Infectie met Giardia lamblia is een van de meest voorkomende oorzaken van diarreeziekte wereldwijd (22). Deze protozoaire ziekteverwekker koloniseert de dunne darm en kan zich hechten aan het epitheel, maar dringt niet door in de mucosa. Infecties zijn gewoonlijk zelflimiterend, aangezien immunocompetente gastheren G. lamblia onder controle kunnen houden en gewoonlijk uitroeien, een proces waarbij CD4 T-cellen en de productie van secretorische immunoglobuline A (IgA) en andere, slecht begrepen effectoren betrokken zijn (6, 8, 9, 18). Ondanks de vaak ernstige klinische symptomen, diarree, buikpijn, malabsorptie en gewichtsverlies, gaat de infectie niet gepaard met een significante mucosale ontsteking (12). Deze observaties suggereren dat inflammatoire mediatoren niet belangrijk zijn voor parasiet-geïnduceerde diarree, hoewel de mechanismen die diarree veroorzaken bij giardiasis nog slecht begrepen worden. Van Giardia is niet aangetoond dat het enterotoxinen vrijgeeft die de verstoring van de intestinale vloeistofabsorptie of -secretie zouden kunnen verklaren. Een vermindering van het absorberend oppervlak door een verlies van epitheliale microvilli treedt op bij Giardia infectie in muizen (16), wat zou kunnen leiden tot osmotisch gedreven diarree geassocieerd met malabsorptie, maar de absolute vermindering van het oppervlak is bescheiden vergeleken met de voorspelde anatomische reserve van de dunne darm. Mensen die geïnfecteerd zijn met G. lamblia vertonen tekenen van intestinale hypermotiliteit bij radiologisch onderzoek (15), een fenomeen dat ook werd waargenomen bij experimenteel geïnfecteerde Mongoolse gerbils (5). De onderliggende mechanismen en de functionele betekenis van deze bevindingen zijn tot op heden onduidelijk. Daarom is het doel van de huidige studie was het testen van de hypothese dat intestinale hypermotiliteit een gastheer afweermechanisme tegen Giardia vertegenwoordigt, met behulp van muizenmodellen van giardiasis.
Volwassen C57BL/6, SCID, en neuronale stikstofmonoxide synthase (nNOS)-deficiënte muizen werden verkregen uit The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Voor infecties met Giardia muris, werden cysten gezuiverd door sucrose flotatie, geteld in een hemocytometer onder een fase-contrast microscoop, en gegeven door orale gavage in water op 104 cysten / muis in 0,2 ml (9). Voor G. lamblia-infecties werden trofozoieten van de GS/M-stam (ATCC 50580) (11) gekweekt in TYIS-33-medium en oraal toegediend in een dosis van 107 per muis in 0,2 ml van hetzelfde medium (9). De beweeglijkheid van de dunne darm werd bepaald met behulp van een aangepaste testmaaltijdmethode. Muizen werden ’s nachts gevast en kregen 0,2 ml van een suspensie van 106 fluorescerende polystyreenbolletjes (Fluoresbrite YG-carboxylaat microsferen met een diameter van 10 μm; Polysciences, Inc., Warrington, PA) (19) en 6% karmijnkleurstof in 5% Arabische gom in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) toegediend. Na 20 min. werd de dunne darm snel verwijderd, en de positie van het karmijnkleurstoffront en de volledige lengte van de dunne darm werden geregistreerd. De darm werd vervolgens verdeeld in acht even grote stukken, die elk in de lengterichting werden geopend, in 2 ml PBS gelegd en gedurende 10 minuten op ijs gekoeld. De mengsels werden krachtig geschud om de trofozoieten en de korrels los te maken, die vervolgens afzonderlijk werden geteld met respectievelijk een fasecontrast- en een fluorescentiemicroscoop. De afstand die het front van de karmijnkleurstof heeft afgelegd, werd uitgedrukt als percentage van de gehele lengte van de dunne darm. Het aantal korrels per segment werd uitgedrukt als percentage van het totale aantal korrels in de dunne darm. Om de gevolgen van remming van de dunne darm motiliteit op giardiale klaring beoordelen, werden muizen eerst oraal geïnfecteerd met G. muris of G. lamblia GS / M en behandeld door orale maagsonde om de andere dag, te beginnen op dag 7 of dag 4, respectievelijk, met 30 mg / kg loperamide of met PBS als controle. Kleine-intestinale trofozoieten aantallen werden bepaald op dag 21 voor G. muris en op dag 9 voor G. lamblia.
