Achtergrondinformatie

DNA-transfectie door elektroporatie is een gevestigde techniek die op wellicht alle celtypen kan worden toegepast. Zij levert een hoge frequentie van stabiele transformanten op en heeft een hoge efficiëntie van voorbijgaande genexpressie. Elektroporatie is nu doeltreffend gebleken voor het in vivo toedienen van plasmide DNA aan een verscheidenheid van weefseltypes. Elektroporatie maakt gebruik van het feit dat het celmembraan fungeert als een elektrische condensator die niet in staat is stroom door te laten (behalve via ionenkanalen). Het blootstellen van membranen aan een elektrisch veld onder hoogspanning resulteert in de tijdelijke afbraak ervan en de vorming van poriën die groot genoeg zijn om macromoleculen (en ook kleinere moleculen zoals ATP) de cel te laten binnenkomen of verlaten. Het weer sluiten van de membraanporiën is een natuurlijk vervalproces dat bij 0°C wordt vertraagd.

Tijdens de tijd dat de poriën open zijn, kan nucleïnezuur de cel en uiteindelijk de kern binnendringen. Lineair DNA met vrije uiteinden is meer recombinogeen en heeft meer kans te worden geïntegreerd in het gastheerchromosoom om stabiele transformanten op te leveren. Supercoiled DNA is gemakkelijker verpakt in chromatine en is over het algemeen effectiever voor voorbijgaande genexpressie.

Het gebruik van elektrische schokken onder hoogspanning om DNA in cellen te introduceren werd voor het eerst uitgevoerd door Wong en Neumann met behulp van fibroblasten (Wong en Neumann, 1982; Neumann et al., 1982). De techniek werd vervolgens veralgemeend (Potter et al., 1984) tot alle celtypes, zelfs die zoals lymfocyten die, in tegenstelling tot fibroblasten, niet kunnen worden getransfecteerd met andere procedures (b.v,

Oliver Smithies en collega’s gebruikten vervolgens elektroporatie om DNA in embryonale stamcellen (ES) in te brengen en ontwierpen doelvectoren waarmee het ingebrachte DNA kon recombineren met homologe regio’s in het genoom en ofwel een gewijzigd gen of een verstorende sequentie kon inbrengen om ES-cellen te genereren met een specifiek gen ‘knock in’ of ‘knock out’. De veranderde ES-cellen werden vervolgens gebruikt om de overeenkomstige knock-in of knock-out muizen te genereren. Elektroporatie was nodig voor deze toepassingen van genoverdracht omdat het DNA in cellen introduceert in een naakte vorm die gemakkelijk kan deelnemen aan homologe recombinatie. Deze uitbreiding van elektroporatie leidde ertoe dat Dr. Smithies in 2007 de Nobelprijs voor geneeskunde of fysiologie kreeg. De methodologie voor de elektroporatie van ES-cellen is in wezen dezelfde als voor andere zoogdiercellen. Als homologe genvervanging gewenst is, moeten vectoren worden ontworpen die een “positief-negatieve” screening mogelijk maken (Bronson en Smithies, 1994; Joyner 2000) zodat één selectie alle cellen terugwint waarin het geëlektroporeerde DNA in het genoom is ingebracht, en de tweede selectie gericht is tegen ES-klonen waarin het DNA willekeurig is ingebracht. Knockin / out muizen kunnen vervolgens worden gegenereerd door het fuseren van de geselecteerde gekloonde ES cellen met embryo’s, reimplanteren om de ontwikkeling mogelijk te maken, en het fokken van de resulterende chimaeren om muizen waarin alle cellen dragen het veranderde gen.

