Growth and ethanol production of S. cerevisiae NCYC 2826 op tarwestrohydrolysaat

Figuur 1A toont de groei van S. cerevisiae National Collection of Yeast Cultures (NCYC) 2826, gekweekt bij 30°C gedurende 36 uur in een cultuur met een hydrolysaat met een glucoseconcentratie van 123 mM, bereid zoals beschreven in het gedeelte ‘Methoden’. De S. cerevisiae-stam werd gekozen vanwege zijn gerapporteerde hoge tolerantie voor ethanol en zijn robuustheid in industriële fermentaties. Figuur 1A laat zien dat wanneer S. cerevisiae NCYC 2826 alleen op tarwestrohydrolysaat werd gekweekt, er een langzame groeisnelheid μ van 0,036 h-1 was en een uiteindelijke optische dichtheid (OD) van 0,8. Toevoeging van Yeast nutrient base (YNB) aan de media leidde tot een toename van μ tot 0,135 h-1 en een uiteindelijke OD van 1,5, terwijl toevoeging van 2,3 mg ml-1 ureum aan het tarwestrolysaat een μ gaf van 0,99 h-1 en een uiteindelijke OD van 1,3. Eerdere studies hebben aangetoond dat ureumsupplementen de ethanolproductie bij gistfermentatie kunnen verhogen en dat ureum zelf een essentieel bestanddeel is in de meest minimale gistgroeimedia . Onze resultaten ondersteunen deze eerdere bevindingen en bevestigen dat ureum nodig is voor een bijna optimale groei van gist. Na 36 uur werd de ethanolconcentratie in de culturen gemeten en de ethanolopbrengst uit 123 mM glucose bedroeg voor alle culturen ongeveer 90% van de totale theoretische opbrengst. Hoewel onder deze drie kweekomstandigheden een vergelijkbare hoeveelheid ethanol werd geproduceerd, was de groei langzamer en de uiteindelijke optische dichtheid lager bij tarwestrohydrolysaat dan wanneer ureum of YNB aan de kweek werd toegevoegd. Dit suggereert dat, hoewel glucose beschikbaar was voor fermentatie, het hydrolysaat niet voldoende voedingselementen bevatte om de cultuur in staat te stellen zich maximaal te delen en een optimale dichtheid te bereiken.

Om de oorzaak van de verminderde celgroei op tarwestrohydrolysaat te onderzoeken, werd S. cerevisiae NCYC 2826 gekweekt op hydrolysaat dat was gemaakt met 5%, 10%, 15% en 20% startconcentratie van het stro en aangevuld met 2,3 mg ml-1 ureum. Figuur 1B laat zien dat naarmate de uitgangsconcentratie van het stro toenam, ook de vertragingsfase van de groei toenam tot 20 uur bij een uitgangsconcentratie van 20% stro. De uiteindelijke OD nam ook toe naarmate de stroconcentratie toenam, als gevolg van de verhoogde concentraties van vrijgekomen glucose. De verhoogde vertragingsfase is kenmerkend voor remming van de groei door furaanverbindingen die vaak aanwezig zijn in strohydrolysaten. Analyse van het furaangehalte van het hydrolysaat toonde aan dat het HMF-gehalte te verwaarlozen was (gegevens niet weergegeven), maar dat de concentratie aanwezige furfural toenam met de initiële stroconcentratie tot 0,5 mg ml-1 bij 20% initieel strogehalte (figuur 2). Deze gegevens suggereren dat de groei van S. cerevisiae NCYC 2826 op tarwestrohydrolysaat wordt beperkt door de concentratie van furfural aanwezig in het hydrolysaat.

Concentratie van glucose (vierkanten) en furfural (driehoeken) aanwezig in tarwestrohydrolysaten gemaakt zoals beschreven in het gedeelte ‘ Methoden ‘ met een toenemende concentratie van initieel stro.