Om te bepalen of normale volwassen muizen zijn een geschikt model voor het bestuderen van de rol van intestinale motiliteit in het beheersen van giardiale infectie, hebben we 8 tot 10 weken oude C57BL / 6 muizen geïnfecteerd met cysten van de natuurlijk voorkomende murine pathogeen G. muris. Klein-intestinale motiliteit werd bepaald door een test maaltijd methode, met behulp van karmijn kleurstof als een vloeibare fase marker (14) en 10-μm polystyreen kralen als een marker van deeltjes vergelijkbaar in grootte met Giardia trofozoieten (19). Infectie met G. muris versnelde dunne darm transit, omdat de fronten van zowel karmijn kleurstof (Fig. (Fig.1A)1A) en polystyreen kralen (Fig. (Fig.1B)1B) had aanzienlijk verder gereisd in geïnfecteerde muizen dan niet-geïnfecteerde controles. Een tijdsverloop analyse van dit fenomeen bleek dat hypermotiliteit opgetreden binnen een week na infectie, maar piekte op 2 tot 3 weken, op een moment dat trofozoiet nummers werden verminderd in vergelijking met de nummers op het moment van maximale infectie op 1 week (Fig. (Fig.1A).1A). Zo werden de maximale veranderingen in de dunne darm motiliteit vertraagd ten opzichte van de piek in de trofozoiet last, wat suggereert dat deze veranderingen kunnen worden veroorzaakt door een ander mechanisme dan directe giardiale stimulatie.
G. muris infectie van wild-type muizen induceert dunne darm hypermotiliteit. (A) Volwassen C57BL / 6 muizen werden oraal geïnfecteerd met 104 G. muris cysten (week 1 tot 4) of links niet-geïnfecteerde als controles (week 0). Op de aangegeven tijdstippen na infectie, kleine-darm motiliteit (-) en trofozoiet belasting (○) werden onderzocht. Motiliteitsgegevens worden weergegeven als de afstand afgelegd door een karmijn-kleurstof-bevattende testmaaltijd ten opzichte van de lengte van de gehele dunne darm over een periode van 20 minuten. De waarden zijn gemiddelden ± standaardfouten van de gemiddelden (SEM) van resultaten voor vier tot zeven dieren. Asterisks vertegenwoordigen een significante (P < 0,05, t-test) toename van de beweeglijkheid ten opzichte van niet-geïnfecteerde controles. (B) Muizen geïnfecteerd gedurende 2 weken met G. muris (lege balken) en niet-geïnfecteerde controles (gevulde balken) kregen een test maaltijd met 10-urn fluorescerende polystyreen kralen, en kraal doorvoer werd beoordeeld na 20 min. Bead nummers in elk van de acht even grote dunne darm segmenten (die zijn genummerd in volgorde van proximale duodenum naar distalileum) worden gegeven als percentage van het totale aantal kralen in de dunne darm. Er werd geen significant verschil gevonden tussen de aantallen residuele korrels in de magen van niet-geïnfecteerde en geïnfecteerde muizen (respectievelijk 14,2% ± 5,7% en 18,5% ± 3,4%). De waarden zijn gemiddelden ± SEM voor zes tot zeven dieren. Asterisken staan voor een significante (P < 0,05, t-test) toename ten opzichte van niet-geïnfecteerde muizen.
Deze bevinding doet denken aan rapporten van Giardia-geïnduceerd verlies van intestinale epitheliale microvilli waarbij de adaptieve immuunrespons van de gastheer verantwoordelijk bleek te zijn (16, 17). Om na te gaan of soortgelijke mechanismen betrokken kunnen zijn bij het veroorzaken van hypermotiliteit van de dunne darm, hebben wij muizen met ernstige gecombineerde immunodeficiëntie (SCID muizen) geëvalueerd. Deze muizen missen functionele T-en B-cellen als gevolg van een defect in de katalytische subeenheid van DNA-afhankelijke proteïne kinase, PRKDC, die nodig is voor een normale V (D) J recombinatie, en kan niet uitroeien Giardia (9, 18). G. muris infectie van SCID muizen veranderde niets aan de dunne-darm transit, wat in schril contrast stond met de waarnemingen bij de immunocompetente controles (Fig. (Fig.2).2). Deze resultaten wijzen erop dat giardiasis-geassocieerde hypermotiliteit van de dunne darm afhankelijk was van de inductie van een normale adaptieve immuunrespons tegen de ziekteverwekker.