Hoewel hele planten of bladweefsel zijn gemeld transfecteerbaar te zijn door elektroporatie, plantencellen moeten over het algemeen worden gemaakt in protoplasten voordat DNA gemakkelijk kan worden ingevoerd in hen (alternatief protocol; Fromm et al., 1985; Ou-Lee et al., 1986). Net als cellen van zoogdieren kunnen plantenprotoplasten worden geëlektroporeerd onder uiteenlopende elektrische omstandigheden (kritische parameters). Zowel hoogspanning met lage capaciteit (korte pulsduur) als laagspanning met hoge capaciteit (lange pulsduur) zijn gebruikt om tot een succesvolle genoverdracht te komen (Chu et al., 1991). In vivo EP werd oorspronkelijk gebruikt voor de toediening van chemotherapeutische middelen aan solide tumoren en ontwikkelde zich van preklinische studies tot klinische proeven (Gothelf, et al., 2003). De in vivo toediening van plasmide DNA met behulp van elektroporatie werd voor het eerst gerapporteerd in het begin tot het midden van de jaren negentig (Titomarov, et al., 1991; Heller, et al., 1996; Nishi, et al., 1996) en was een logische stap voorwaarts op basis van het succes van in vitro transfecties met elektroporatie en de demonstratie dat de procedure veilig in vivo kon worden uitgevoerd bij de toediening van kleine moleculen zoals chemotherapeutische middelen. Het gebruik van in vivo elektroporatie voor de toediening van plasmide-DNA is enorm toegenomen in het aantal preklinische studies dat wordt uitgevoerd en is onlangs vertaald naar de kliniek (Heller, et al., 2006a en Bodles-Brakhop, et al.,2009).

Het wijdverbreide gebruik van elektroporatie is voor een groot deel mogelijk gemaakt door de beschikbaarheid van commerciële apparaten die veilig en gemakkelijk te gebruiken zijn en die uiterst reproduceerbare resultaten geven. Ontwerpen van deze machines variëren aanzienlijk, maar vallen in twee basiscategorieën die verschillende middelen gebruiken voor het regelen van pulsduur en voltage (de twee elektrische parameters die de porievorming regelen). De ene soort gebruikt een condensator-ontladingssysteem om een exponentieel afnemende stroompuls te genereren, en de andere genereert een echte blokgolf (of een benadering daarvan). De condensatorontladingsinstrumenten laden hun interne condensator op tot een bepaalde spanning en ontladen deze vervolgens door de cel-DNA-suspensie. Zowel de grootte van de condensator als de spanning kunnen worden gevarieerd. Omdat de stroomstoot een exponentieel afnemende functie is van (1) de aanvankelijke spanning, (2) de capaciteitsinstelling van het instrument, en (3) de weerstand van het circuit (met inbegrip van het monster), zal het wijzigen van de condensatorgrootte om meer (of minder) lading bij de spanning te kunnen opslaan, resulteren in langere (of kortere) vervaltijden en derhalve in een andere effectieve pulsduur. Daarentegen controleren blokgolfgeneratoren zowel het voltage als de pulsduur met solid-state omschakelingsapparaten. Zij kunnen ook snel herhalende pulsen produceren. Voor in vivo toepassingen hebben blokgolfgeneratoren de voorkeur. Naast pulsduur en amplitude, puls aantal en elektrode configuratie ook van invloed efficiency van delivery.

De meeste van onze in vitro elektroporatie experimenten hebben gebruik gemaakt van de Bio-Rad Gene Pulser, een condensator ontlading apparaat, maar zijn direct toepasbaar op andere condensator ontlading apparaten, en met enige aanpassing aan blokgolf generatoren. Apparaten voor condensatorontlading zijn ook verkrijgbaar bij GIBCO/BRL, BTX, Hoeffer Scientific en International Biotechnologies (zie aanhangsel 4 voor de adressen van de leveranciers). Deze machines kunnen, hetzij in één enkele eenheid, hetzij door toevoeging van componenten, een verscheidenheid van elektroporatiecondities leveren die geschikt zijn voor de meeste toepassingen. Vierkante-golfgeneratoren zijn verkrijgbaar bij BTX, Baekon, CytoPulse Sciences, Sonidel, Bio-Rad, Jouan en IGEA en bieden een grote controle over de pulsbreedte, maken meervoudige, snelle pulsen mogelijk en kunnen doeltreffender zijn voor cellen die zeer gevoelig of anderszins moeilijk te transfecteren zijn. Het gebruik van elektroporatie voor gentherapie bij levende dieren of mensen vereist ook een goede controle over de parameters van de elektroporatie om een efficiënte DNA-overdracht met minimale weefselbeschadiging te waarborgen en hiervoor zijn in het algemeen blokgolfgeneratoren nodig. Er zijn generatoren beschikbaar voor het toedienen van pulsen als constante spanning of constante stroom. Naast de levering van blokgolfgeneratoren zijn bij deze leveranciers ook elektroden verkrijgbaar die geschikt zijn voor in vivo elektroporatie. Deze apparaten zijn over het algemeen duurder. Het is duidelijk geworden dat wisselstroompulsen op ~ 100 kHz kan de meest effectieve golfvorm voor elektroporatie en eventueel elektrofusie (Chang, 1989) zijn.

