1 reguluje UPR poprzez celowanie w IRE1α

UPR jest wyzwalany przez czujniki stresu ER po stresie ER w celu regulacji homoeostazy ER8. Wykazano, że specyficzna dla hepatocytów delecja IRE1α u myszy spowodowała aktywację ścieżki UPR-PERK23. Aby odpowiedzieć na pytanie, czy indukcja p-PERK obserwowana w komórkach pozbawionych DDRGK1 była spowodowana obniżonym poziomem IRE1α, zbadaliśmy poziom p-PERK, PERK i jego celów downstream w komórkach pozbawionych IRE1α. Wyniki wykazały, że knockdown of IRE1α znacząco zwiększył poziom białka p-PERK i p-eIF2α zarówno w komórkach MCF7 jak i HepG2 (Rys. 4a), podobnie jak w komórkach pozbawionych DDRGK1 (Rys. 3a; Supplementary Fig. 2B). Wyniki te wskazują, że DDRGK1 reguluje UPR poprzez celowanie w IRE1α. Następnie sprawdziliśmy, w jaki sposób DDRGK1 reguluje IRE1α. Nasze wyniki wykazały, że poziom białka IRE1α, ale nie poziom mRNA (Supplementary Fig. 3A), został drastycznie obniżony w komórkach pozbawionych DDRGK1 (Fig. 3a). Leczenie komórek inhibitorem proteasomu MG132 zablokowało redukcję białka IRE1α wywołaną przez DDRGK1 (Rys. 4b; Supplementary Fig. 3B). Ponadto zaobserwowaliśmy, że pozbawienie DDRGK1 drastycznie zmniejszyło okres półtrwania IRE1α w teście pościgu za cykloheksimidem (Rys. 4c). Zgodnie z tymi obserwacjami, stwierdziliśmy, że ektopowa ekspresja IRE1α poprawiła przeżywalność komórek MCF7 i HepG2 pozbawionych DDRGK1 w porównaniu z komórkami kontrolnymi, charakteryzowanymi przez barwienie Annexin V/PI i aktywację kaspazy-3 (Rys. 4d,e; Uzupełniające Rys. 3C i D). W sumie, wyniki te sugerują, że DDRGK1 reguluje stabilność IRE1α i w ten sposób reguluje UPR.

(a). Komórki MCF7 i HepG2 transfekowano kontrolnym siRNA lub siRNA skierowanym na IRE1α przez 72 h. Poziomy białek p-PERK, PERK, p-eIF2α i eIF2α oznaczono metodą western blot. (b). Analiza Western blot IRE1α w kontrolnych i pozbawionych DDRGK1 komórkach MCF7 traktowanych z lub bez MG132 (20 μM, 8 h). (c). Analiza Western blot rozpadu IRE1α w kontrolnych i DDRGK1-knockdown komórkach MCF7 po traktowaniu 100 μg ml-1 cykloheksymidem przez wskazane czasy. Wykres przedstawia ilościowe oznaczenie poziomu białka IRE1α. (d) Komórki MCF7 były transfekowane kontrolnym siRNA lub siRNA skierowanym przeciwko DDRGK1 przez 72 h. Przed zebraniem komórek, komórki pozbawione DDRGK1 były transfekowane wektorem kontrolnym lub wektorem IRE1α przez 36 h. Komórki były następnie barwione Aneksyną V i PI i poddawane analizie cytometrycznej, a następnie kwantyfikacji komórek apoptotycznych (Aneksyna V+). All data are presented as mean±s.d. from three experiments. *P<0,05 przez test t-Studenta. (e) Analiza Western blot IRE1α w komórkach MCF7 w d.