Afhankelijkheid van intestinale hypermotiliteit van intacte T- en B-cel functies. Volwassen C57BL / 6 (wild-type) en SCID muizen werden oraal geïnfecteerd met G. muris cysten of links niet-geïnfecteerde als controles, en kleine-intestinale motiliteit (A) en trofozoiet nummers (B) werden geëvalueerd 2 weken na infectie. Waarden zijn gemiddelde ± SEM voor vier tot zes dieren. De asterisk wijst op een significante toename (P < 0,05, t-test) ten opzichte van niet-geïnfecteerde controles.
Om te testen of de waargenomen dunne darm hypermotiliteit bijgedragen aan de klaring van Giardia, behandelden we muizen met loperamide, een geneesmiddel dat intestinale transit remt door het activeren van μ-opioïde receptoren in het maagdarmkanaal (2, 13, 21). Drug behandeling werd gestart op het moment van piek G. muris infectie (dag 7) om ervoor te zorgen dat farmacologisch geïnduceerde veranderingen in motiliteit niet zou interfereren met de eerste vestiging van de infectie. De remming van de dunne darm motiliteit door loperamide duidelijk gecompromitteerd giardiale klaring, met 25-voudig-hoge trofozoiet nummers in loperamide-behandelde muizen dan in PBS-behandelde controles op 21 dagen (Fig. (Fig.3).3). Loperamide behandeling had geen effect op de ontwikkeling van adaptieve immuniteit, aangezien titers van antigiardiaal IgA in intestinale mucosale afscheidingen niet werden beïnvloed door de behandeling (gegevens niet aangetoond). Bovendien bleek uit deze experimentele strategie een vergelijkbaar remmend effect op muizeninfectie met G. lamblia GS/M, een menselijke giardiale ziekteverwekker die normale volwassen muizen kan infecteren (3, 9). Muizen behandeld met PBS had grotendeels gewist de infectie door 9 dagen, terwijl muizen behandeld met loperamide vanaf dag 4 bleef significante aantallen G. lamblia trofozoieten in de dunne darm (Fig. (Fig.3).3). Dus, remming van de dunne darm motiliteit gecompromitteerd de klaring van Giardia in de murine gastheer, ongeacht de giardial soort. Als een extra benadering voor het bepalen van het belang van intestinale motiliteit in antigiardiale gastheer verdediging, gebruikten we een genetische benadering waarin verstoring van het gen voor nNOS interfereert met effectieve voortstuwing in de darm bij muizen (20). Motiliteitsanalyse bevestigde dat nNOS-deficiënte muizen een constitutieve vertraging vertoonden in de gastro-intestinale transit vergeleken met hun wild-type nestgenoten (Fig. (Fig.4A).4A). Tegelijkertijd slaagden de knock-out muizen er niet in om G. lamblia infectie normaal op te lossen (Fig. (Fig.4B).4B). Dus, met behulp van farmacologische en genetische benaderingen, vonden we dat verminderde intestinale motiliteit werd geassocieerd met aantasting van de gastheer verdediging tegen Giardia.
Pharmacologische remming van de intestinale motiliteit compromissen giardiale klaring. Volwassen C57BL/6 muizen werden oraal geïnfecteerd met 104 G. muris cysten of met 107 G. lamblia GS/M trofozoieten. Na 7 dagen (G. muris) of 4 dagen (G. lamblia), werden muizen gegeven loperamide (Lop) of PBS oraal om de andere dag. Trofozoietenaantallen in de dunne darm werden bepaald op de aangegeven tijdstippen na infectie. Waarden zijn gemiddelden ± SEM voor acht tot tien dieren. *, P < 0,05, zoals bepaald door t-test.
Muizen met een gebrek aan nNOS vertonen een verminderde gastro-intestinale transit en een verhoogde gevoeligheid voor Giardia-infectie. (A) Volwassen muizen met een tekort aan nNOS (nNOS-/-) en hun wild-type nestgenoten (WT) werden getest op gastro-intestinale motiliteit met behulp van een karmijn kleurstof testmaaltijd. Waarden zijn gemiddelden ± SEM voor ten minste drie dieren. *, P < 0,05 (t-test), ten opzichte van de resultaten voor wild-type muizen. (B) Muizen werden oraal geïnfecteerd met 107 trofozoieten van G. lamblia GS/M, en het aantal trofozoieten in de dunne darm werd bepaald op de aangegeven tijdstippen na infectie. Waarden zijn gemiddelden ± SEM voor drie tot vier dieren. *, P < 0.05, ten opzichte van de tellingen op dag 4.