De meerderheid van onze in vivo experimenten hebben gebruik gemaakt BTX T820 of T830 blokgolf generatoren. Deze experimenten hebben gebruik gemaakt van in de handel verkrijgbare elektroden zoals een 2-needle array, schuifmaat elektroden en tang elektroden en op maat ontworpen elektroden. Zoals hierboven vermeld, grote leveranciers van elektroporatie-apparatuur hebben een verscheidenheid van doordringende en niet-penetrerende elektroden beschikbaar. Vierkante golf generatoren veroorloven een betere controle van de puls parameters die bijzonder belangrijk is bij het uitvoeren van in vivo toediening. De groei van het gebruik van in vivo elektroporatie houdt rechtstreeks verband met de effectieve toediening in de spier. De toepassing van intramusculaire toediening van genen met behulp van elektroporatie is vooral belangrijk geweest voor vaccinatiedoeleinden (Abdulhagg, et al., 2008). Van spierweefsel is ook aangetoond dat het een uitstekend depot is voor op genen gebaseerde eiwitvervangingstoepassingen (Trollet, et al., 2006). Afgifte aan de spier kan ook worden gebruikt voor de afgifte van vaccins tegen kanker (Bodles-Brakhop, et al., 2009). Afgifte aan de huid is ook aanvaard als een veelzijdig doelwit. Afgifte aan de huid kan worden gebruikt voor de directe behandeling van huidziekten, de afgifte van eiwitten aan de circulatie voor systemische therapie, kankertherapie en voor de afgifte van DNA-vaccins (Hirao, et al., 2008, Roos, et al., 2006, Glasspool-Malone, et al., 2000).

Electroporatie kan gemakkelijker worden uitgevoerd dan alternatieve technieken, en wordt daarom steeds meer gebruikt. Het nadeel voor gebruik bij transiënte analyse is dat bijna vijf keer meer cellen en DNA nodig zijn dan bij calciumfosfaat- of DEAE-dextran-gemedieerde transfectie (UNITS 9.1, 9.2 & 16.12). Het belangrijkste verschil tussen de elektroporatie- en de calciumfosfaat-coprecipitatieprocedure is de toestand van het geïntegreerde DNA na selectie in geschikte antibiotische media. In het geval van calciumfosfaat ligt de hoeveelheid DNA die wordt opgenomen en geïntegreerd in het genoom van elke getransfecteerde cel in de orde van grootte van 3 × 106 bp. Dientengevolge integreert het getransfecteerde DNA vaak als grote tandem-arrays die vele kopieën van het getransfecteerde DNA bevatten. Dit zou een voordeel zijn wanneer transfectie van genomisch DNA in ontvangende cellen en selectie voor een fenotypische verandering zoals kwaadaardige transformatie gewenst is; hier is een grote hoeveelheid geïntegreerd DNA per ontvangende cel essentieel. Elektroporatie daarentegen kan zo worden ingesteld dat er één tot vele kopieën van ingebracht DNA per ontvangende cel ontstaan. Dit zou een voordeel zijn voor genexpressiestudies, aangezien de identiteit van de specifieke kopie die verantwoordelijk is voor de genexpressie kan worden gecontroleerd, en is, zoals hierboven besproken, essentieel voor gen targeting van ES-cellen om transgene muizen te genereren.