Analyse van de groei van de SGRP-stammenreeks op furfural

Om giststammen te identificeren die resistent kunnen zijn tegen verontreinigend furfural, werd de in de methoden beschreven SGRP-stammenreeks gekweekt in YNB, 100 mM glucose en de aanwezigheid van 1,5 mg ml-1 furfural. Tabel 1 toont de analyse van de tolerantie van de SGRP-stamreeks voor 1,5 mg ml-1 furfural aan de hand van het in het hoofdstuk “Methoden” beschreven scoresysteem. Een puntensysteem was nodig in plaats van gemiddelde lagetijden, omdat stamreplicaten die niet groeiden geen meetbare lagefase hadden, maar toch in de dataset moesten worden opgenomen.

We hadden eerder waargenomen dat het verhogen van het inoculum in furfural bevattende culturen leidde tot een afname van de vertragingsfase, vermoedelijk door het maximaliseren van de hoeveelheid levensvatbare gistcellen die in het medium worden gebracht, wat leidt tot een snellere vestiging van de exponentiële groeifase (gegevens niet weergegeven). Daarom werd voor deze experimenten een inoculumvolume van 5% van de nachtcultuur gebruikt. Uit de gegevens in tabel 1 blijkt dat de groei op replicaplaatjes uiterst variabel was en ook stamafhankelijk, hetgeen aantoont dat een concentratie van 1,5 mg ml-1 furfural voldoende is om furfuraltolerantie bij stammen van S. cerevisiae en S. paradoxus te onderscheiden. Bij het testen van de groei van de stammen in YNB met 100 mM glucose en 2,0 of 3,0 mg ml-1 furfural werd onder beide omstandigheden bij geen van de geanalyseerde stammen groei waargenomen. Daarom werd besloten de stammen te selecteren op basis van de gegevens van 1,5 mg ml-1 en deze aan een meer gedetailleerde furfural screening te onderwerpen. Uit de analyse van de gegevens in tabel 1 blijkt dat de S. cerevisiae-stammen over het geheel genomen beter groeiden dan de S. paradoxus-stammen op 1,5 mg ml – 1 furfural. Bijna 20% van de geteste S. paradoxus-stammen behaalde geen topscore in het scoresysteem, terwijl dit voor S. cerevisiae minder dan 10% was, hetgeen ook tot uitdrukking komt in de hogere gemiddelde totaalscore voor S. cerevisiae van 2,5 ± 1,4 vergeleken met 2,1 ± 1,4 voor S. paradoxus. Binnen elke stamgroep was er echter aanzienlijke variatie, met scores die varieerden van 1,7 tot 3,7 voor S. cerevisiae en van 0,3 tot 3,0 voor S. paradoxus. Stammen die hoger dan 2,9 scoorden met een standaardafwijking van minder dan 1,5 werden beschouwd als stammen met een significante furfuraltolerantie. Bijgevolg werden de S. cerevisiae stammen NCYC 3284 (ex bodem, USA), NCYC 3290 (ex bili wijn, West Afrika), NCYC 3312 (ex bodem, Nederland) en NCYC 3451 (ex wort, Ierland), samen met S. paradoxus NCYC 3277 (ex eikenschors, UK) verder onderzocht in een meer gedetailleerde furfural screening.

Effecten van toenemende concentraties furfural op groei en ethanolproductie

Figuur 3 toont de groei in aanwezigheid van variërende hoeveelheden furfural (0,1 tot 4,0 mg ml-1) voor S. cerevisiae stammen NCYC 3284, NCYC 3290, NCYC 3312 en NCYC 3451 en S. paradoxus stam NCYC 3277 geïdentificeerd in tabel 1 van de SGRP-stammenreeks als hebbende verhoogde resistentie tegen furfural. Extra bestand 1: Figuur S1 toont de overeenkomstige groeigegevens uitgezet op een log-schaal. De controlestam S. cerevisiae NCYC 2826 werd ook opgenomen voor vergelijkende doeleinden. Voor alle zes stammen geldt dat naarmate de furfuralconcentratie toeneemt, de groeicurven een toename van de vertragingsfase beginnen te vertonen, zoals eerder is waargenomen bij groei met furfural. Alle geteste stammen waren in staat te groeien op YNB aangevuld met 100 mM glucose en 0,1 tot 1,5 mg ml-1 furfural. S. cerevisiae NCYC 2826, onze controlestam, was alleen in staat te groeien op maximaal 1,5 mg ml-1, wat leidde tot een vermindering van 30% in de uiteindelijke OD vergeleken met groei op 0,1 mg ml-1 furfural. Tabel 2 laat zien dat de ethanolproductie door NCYC 2826 onder deze omstandigheden aanzienlijk lager was dan de ongeveer 90% opbrengst die werd waargenomen bij groei op YNB en glucose alleen of op tarwestrohydrolysaat. S. cerevisiae NCYC 2826 werd geïsoleerd uit druivenmost en is dus waarschijnlijk niet geëvolueerd in het vermogen om te groeien en te fermenteren bij blootstelling aan furfural.