Onze studie toont aan dat intestinale hypermotiliteit een belangrijke gastheerafweer tegen Giardia is, een conclusie die ook in een ander recent rapport werd getrokken (10). Deze verdediging lijkt afhankelijk te zijn van de ontwikkeling van een normale adaptieve immuunrespons tegen de parasiet, aangezien deze niet optrad bij muizen zonder T- en B-cellen, hoewel het in principe mogelijk is dat T- of B-cellen bijdragen aan hypermotiliteit onafhankelijk van hun rol in adaptieve antigiardiale immuniteit. Immuunafhankelijke hypermotiliteit speelt een rol bij de verdediging van de gastheer tegen andere darmparasieten, met name helminthen. Bijvoorbeeld, uitroeiing van de rondworm Trichinella spiralis, die een aanzienlijk deel van zijn levenscyclus in de dunne darm doorbrengt, is sterk gecorreleerd met verhoogde intestinale motiliteit (4, 23). Evenzo gaat uitdrijving van de haakworm Nippostrongylus brasiliensis bij ratten gepaard met hypermotiliteit van de dunne darm, wat wijst op een rol in de verdediging van de gastheer tegen deze helminth (7). Al deze enterische pathogenen hebben gemeen dat zij zich voornamelijk, zo niet uitsluitend, in de darmlumen bevinden. Anatomisch gezien bevindt deze infectiehaard zich buiten het eigenlijke, met epitheel beklede lichaam en is derhalve niet gemakkelijk toegankelijk voor veel immuun-effectorcellen en -moleculen, zoals neutrofielen of complement, die binnen het lichaam doeltreffend werken. In feite vormt een doeltreffende antimicrobiële verdediging in het darmlumen een bijzondere uitdaging voor de gastheer, die op deze plaats over een beperkt repertoire van verdedigingsmiddelen beschikt. Hiervan wordt secretorisch IgA algemeen beschouwd als een primair luminaal verdedigingsmechanisme, maar het werkelijke belang ervan in giardiale klaring blijkt variabel te zijn en kan afhangen van slecht gedefinieerde gastheer- en parasietfactoren (6, 9, 18). Onze gegevens en eerder werk met helminths (4, 23) geven aan dat intestinale hypermotiliteit een ander belangrijk afweermechanisme is tegen kolonisatie van de intestinale lumen.
Immuun-afhankelijke hypermotiliteit kan een mechanistische verklaring bieden voor de diarree geassocieerd met giardiasis, zoals opgemerkt in eerdere rapporten (5, 15). In principe kan diarree worden veroorzaakt door verminderde vochtopname of verhoogde secretie of een combinatie van deze twee mechanismen. Er is weinig bewijs voor een verhoogde afscheiding van ionen en vocht bij giardiasis, waardoor een verminderde vochtopname de waarschijnlijke oorzaak is. Een kortere contacttijd met luminale vloeistoffen, die kunnen zijn opgenomen of afkomstig zijn van maag- of pancreassecreties, zal naar verwachting de effectiviteit van ionentransport door het epitheel in gevaar brengen, vooral wanneer hypermotiliteit wordt gecombineerd met het gerapporteerde verlies van absorberende epitheliale oppervlakken (16). Opgemerkt moet echter worden dat muizen geen diarree vertonen na Giardia infectie. Desalniettemin is het mogelijk dat een verstoring van de darmvochtbalans optreedt in zowel menselijke als dierlijke gastheren en dat deze gecompenseerd blijft in muizen maar niet in mensen. Als hypermotiliteit inderdaad bijdraagt aan de pathogenese van diarree, zou onze bevinding dat SCID muizen geen Giardia-geïnduceerde hypermotiliteit vertonen, impliceren dat patiënten met cellulaire immunodeficiënties die geassocieerd worden met een verhoogde gevoeligheid voor Giardia infecties (b.v. chronische variabele immunodeficiëntie) minder kans hebben om infectie-geassocieerde diarree te ontwikkelen. Bovendien suggereren onze resultaten dat voorzichtigheid is geboden bij het overwegen van het gebruik van intestinale motiliteitsremmers bij de behandeling van Giardia-geïnduceerde diarree (1), omdat een dergelijke behandeling de onderliggende infectie kan verlengen.