3.4 Inosinemodificatie en mRNA-omzetting

Adenosine naar inosine (A-I) modificatie van mRNA’s wordt gekatalyseerd door adenosine deaminases die werken op RNA enzymen (ADAR’s). Deze enzymen hebben een voorkeur voor dubbelstrengs RNA regio’s, en de omzetting van A-I (in dit hoofdstuk ook wel editing genoemd) zal de basenpaar eigenschappen van de gemodificeerde basen veranderen, aangezien zij nu op dezelfde manier als guanine zullen basenparen. Zoals eerder gedaan, zullen we de directe effecten van inosine op de stabiliteit van mRNA scheiden van die welke het gevolg zijn van indirecte effecten. Introductie van inosine in dubbelstrengs gebieden van RNA kan degradatie in gang zetten door het rekruteren van ribonucleasen die specifiek zijn voor inosine-bevattende RNA’s. Het eerste enzym dat werd voorgesteld om dit effect te bewerkstelligen is het Tudor-staphylococcen nuclease (SN), waarvan is aangetoond dat het de splitsing van hypered dubbelstrengs RNA’s in extracten bevordert. De meeste in deze studie beschreven resultaten tonen een biochemische activiteit aan van Tudor-SN op gehyperde substraten in vitro. Uit deze studies is echter niet duidelijk welk deel van de mRNA’s die inosine bevatten in vivo door Tudor-SN wordt gekliefd, en of Tudor-SN al dan niet de directe endonuclease was. Tudor-SN bleek gelokaliseerd te zijn in cytoplasmatische stresskorrels, zodat het mogelijk is dat sommige van zijn doeltranscripten bij voorkeur worden gereguleerd onder stressomstandigheden. Het tweede nuclease waarvan bekend is dat het specifiek is voor inosine-bevattende RNA’s is humaan endonuclease V (hEndoV), dat een verscheidenheid van inosine-bevattende RNA-substraten in vitro kan klieven. Eén studie suggereerde dat hEndoV de eigenlijke inosine endonuclease is, waarbij Tudor-SN een stimulerende activiteit aan hEndoV zou leveren. Interessant is dat hEndoV ook lokaliseert naar cytoplasmatische stress granules , wat een functie suggereert vergelijkbaar met Tudor-SN in het mogelijk reguleren van de niveaus van inosine-bevattende mRNAs tijdens stress. Hoewel het duidelijk is dat inosine-specifieke nuclease activiteiten bestaan in eukaryote cellen (Fig. 5), blijft hun bijdrage aan mRNA splitsing en turnover slecht begrepen. Daarom moet de fysiologische impact van de splitsing van hyperedited dsRNA door Tudor-SN en/of hEndoV grondiger worden onderzocht.

ADAR-enzymen kunnen ook een belangrijke rol spelen in de stabiliteit van mRNA door de binding van RNA-bindende eiwitten te reguleren die het verval van mRNA beïnvloeden. De invloed van ADAR’s op het niveau van hun doel-mRNA’s werd globaal gemeten, en in het algemeen correleert hun invloed op mRNA-niveaus niet goed met hun vermogen om inosinevorming in deze mRNA’s te bevorderen . De belangrijkste invloed van ADARs op de stabiliteit van mRNA’s blijkt veeleer te liggen in de rekrutering van het RNA-bindende eiwit HuR (ELAVL1), dat een belangrijke regulator is van het verval van mRNA’s. ADAR1 interageert met HuR op een RNA-afhankelijke manier, en de meeste mRNA’s die gedownreguleerd worden in afwezigheid van ADAR1 bevatten HuR-bindende sites. ADAR1 lijkt dus de stabiliteit van zijn mRNA-doelen te beïnvloeden door HuR te rekruteren op nabijgelegen doelsites. ADARs kunnen ook de niveaus van verschillende mRNAs en ncRNAs reguleren door de binding van de vervalfactor PARN, een poly(A)-specifiek nuclease, te verhinderen. Deze functie lijkt ook onafhankelijk te zijn van editing, aangezien een katalytisch inactieve ADAR-mutant in staat is de functies van het enzym bij het regelen van het verval te vervullen. De invloed van ADARs op de stabiliteit van hun mRNA targets lijkt dus grotendeels onafhankelijk te zijn van hun vermogen om de vorming van inosine te bevorderen.