DDRGK1 oddziałuje z IRE1α

Aby zrozumieć, w jaki sposób DDRGK1 reguluje stabilność IRE1α, sprawdziliśmy, czy DDRGK1 oddziałuje z IRE1α poprzez test wzajemnej immunoprecypitacji (IP) w komórkach HEK293T. Wyniki pokazały, że egzogennie wyrażona Flaga-IRE1α specyficznie oddziaływała z endogennymi DDRGK1 i BiP (Rys. 5a). Konsekwentnie, egzogennie wyrażona Flaga-DDRGK1 specyficznie oddziaływała z endogenną IRE1α i znanym białkiem związanym z DDRGK1 – C53 (ref. 14). Jednakże, nie byliśmy w stanie wykryć BiP w immunoprecypitatach Flag-DDRGK1 (Rys. 5b), co sugeruje, że DDRGK1 może nie oddziaływać bezpośrednio z BiP. IRE1α, jako endogenny substrat degradacji związanej z ERAD (ER-associated degradation), jest degradowany poprzez połączenie IRE1α z kompleksem Sel1L-Hrd1 ERAD w sposób zależny od BiP24. Dlatego sprawdziliśmy, czy BiP jest zaangażowany w interakcję pomiędzy DDRGK1 i IRE1α. Wyniki pokazały, że interakcja pomiędzy DDRGK1 i IRE1α nie została zakłócona przez knockdown BiP (Supplementary Fig. 4). Aby dodatkowo potwierdzić interakcję DDRGK1 z IRE1α, przeprowadziliśmy eksperymenty z barwieniem immunofluorescencyjnym. Wyniki pokazały, że te dwa białka kolokowały się w ER (Rys. 5c). Aby zmapować region zaangażowany w interakcję IRE1α z DDRGK1, współtransfekowaliśmy Flag-IRE1α typu dzikiego i mutacje truncacyjne wraz z DDRGK1 do komórek HEK293T, a wyniki IP wykazały, że cytoplazmatyczna domena kinazowa IRE1α była niezbędna do jego interakcji z DDRGK1 (Rys. 5d). Aby zrozumieć dynamiczne zmiany w interakcji pomiędzy DDRGK1 i IRE1α w warunkach stresu ER, komórki HEK293T były transfekowane flagą-DDRGK1 i traktowane Tg przez różne punkty czasowe. Zgodnie z oczekiwaniami, zaobserwowaliśmy, że całkowite IRE1α, p-IRE1α i BiP były znacząco zwiększone w warunkach stresu ER. Co ciekawe, stwierdziliśmy, że DDRGK1 specyficznie oddziaływał z niefosforylowanym IRE1α, ale nie z p-IRE1α, w immunoprecypitatach (Rys. 5e). Wyniki te sugerują, że DDRGK1 oddziałuje z i utrzymuje stabilność niefosforylowanego IRE1α.

(a). Analiza Western blot immunoprecypitatów z żelu powinowactwa Flag M2 w komórkach HEK293T transfekowanych wektorami Flag-Vector lub Flag-IRE1α przez 36 h. (b). Analiza Western blot immunoprecypitatów z żelu powinowactwa Flag M2 w komórkach HEK293T transfekowanych Flag-Vector lub Flag-DDRGK1 przez 36 h. (c). Komórki MCF7 poddano podwójnej immunostymulacji przeciwciałem anty-DDRGK1 (zielony) i przeciwciałem anty-IRE1α (czerwony). Jądra komórkowe były barwione przeciwciałem DAPI (niebieski). Współlokacja pomiędzy dwoma endogennymi białkami DDRGK1 i IRE1α jest pokazana w panelu łączącym. Pasek skali, 20 μm. (d) Schemat konstrukcji IRE1α wild-type i truncated oraz analiza western blot immunoprecypitatów z żelu powinowactwa Flag M2 w komórkach HEK293T transfekowanych Flag-Vector lub Flag-IRE1α wild-type i truncates. (e) Analiza Western blot immunoprecypitatów z żelu powinowactwa Flag M2 w komórkach HEK293T poddanych działaniu Tg (2,5 μM) z ekspresją Flag-Vector lub Flag-DDRGK1.

