Resultaten

Analyse van klinische monsters.

In september 2006 werd het influenzavirus A/Swine/Missouri/4296424/2006 (Sw/4296424) geïsoleerd uit verscheidene 5- tot 6-weken oude varkens met multifocale bronchopneumonie in een commercieel varkensbedrijf met meerdere varkens. De longlaesies omvatten matige, subacute tot chronische, purulente bronchopneumonie en interstitiële pneumonie met bronchiolitis en peribronchitis. Het longweefsel was negatief voor PRRSV (porcine reproductive and respiratory syndrome virus), PCV2 (porcine circovirus type 2) en Mycoplasma hyopneumoniae, maar was positief voor Streptococcus suis. Vanwege de karakteristieke influenza-achtige laesies en klinische tekenen van longontsteking, werd longweefselhomogenaat geënt op Madin-Darby canine kidney (MDCK) cellen. Cytopathische effecten werden waargenomen op dag 3 na inoculatie (p.i.). Het gen voor nucleoproteïne (NP) van het influenzavirus werd in de geïnfecteerde cellen gedetecteerd met behulp van RT-PCR. Het virus reageerde niet met referentie-varkensantisera (A/Sw/IA/1973 H1N1, A/Sw/TX/1998 H3N2, A/Sw/NC/2001 H1N1) in hemagglutinatieremmingstests (HI), en multiplex RT-PCR detecteerde geen H1N1- of H3N2-genen (14). Het virus werd in februari 2007 ingediend bij het National Animal Disease Center (NADC) voor subtypering en sequencing.

Nadat het isolaat van september was gesubtypeerd en gesequenced (hieronder beschreven), bleek uit een zoektocht in de dossiers dat in april 2006 een ander “niet-typeerbaar” influenza-isolaat was ingediend. A/Swine/Missouri/2124514/2006 (Sw/2124514) was geïsoleerd uit een 12 weken oud varken met respiratoire aandoening op een ander commercieel bedrijf voor fokvarkens. De longlaesies waren histopathologisch kenmerkend voor varkensinfluenza (ernstige, subacute ontsteking van de alveoli en bronchi met bronchiolaire epitheliale celnecrose en metaplasie). De long was negatief voor PRRSV, PCV2, en M. hyopneumonia maar was positief voor influenza A-virus door RT-PCR (specifiek voor het NP-gen) en S. suis. Het virus werd in maart 2007 naar het NADC gestuurd voor subtypering en sequencing.

Subtypering en fylogenetische analyse.

Om beide influenzavirussen te identificeren en karakteriseren, werden nucleïnezuursequencing en moleculaire en fylogenetische analyse uitgevoerd. Beide virussen werden rechtstreeks gesequeneerd uit low-passage isolaten door gebruik te maken van MDCK cellen, en de sequenties werden bevestigd na plaque zuivering en resequencing. Ze werden geïdentificeerd als H2N3-virussen aan de hand van de nucleotidenvolgorde en een BLAST-zoekopdracht in de Influenza Sequence Database (www.flu.lanl.gov). Het HA-gensegment van Sw/4296424 kwam het meest overeen met dat van H2-virussen die geïsoleerd waren uit wilde eenden in Noord-Amerika. Het NA-segment was nauw verwant aan dat van een H4N3-vogelgriepvirus (AIV) geïsoleerd uit blauwvleugeltalingen (98,3% identiteit). Met uitzondering van het polymerase-gen (PA) waren de interne genen afgeleid van de huidige triple-reassortante varkensinfluenzavirussen die momenteel in de Verenigde Staten worden aangetroffen. Deze virussen dragen interne genen van menselijke (PB1), vogel- (PB2, PA), en varkensinfluenzavirussen (SI Tabel 4). Het PA-segment was voor 99,2% identiek aan dat van de H6N5 AIV die geïsoleerd is bij wilde eenden (SI Tabel 4). De Sw/2124514 en Sw/4296424 virussen vertoonden 99,3-99,9% totale nucleotide-sequentie-identiteit (SI Tabel 5). Beide isolaten werden herhaaldelijk gekloond, opnieuw getest en door sequencing bevestigd tot het H2N3-subtype te behoren. Het H2N3-subtype werd serologisch bevestigd door hemagglutinatieremming en neuraminidaseremmingstests. Fylogenetische analyse op basis van de HA- en NA-genen toonde aan dat deze twee virussen behoren tot de Amerikaanse aviaire stamreeks die verschilt van de Euraziatische aviaire stammen en de H2N2-virussen geïsoleerd bij de mens na de 1957 grieppandemie (Fig. 1).

Moleculaire analyse van de HA en NA oppervlakte-eiwitten.