Een belangrijk gevolg van inosine modificatie op de mRNA omzet is te wijten aan de invloed van inosine op microRNA-gemedieerde genregulatie. De aanwezigheid van inosine kan twee belangrijke stappen van deze pathway beïnvloeden: (i) de biogenese van microRNAs en (ii) de specificiteit van targeting van mRNAs door microRNAs. Wat de invloed van inosine op de biogenese van microRNA’s betreft, werd aangetoond dat primaire precursors van microRNA’s door ADAR1 of ADAR2 kunnen worden bewerkt. De aanwezigheid van inosine in deze precursors heeft twee nadelige effecten op de productie van rijpe microRNAs . Ten eerste vermindert inosine de efficiëntie van de verwerking van de primaire precursors door Drosha; ten tweede worden inosine-bevattende precursors nu een doelwit voor inosine-specifieke ribonucleasen zoals Tudor-SN en/of hEndoV. Deze gecombineerde effecten van inosine modificatie op de primaire precursors van microRNAs resulteren in een afname van de niveaus van microRNAs geproduceerd uit deze precursors, met een gelijktijdige toename van de doel-mRNAs. Dit proces kan worden gereguleerd, aangezien is aangetoond dat precursoren van het miR-151 microRNA tijdens de vroege ontwikkeling worden bewerkt, hetgeen resulteert in precursorafbraak door Tudor-SN . Meer in het algemeen worden precursors van microRNAs die inosine bevatten afgebroken tijdens postzygotische stadia bij muizen. Deze resultaten tonen aan dat A-I editing van microRNAs precursors hun biogenese tijdens de ontwikkeling kan reguleren, wat op zijn beurt direct invloed heeft op de expressie van hun mRNA targets. Het effect van ADARs op microRNA biogenese is echter complex omdat ADAR1 ook heterodimeerder bleek te zijn met het RNase III enzym Dicer om de efficiëntie van microRNA verwerking te verhogen, waardoor het een positieve rol speelt in microRNA biogenese. De complexiteit van de directe en indirecte effecten van ADARs op kleine RNA biogenese werd ook genoom-breed aangetoond in Caenorhabditis elegans. Tenslotte kan ADAR1 ook siRNAs binden onafhankelijk van RNA bewerking in zoogdiercellen, wat de effectiviteit van siRNA behandeling beperkt. Daarom lijken ADARs een tweesnijdend zwaard te zijn voor microRNA- en kleine RNA-gemedieerde gene silencing, omdat het onderdrukkende effect van inosine modificatie op microRNA precursor verwerking en stabiliteit kan worden gecompenseerd door ADARs vermogen om microRNA verwerking te bevorderen door hun associatie met Dicer, en hun effect op siRNA beschikbaarheid. Niettemin spelen deze enzymen een sleutelrol bij de controle van de celdifferentiatie door de bewerking van microRNA-precursoren. Bijvoorbeeld, hyperediting van de Let-7 microRNA precursor door ADAR1 in leukemie werd aangetoond dat leukemie stamcellen vernieuwing te bevorderen , het benadrukken van het belang van fijnafstemming microRNA precursors editing tijdens celdifferentiatie.

Inosine beïnvloedt ook microRNA-gemedieerde mRNA regulering door het beïnvloeden van RNA duplexvorming, die van cruciaal belang is bij het bepalen van de specificiteit van microRNAs-mRNA interacties (Fig. 5). Dit werd voor het eerst aangetoond door aan te tonen dat de invoering van inosine in de miR-376 microRNA resulteerde in de repressie van een andere groep van mRNA’s ten opzichte van die onderdrukt door de niet-gemodificeerde miR-376 . Als de bewerkte plaats zich in de zaadsequentie van het microRNA bevindt, resulteert de modificatie in een verandering van specificiteit voor de microRNAs omdat inosine bij voorkeur basenparen vormt met C. Omgekeerd zal A-I bewerking in 3′-UTR sequenties van mRNAs de potentiële targeting van deze UTRs door microRNAs veranderen en kunnen nieuwe microRNA-bindende plaatsen worden gecreëerd. Gereguleerde bewerking bleek mogelijk belangrijk te zijn voor de regulatie van oncogenen en tumorsuppressorgenen via microRNAs tijdens cellulaire transformatie .

Finitief kan inosine de mRNA-stabiliteit beïnvloeden via indirecte effecten. Inosine-bevattende mRNA’s bleken in LPS-gestimuleerde immuuncellen tot de kern beperkt te blijven, waardoor ze niet aan de cytoplasmatische mRNA-afbraakmachine konden worden blootgesteld. Nucleaire retentie van deze mRNA’s zou hen echter onderwerpen aan preferentiële degradatie door nucleaire degradatiewegen zoals het nucleaire exosoom. Dit kan resulteren in een toename of afname van de stabiliteit, afhankelijk van de relatieve efficiëntie van elk van deze afbraakroutes voor specifieke mRNA’s. Inosine beïnvloedt ook de alternatieve splicing, die op zijn beurt kan resulteren in mRNA-isovormen met een verschillende stabiliteit. Dit is vooral het geval als de alternatief gesplicte soorten bindingsplaatsen bevatten voor verschillende RNA-bindende eiwitten die hun stabiliteit moduleren. Daarom kunnen inosine en ADAR’s de stabiliteit en expressie van mRNA op vele manieren beïnvloeden door een combinatie van zowel directe als indirecte effecten.