Ufm1 jest wymagany do interakcji DDRGK1 i IRE1α

Ostatnie badania wykazały, że DDRGK1 jest substratem ufmylacji i jest wymagany do ufmylacji ASC115,20. Aby zbadać, czy ufmylacja jest zaangażowana w regulację stabilności IRE1α przez DDRGK1, sprawdziliśmy, czy pozbawienie Ufm1 wpływa na ekspresję białka IRE1α. Podobnie jak w przypadku pozbawienia DDRGK1, zaobserwowaliśmy, że obniżenie ekspresji Ufm1 dramatycznie zmniejszyło poziom białka IRE1α (Rys. 6a), wskazując, że DDRGK1 reguluje IRE1α poprzez ufmylację. Konsekwentnie, stwierdziliśmy, że nadekspresja DDRGK1 nie stabilizuje białka IRE1α w komórkach MCF7 pozbawionych Ufm1 w porównaniu z komórkami kontrolnymi (Rys. 6b). Ponadto, poziom białka IRE1α był dramatycznie obniżony w komórkach MCF7 pozbawionych Ufm1 zarówno w nieobecności, jak i w obecności Tg (Rys. 6c), co sugeruje, że ufmylacja jest wymagana do regulacji stabilności białka IRE1α przez DDRGK1. Następnie zastanawialiśmy się, czy IRE1α podlega modyfikacji ufmylacyjnej. Aby odpowiedzieć na to pytanie, wykryliśmy ufmylację IRE1α w komórkach wyrażających DDRGK1 i Ufm1, jak również UBA5 (E1), UFC1 (E2) i UFL1 (E3), jak opisano wcześniej20. Jednakże nie byliśmy w stanie wykryć żadnej ufmylacji białka IRE1α, chociaż ufmylacja białka DDRGK1 była łatwo wykrywalna, jak opisano wcześniej (dane nie pokazane)15,20,25, co sugeruje, że IRE1α może nie być celem ufmylacji. Co ciekawe, stwierdziliśmy, że asocjacja pomiędzy DDRGK1 i IRE1α była znacząco zmniejszona w komórkach HEK293T pozbawionych Ufm1 w porównaniu z komórkami kontrolnymi (Rys. 6d). Zgodnie z tą obserwacją, stwierdziliśmy, że interakcja DDRGK1 K267R (mutant DDRGK1 z niedoborem ufmylacji, w którym reszta lizynowa 267 została zastąpiona resztą argininową)15 z IRE1α była dramatycznie zmniejszona w porównaniu z DDRGK1 typu dzikiego (Rys. 6e), wskazując, że ufmylacja DDRGK1 jest wymagana do asocjacji pomiędzy DDRGK1 i IRE1α. Ponadto, DDRGK1 K267R nie stabilizuje białka IRE1α w porównaniu do DDRGK1 typu dzikiego (Rys. 6f). Łącznie, wyniki te sugerują, że ufmylacja DDRGK1 na K267 jest wymagana do jej interakcji z IRE1α i regulacji stabilności białka IRE1α.

(a) Komórki MCF7 transfekowano kontrolnym siRNA lub siRNA ukierunkowanym na Ufm1 przez 72 h. Poziomy białka IRE1α oznaczono metodą Western blot. (b) Analiza Western blot IRE1α w kontrolnych i pozbawionych Ufm1 komórkach MCF7 z ekspresją wektora lub DDRGK1. (c) Poziom białka IRE1α został oznaczony metodą Western blot w kontrolnych i Ufm1-knockdown komórkach MCF7 po traktowaniu 2,5 μM Tg przez wskazany czas. (d) Analiza Western blot immunoprecypitatów z żelu powinowactwa Flag M2 w komórkach HEK293T kontrolnych i Ufm1-knockdown z ekspresją Flag-Vector lub Flag-DDRGK1. (e) Analiza Western blot immunoprecypitatów w żelu powinowactwa Flag M2 w komórkach HEK293T transfekowanych Flag-Vectorem, Flag-DDRGK1 WT lub mutantem K267R. (f) Analiza Western blot IRE1α w komórkach MCF7 transfekowanych Flag-Vectorem, Flag-DDRGK1 WT lub mutantem K267R.