Influenza A-virussen bevatten twee oppervlakte-eiwitten: het HA is het receptor-bindende en membraan-fusion glycoproteïne, en het NA is een receptor-vernietigend enzym. Het virale HA is een kritische factor voor de gastheersoort-specificiteit van influenzavirussen (15). Om de residuen in het HA te karakteriseren die in verband kunnen worden gebracht met de aanpassing van een vogelvirus aan de zoogdiergastheer, hebben wij de aminozuursequenties van varkens-HA’s vergeleken met die van de vermoedelijke referentievogelvirussen. Moleculaire vergelijking van de HA-moleculen van de twee varkens-H2N3-isolaten bracht aan het licht dat zij door zes gemeenschappelijke aminozuursubstituties (D36N, Q226L, T274I, V316I, L419I, en L506V) verschillen van het vermeende referentie H2N3-virus dat van wilde eenden is geïsoleerd (SI Tabel 6). De substitutie Q226L werd in beide varkens H2N3-isolaten aangetroffen, terwijl positie 228 G bevatte, identiek aan de aviaire consensussequentie (tabel 1) (16). Daarentegen bevatten menselijke HA-moleculen van het H2-subtype 226L en 228S, terwijl vroege menselijke H2-isolaten 226L en 228G bevatten (tabel 1), vergelijkbaar met de varkensisolaten. De posities 36N, 274I, 316I en 419I zijn uniek voor de twee varkens-H2N3-isolaten (SI-tabel 6), terwijl de respectieve posities in menselijke en vogelisolaten, afgebeeld in fig. 1a, 36D, 274T, 316V en 419L zijn. Voor de in fig. 1a afgebeelde influenza-isolaten is positie 506V geconserveerd bij de mens, de twee H2N3-isolaten bij varkens en de aviaire isolaten, behalve bij A/mallard/Alberta/2004 (H2N3), zoals aangegeven in SI-tabel 6. Twee gemeenschappelijke aminozuurveranderingen in de aminozuursequentie van de NA van beide varkensisolaten werden gevonden in vergelijking met het referentie-H4N3-virus geïsoleerd van blauwvleugeltaling: H47Y en H253Y (SI Tabel 7). De positie 47Y in beide H2N3-isolaten van varkens is hetzelfde als het respectieve aminozuur in Euraziatische vogelisolaten, afgebeeld in fig. 1 b; omgekeerd is de positie in Noord-Amerikaanse vogelisolaten 47H. De positie 253Y is uniek voor de H2N3-isolaten van varkens, en de positie 253H is geconserveerd in de Euraziatische en Noord-Amerikaanse aviaire isolaten die zijn afgebeeld in fig. 1 b. Interessant is dat Sw/4296424 (H2N3), dat 5 maanden later geïsoleerd werd dan Sw/2124514 (H2N3), twee extra substituties (P162S en L321V) in het HA-molecuul had, en drie extra substituties (V30I, I49T, en A135T) in het NA-molecuul, vergeleken met het HA en NA van Sw/2124514 (SI-tabellen 6 en 7). De positie 30I (Sw/4296424) in het NA-molecuul is vergelijkbaar met Euraziatische isolaten, terwijl de positie 30V (Sw/2124514) geconserveerd is in Noord-Amerikaanse vogelisolaten.

Pathogeniciteit en overdraagbaarheid van H2N3 varkensinfluenza virussen in varkens.

Om de mate van aanpassing van het H2N3-virus bij varkens te onderzoeken, onderzochten wij de pathogeniciteit ervan in deze gastheer door 20 4-weken oude varkens te enten met 2 × 106 50% weefselkweek infectieuze dosis (TCID50) van het Sw/4296424-virus. Er werd slechts één H2N3-virus gekozen, wegens de grote identiteit van de twee isolaten. Twaalf controlevarkens werden geënt met niet-besmettelijk celcultuursupernatant. De overdraagbaarheid werd beoordeeld door tien leeftijdsgelijke contactvarkens te cohousingeren met de geïnoculeerde varkens, te beginnen op dag 3 p.i. Alle voor de studie gebruikte varkens waren op dag 0 seronegatief voor antilichamen tegen varkensinfluenza H1N1-, H1N2-, H2N3- en H3N2-virussen met behulp van een HI-test. Vijf geïnoculeerde varkens en drie controlevarkens werden geëuthanaseerd voor necropsie op dagen 3, 5, en 7 p.i. De 10 contactvarkens en 5 virus-geïnoculeerde varkens werden serologisch getest door HI-test met H2N3 op respectievelijk dag 24 na contact of dag 27 p.i.. Er werden geen acute respiratoire symptomen waargenomen. Bij necropsie werden ernstige macroscopische longlaesies (pruimkleurige, geconsolideerde gebieden) aangetroffen bij geïnoculeerde varkens, maar niet bij controlevarkens (tabel 2). De histopathologische score (0-3) die de mate van beschadiging van de longarchitectuur weergeeft, was >2 bij geïnoculeerde varkens (Tabel 2). Longen van geïnoculeerde varkens die op dag 3, 5 of 7 p.i. werden geëuthanaseerd, vertoonden milde tot matige interstitiële pneumonie en acute tot subacute necrotiserende bronchiolitis met lichte lymfocytaire cuffing van bronchiolen en vaten (Fig. 2). Het virus werd getiterd in bronchoalveolaire lavage vloeistof (BALF) en geïsoleerd uit neusswabmonsters. Virus titers in de longen varieerden van 104.3 tot 106.5 TCID50/ml op dagen 3 en 5 p.i. (SI Tabel 8) en waren negatief op dag 7 p.i. In de H2N3 geïnoculeerde groep werd virus geïsoleerd uit neusswabmonsters bij 25% (5 van 20) van de varkens op dag 3, 67% (10 van 15) op dag 5, en 20% (2 van 10) op dag 7 p.i.; in de contactgroep was 10% (1 van 10) van de monsters positief op dagen 5 en 7 na contact. Daarentegen was 100% (10 van de 10) van de contactvarkens seropositief na 24 dagen contact met geïnoculeerde varkens (SI Tabel 9). Sommige controlevarkens hadden af en toe een kleine focus van milde interstitiële pneumonie (tabel 2), maar zij waren negatief voor besmetting met het varkensinfluenzavirus. Alle varkens waren negatief voor PRRSV en M. hyopneumoniae door PCR. Onze resultaten geven aan dat het H2N3 virus pathogeen is bij varkens en overdraagbaar is tussen varkens.