In hun populatiegenomics-studie identificeerden Liti et al. vijf goed gedefinieerde, geografisch geïsoleerde S. cerevisiae-lijnen geïdentificeerd (Maleisisch, Noord-Amerikaans, Saké, West-Afrika en “Wijn/Europees”), alsmede veel verschillende recombinante (mozaïek-)stammen van deze lijnen. Uit de resultaten van de huidige studie blijkt dat furfuralresistentie geen fenotypische eigenschap is die specifiek is voor één bepaalde S. cerevisiae-lijn. Van de vier geïdentificeerde furfural resistente SGRP S. cerevisiae stammen behoort NCYC 3284 (YPS128) tot de Noord-Amerikaanse stam, NCYC 3290 (DBVPG 6044) tot de West-Afrikaanse stam, NCYC 3312 (DBVPG 1373) tot de “Wijn/Europese” stam, terwijl NCYC 3451 (een uit één spore bestaand derivaat van NCYC 361) een recombinant stam is.

S. cerevisiae NCYC 3451 vertoonde de grootste furfural resistentie (figuur 3F, Additional file 1: figuur S1F) en was in staat om te groeien in de aanwezigheid van maximaal 3,0 mg ml-1 furfural. Bovendien leek de ethanolproductie in deze stam niet te worden geremd door furfural, met de hoogste ethanolopbrengst (95 ± 15%; Tabel 2) bereikt bij een (furfural)concentratie van 3,0 mg ml-1. Zoals reeds vermeld, is NCYC 3451 een recombinante stam en is aangetoond dat het een mozaïekachtig genoom heeft, afgeleid van ten minste drie verschillende lijnen, namelijk Saké, West-Afrika en ‘Wijn/Europa’ (Liti et al. ). Hoewel deze stam uit wort geïsoleerd werd als een bierbederfgist, suggereert de uiterst complexe genoomstructuur sterk, hoewel niet bewezen, dat ze van industriële oorsprong is (bijvoorbeeld een bak- of brouwstam). Van de vier resterende geteste SGRP-stammen konden de S. cerevisiae stammen NCYC 3290 en NCYC 3312 beide groeien op 2,5 mg ml-1 furfural (Figuur 3D,C, Additional file 1: Figuur S1D en S1C, respectievelijk), terwijl S. cerevisiae NCYC 3284 (Figuur 3E, Additional file 1: Figuur S1E) en S. paradoxus NCYC 3277 (Figuur 3B, Additional file 1: Figuur S1B) alleen konden groeien op 2,0 mg ml-1 furfural. Over het geheel genomen werd de ethanolproductie van de vijf SGRP-stammen niet significant beïnvloed door de aanwezigheid van furfural. Voor NCYC 3312 leidde de aanwezigheid van 0,5 mg ml-1 furfural tot een opmerkelijke toename van de ethanolopbrengst, van 41 ± 8% verwachte opbrengst tot 75 ± 5% (Tabel 2). Dit werd ook waargenomen bij de bierbederfstam NCYC 3451, maar in mindere mate (slechts een toename van de opbrengst met 14%; Tabel 2). Onlangs is inderdaad aangetoond dat kleine hoeveelheden furfurylalcohol, een product van de dehydratie van furfural in gist, daadwerkelijk kunnen leiden tot een toename van de ethanolproductie.