DDRGK1 jest wymagana dla zdolności rekonstytucji HSC u myszy

Ostatnie badania sugerują, że krwiotwórcze komórki macierzyste (HSC) są niezwykle wrażliwe na stres ER26. To doprowadziło nas do spekulacji, że DDRGK1 może być krytyczna w funkcji HSC. Najpierw określiliśmy poziom ekspresji DDRGK1 w wielu liniach krwiotwórczych pochodzących od 2-miesięcznych myszy typu dzikiego. Q-PCR ujawniła znacząco wyższy poziom ekspresji DDRGK1 w HSC, włączając w to długotrwałe HSC (LT-HSCs), krótkotrwałe HSCs (ST-HSCs) i multipotencjalne progenitory (MPPs) (Fig. 7a). Ponadto, poziom białka DDRGK1 był wysoko wyrażony w komórkach szpiku kostnego (BM) wzbogaconych w HSC Lineage-c-Kit+ w porównaniu z komórkami BM Lineage+c-Kit- (ryc. 7b). Obserwacje te sugerują ważną rolę DDRGK1 w komórkach macierzystych. Aby zbadać rolę DDRGK1 w funkcji HSC, przeprowadzono konkurencyjne eksperymenty transplantacyjne z HSCs po lentiwirusowym knockdown DDRGK1 (Fig. 7c). Komórki Lineage-Sca1+c-Kit+ (LSK) pochodzące od myszy CD45.1 dawcy były transdukowane kontrolnym lub pozbawionym DDRGK1 lentiwirusem i przeszczepiane do śmiertelnie napromieniowanych myszy CD45.2 biorcy. Analiza cytometryczna przepływu wykazała, że odsetek komórek krwi obwodowej pochodzących od dawcy (PB) był znacznie zmniejszony w grupie z wyłączonym DDRGK1 w porównaniu z grupą kontrolną, wskazując, że wyłączenie DDRGK1 znacznie upośledziło zdolność konkurencyjnej rekonstytucji HSCs (ryc. 7d). Podczas gdy w niekonkurencyjnym eksperymencie transplantacyjnym, myszy biorcy przeszczepione z DDRGK1-knockdown HSCs nadal żyły 3 miesiące po przeszczepie, sugeruje to, że knockdown DDRGK1 jedynie upośledzał zdolność konkurencyjnej rekonstytucji HSCs. Aby wykluczyć efekty off-target, zaprojektowaliśmy inny shRNA skierowany na DDRGK1 i zaobserwowaliśmy podobne wyniki (Supplementary Fig. 5A). Trzy miesiące po transplantacji myszy-biorców poddano eutanazji w celu przeprowadzenia analizy BM i testów tworzenia kolonii in vitro. Analiza cytometryczna przepływowa wykazała, że knockdown DDRGK1 dramatycznie upośledzał utrzymanie transdukowanych HSCs bez wpływu na ich potencjał liniowy (tj. linie mieloidalne, komórki B i komórki T), na co wskazywała zmniejszona częstotliwość hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych pochodzących od dawcy, jak również zróżnicowanych komórek hematopoetycznych w BM i PB (Fig. 7e). Podobny wynik zaobserwowano w niezależnym eksperymencie z użyciem innego shRNA skierowanego na DDRGK1 (Supplementary Fig. 5B). Dodatkowo, wyizolowaliśmy komórki CD34-Flt3-LSK pochodzące od dawcy (LT-HSCs) od myszy-biorców i przeprowadziliśmy test tworzenia kolonii z pojedynczych komórek. Wyniki wykazały, że knockdown DDRGK1 upośledzał zdolność HSCs do tworzenia pośrednich i dużych kolonii (Fig. 7f). W sumie, dane te sugerują, że DDRGK1 jest wymagana do utrzymania funkcji HSC.

(a) Analiza Q-PCR względnych poziomów ekspresji mRNA DDRGK1 we wskazanych subpopulacjach BM od młodych myszy typu dzikiego (2 miesiące życia, n=3). Względna ekspresja DDRGK1 została znormalizowana do GAPDH. Dane są przedstawione jako średnie±s.d. (b) Analiza Western blot DDRGK1 we wzbogaconych komórkach Lineage+ c-Kit- i Lineage- c-Kit+ od młodych myszy typu dzikiego (2 miesiące). (c) Schemat eksperymentalny badania rekonstytucji. (d) Reprezentatywny wzór FACS pokazujący procent komórek GFP-pozytywnych w komórkach PB pochodzących od dawcy, kontrolnych (sh-Vector) lub pozbawionych DDRGK1 (sh-DDRGK1) (lewy panel). Wartości przedstawiają znormalizowany procent komórek GFP+ pochodzących od dawcy w całkowitej ilości przeszczepionych komórek (panel prawy, n=3). Dane przedstawione są jako średnie±s.d. **P<0,01 i ***P<0,001 testem t-Studenta. (e) Wartości przedstawiają procentowy udział komórek GFP+ pochodzących od dawcy w LT-HSC (CD34-Flt3- LSK), ST-HSC (CD34+Flt3- LSK), MPP (CD34+Flt3+ LSK), CMP (CD34+CD16/32-Sca1-c-Kit+Lin-), GMP (CD34+CD16/32+Sca1-c-Kit+Lin-), MEP (CD34- CD16/32-Sca1-c-Kit+Lin-), B, populacje komórek linii T i mieloidalnej w BM myszy będących pierwotnymi biorcami 12 tygodni po transplantacji (n=3). Dane przedstawione są jako średnie±s.d. ***P<0,001 testem t-Studenta. (f) Pojedyncze GFP+ LT-HSCs pochodzące od dawcy z myszy-biorców były sortowane na płytki 96-dołkowe i hodowane przez 14 dni in vitro. Procent kolonii został obliczony przez podzielenie liczby kolonii przez pierwotną liczbę pojedynczych komórek, które zostały zasiane. Dane przedstawiono jako średnie±s.d. **P<0,01 testem t-Studenta.