Pathogeniciteit van H2N3-varkensinfluenzavirussen in muizen.

Om het vermogen van het H2N3 Sw/4296424-virus om zich in muizen te vermenigvuldigen te testen, inoculeerden we 6- tot 7-weken oude BALB/c muizen intranasaal met 102-106 TCID50. Muizen die geïnoculeerd werden met 104 TCID50 of meer vertoonden ziekteverschijnselen (bv. moeizame ademhaling, ruwe vacht, gewichtsverlies en lethargie) (SI Tabel 10). Vijfenzeventig procent van de muizen die 106 TCID50 kregen, stierven, maar er waren geen sterfgevallen bij lagere doses. Viraal RNA werd gedetecteerd door real-time RT-PCR (17) in de longen van muizen na inoculatie met 106 of 105 TCID50 (SI Tabel 10). Histopathologisch, het H2N3-virus geïnduceerde meerdere of samenklonterende foci van interstitiële pneumonie en proliferatieve alveolitis gekenmerkt door prominente pneumocyt hypertrofie en infiltratie van alveolaire wanden met een gemengde populatie van macrofagen, lymfocyten, en neutrofielen (SI Fig. 3). Sommige alveolaire lumens bevatten fibrine stolsels en lichte gemengde leukocytaire exsudaten. Samen geven deze bevindingen aan dat H2N3 pathogeen is in muizen zonder voorafgaande aanpassing.

Overdraagbaarheid van H2N3 varkensinfluenzavirus bij fretten.

Om een pandemie te veroorzaken, moet een opkomend influenza A-virus mensen infecteren en efficiënt onder mensen worden overgedragen. Om te onderzoeken in hoeverre het reassortante H2N3-virus in zoogdiersystemen overdraagbaar is, hebben wij gebruik gemaakt van het contactmodel van fretten (18). Drie 18 weken oude fretten, gehuisvest in aparte kooien, werden geïnoculeerd met 102,5 TCID50 van het H2N3 virus Sw/2124514. Na 24 uur werd in elke kooi een contactdier geplaatst. Nasale spoelingen werden genomen op dag 1, 4, en 7 p.i., en het virus werd getitreerd in geëmbryoneerde eieren. Bij alle geïnoculeerde en contactgeïnoculeerde fretten werd virus aangetoond, maar geen van hen vertoonde duidelijke klinische symptomen (tabel 3). Deze resultaten wijzen erop dat het H2N3 influenzavirus fretten besmette en efficiënt via contact werd overgedragen.

Serologisch onderzoek van H2N3-varkensinfluenzavirussen op uitbraakbedrijven.

Om de verspreiding van de H2N3-virussen verder te onderzoeken, voerden we een beperkt serologisch onderzoek uit bij dieren die geassocieerd waren met de twee getroffen productiesystemen. In de eerste studie, in het voorjaar van 2007, werden serummonsters genomen van zeugen van vier bedrijven die biggen leverden aan de kraambedrijven tijdens de uitbraak in september 2006. Negentig procent (54 van 60) was seropositief voor de aanwezigheid van antilichamen tegen Sw/4296424 (SI-tabel 11). Een aantal van de geteste dieren was aanwezig ten tijde van het indexgeval, en het is onduidelijk of zij toen besmet waren dan wel nadien besmet zijn geraakt. Uit de gegevens blijkt echter wel dat het virus zowel op zeugen- als op kwekerijbedrijven aanwezig was en dat het virus efficiënt tussen dieren werd overgedragen. Alle zeugen in deze operatie hadden antilichaamtiters >1:40 tegen H1N1- en H3N2-varkensinfluenzavirussen, omdat zij eerder waren gevaccineerd met een bivalent gedood H1N1- en H3N2-vaccin.

Serummonsters werden in het voorjaar van 2007 ook verzameld bij 30 zeugen en 90 gespeende varkens die in verband werden gebracht met de uitbraak van april 2006, en zij werden getest op de aanwezigheid van antilichamen tegen Sw/2124514 met behulp van de HI-test. Van de 30 bemonsterde zeugen en 90 gespeende varkens waren respectievelijk 1 van de 30 en 26 van de 90 seropositief (SI-tabel 11).