De gebruikelijke benadering om de genfunctie te bestuderen is het gen in te brengen of te inactiveren in een cel of een individu, en veranderingen in celbiologisch gedrag of individuele fenotypes waar te nemen om de functie ervan te identificeren.

De bestudering van de genfunctie kan daarom volgens de volgende twee soorten strategieën worden uitgevoerd:

• Gen verlies van functie

• Gen verlies van functie

Gen verlies van functie

Gen knockout is een van de meest gebruikte methoden om functieverlies bij muizen te bestuderen. Gen knock-out is de ontdekking van biologische functies van doelgenen door het bestuderen van organismen die de geïnactiveerde (knock-out) doelgenen dragen. Deze techniek vereist dat veranderingen worden aangebracht in partiële sequenties van doelgenen, waardoor de functies van de specifieke genen worden uitgeschakeld en een deel van of de gehele functie van het doelgen wordt uitgeschakeld. Gen knock-out kan verder worden onderverdeeld in conventionele gen knock-out en conditionele gen knock-out.

Conventionele gen knock-out

• Conventionele knock-out (afkorting: KO) verwijst naar de knock-out van bepaalde vitale exonen, functionele domeinen van het doelgen, of zelfs alle exonen, in alle muizencellen, hetgeen resulteert in het verlies van expressie van het doelgen.

• KO muizen dragen de gemanipuleerde doelgensequenties in alle weefsels en cellen. Doelgenen komen niet tot expressie in homozygote muizen

• KO muizen worden over het algemeen gebruikt om de effecten van doelgenen of eiwitfuncties op de fysiologie of pathologie te bestuderen.

Conditional Gene knockout

• Conditional Knockout (afkorting: CKO) is de temporele en ruimtelijke-specifieke engineering van het muizengenoom door gentechnologie te beperken tot bepaalde specifieke celtypes in de muis of tot een specifiek ontwikkelingsstadium

• Gene targeting wordt in CKO-muizen gebruikt om een of meer belangrijke exonen van het doelgen te flankeren met loxP-locaties. De expressie van het doelgen was normaal vóór kruising met de Cre recombinase-expressieve stam. Bij kruising met Cre recombinase-expresserende transgene muizen kan het doelgen in een specifiek weefsel of celtype worden uitgeschakeld, terwijl de expressie ervan in andere weefsels of celtypes normaal blijft.

• KO-muizen worden over het algemeen gebruikt om genen te bestuderen die embryonale letaliteit veroorzaken, functies van doelgenen of -eiwitten in een bepaald weefsel of celtype, of de rol van doelgenen of -eiwitten in een bepaalde periode of een bepaald stadium.

Voorbeeld: Toepassing van Drd2 KO en Drd2 CKO muismodellen in onderzoek naar hersenimmuunrespons

Gain of function

De studie van genfunctie door het observeren van veranderingen in biologische eigenschappen van de cel of het individu, waarin het doelgen was ingebracht om nieuwe of hogere expressieniveaus te genereren.

Random transgen

Random insertion transgenesis is de willekeurige integratie van een exogeen gen in het muisgenoom om muismodellen met overexpressie van het doelgen te genereren. Het wordt gebruikt om de effecten van overexpressie van het doelgen op de fysiologie en pathologie te bestuderen.

Targeted gene overexpression

De exogene DNA-sequentie komt stabiel tot expressie in muizen na te zijn geklopt in de muis Gt (ROSA) 26Sor ook bekend als Rosa26-gen locus. Expressie van het exogene gen kan ook weefselspecifiek of door geneesmiddelen worden geïnduceerd.

• Gebruikbaar voor experimenten met overexpressie van gen- en eiwitfuncties

• Kan worden gebruikt voor reddingsexperimenten voor KO-fenotypes

Gene knock-in

Knock-in (afkorting: KI) verwijst naar de introductie van specifieke mutaties of exogene DNA-sequenties op de plaats van het doelgen.

(1) Introductie van een basismutatie in het doelgen om een humaan genetisch ziektemodel na te bootsen.

(2) Introductie van een reportergen, zoals EGFP, RFP, mCherry, YFP, LacZ en Luciferase, in het muriene endogene gen om het expressiepatroon van het doelgen te observeren.