Aby zbadać, czy upośledzona funkcja HSC była spowodowana zmniejszoną wydajnością naprowadzania, znakowaliśmy barwnikiem fluorescencyjnym (fioletowym) komórki LSK oczyszczone z 2-miesięcznych myszy poddanych transdukcji lentiwirusowej z kontrolą lub sh-DDRGK1, a następnie wstrzykiwaliśmy je śmiertelnie napromieniowanym biorcom. Odsetek znakowanych komórek LSK obecnych w BM biorcy 18 h po przeszczepie analizowano metodą cytometrii przepływowej. Wyniki wykazały, że zdolność do naprowadzania się komórek LSK pozbawionych DDRGK była porównywalna z komórkami kontrolnymi (Supplementary Fig. 6A i B). Aby określić, czy knockdown DDRGK1 miał wpływ na status cyklu komórkowego komórek LSK, wybarwiliśmy pochodzące od dawcy komórki kontrolne i DDRGK1-knockdown LSK markerem proliferacji Ki67 i DAPI i nie znaleźliśmy znaczącej różnicy w profilach cyklu komórkowego między DDRGK1-knockdown HSCs i kontrolnymi HSCs (Supplementary Fig. 7A). Następnie zbadaliśmy wpływ DDRGK1-knockdown na apoptozę HSCs używając barwienia Aneksyną V i stwierdziliśmy znacząco wyższą częstotliwość apoptozy w komórkach LSK pochodzących od dawcy DDRGK1-knockdown w porównaniu z kontrolnymi komórkami LSK; zjawisko to było obserwowane przy użyciu obu shRNA skierowanych na DDRGK1 (Fig. 8a; Supplementary Fig. 7B). Następnie zbadaliśmy poziom reaktywnych form tlenu (ROS) w transdukowanych HSCs. Wyniki wykazały, że poziom ROS był porównywalny pomiędzy grupą kontrolną i grupą z wyłączoną DDRGK1 (Supplementary Fig. 7C). Na podstawie powyższych obserwacji stwierdziliśmy, że knockdown DDRGK1 w HSCs indukował apoptotyczną śmierć komórek, upośledzając tym samym funkcję HSC.

(a) Reprezentatywny wzorzec FACS pokazujący odsetek komórek Annexin V-dodatnich w obrębie komórek kontrolnych pochodzących od dawcy i DDRGK1-knockdown LSK po transplantacji (panel lewy). Wykres słupkowy pokazuje procent komórek V-pozytywnych w komórkach LSK (panel prawy, n=3). Dane przedstawione są jako średnie±s.d. *P<0.05 testem t-Studenta. (b) Analiza Q-PCR względnego poziomu ekspresji mRNA DDRGK1, BiP i CHOP w kontrolnych komórkach LSK pochodzących od dawcy i komórkach LSK pozbawionych DDRGK1 po transplantacji (n=3). Dane przedstawione są jako średnie±s.d. **P<0.01 i ***P<0.001 testem t-Studenta. (c) Analiza Western blot p-IRE1α, IRE1α, p-PERK, PERK i ATF6 w komórkach GFP+Lineage-c-Kit+ pochodzących od dawcy, wzbogaconych z myszy biorców kontrolnych lub DDRGK1-knockdown. *Reprezentuje niespecyficzne pasmo. (d) Analiza RT-PCR splicingu XBP-1 w kontrolnych komórkach LSK pochodzących od dawcy i komórkach DDRGK1-knockdown po transplantacji. Komórki MEF z traktowaniem Tg służyły jako kontrola splicingu XBP-1.

Aby zbadać, czy upośledzona funkcja HSC była spowodowana aktywacją odpowiedzi na stres ER w DDRGK1-knockdown HSCs, przeanalizowaliśmy poziomy ekspresji BiP i CHOP przez Q-PCR w kontrolnych i DDRGK-knockdown engrafted HSCs, wyniki wykazały, że poziomy mRNA BiP i CHOP były znacznie zwiększone w DDRGK1-knockdown HSCs (Fig. 8b). Dodatkowo zbadaliśmy poziom białek czujników stresu ER w kontrolnych i pozbawionych DDRGK komórkach BM Lineage-c-Kit+. Zgodnie z obserwacjami w nowotworowych liniach komórkowych, knockdown DDRGK1 wykazał obniżony poziom białek IRE1α i p-IRE1α oraz podwyższony poziom p-PERK, podczas gdy poziom ATF6 nie różnił się w grupie kontrolnej i DDRGK1-knockdown (ryc. 8c). Konsekwentnie, poziom XBP1s był obniżony w komórkach LSK pochodzących od dawcy DDRGK1-knockdown (Rys. 8d). Podsumowując, wyniki te wskazują, że knockdown DDRGK1 upośledza sygnalizację IRE1α, ale aktywuje ścieżkę PERK i dodatkowo potwierdza, że DDRGK1 jest krytyczna dla prawidłowego utrzymania homoeostazy ER, a tym samym niezbędna dla przeżycia i utrzymania HSCs.