Junction Melting

Als een eerste stap om de toepasbaarheid van het 3SPN.2 model voor het voorspellen van bulk thermodynamische eigenschappen van de Holliday junctie te beoordelen, evalueren we de junctie smelteigenschappen uit simulaties van het 3SPN.2 model en vergelijken dit met onze absorptie-experimenten. We simuleren het smelten van de Holliday junctie via replica-exchange molecular dynamics (REMD, zie methoden) om de sampling van gedeeltelijk gesmolten toestanden te verbeteren. Nauwkeurige bemonstering van de relatieve fractie van intacte, gesmolten en gedeeltelijk gesmolten junctieconfiguraties is momenteel niet mogelijk met behulp van een all-atomrepresentatie.

Figuur 2 toont de enkelstrengsfractie α als functie van T over een reeks zoutconcentraties voor zowel het 3SPN.2 model als absorptiemetingen. Zie methoden voor de definitie van α in simulaties. De overeenkomst tussen de simulaties en de experimenten is opvallend. Zowel de simulaties als de experimenten laten zien dat de smelttemperatuur toeneemt met toenemende zoutconcentratie en dat de overgang steeds scherper wordt, of “coöperatief”. De gegevens kunnen goed worden beschreven door de wet van de massa-actie, of van’t Hoff-relatie46,

Smeltingseigenschappen van de J34-verbinding.

Vergelijking van de enkelstrengsfractie α uit (a) simulaties en (b) experimenten. We passen de gegevens met behulp van de van’t Hoff-vergelijking (vergelijking 1), aangegeven door de ononderbroken lijnen. Volgens afspraak definiëren we TM als de temperatuur waarbij α = 0,5.

waar K de evenwichtsconstante voor het smelten van de junctie is, ΔH en ΔS het enthalpie- en entropieverschil tussen de gesmolten en intacte junctie zijn, waarvan wordt aangenomen dat ze constant zijn over dit temperatuurbereik en C de totale strengconcentratie is (de concentratie van elke streng is C/4). Merk op dat ΔS de scherpte van de smeltovergang bepaalt. We zullen het gedrag van ΔH en ΔS hieronder bespreken, die worden bepaald uit pasgegevens in het bereik 0,1<α<0,9.

De smelttemperatuur TM is een nuttige thermodynamische metriek van verbindingsstabiliteit en wordt gewoonlijk gedefinieerd als de temperatuur waarbij α = 1/2. Figuur 3 toont de experimentele en gesimuleerde TM-waarden als functie van de zoutconcentratie. Zoals verwacht uit de smeltkrommen weerspiegelen de simulaties nauwgezet de experimentele afhankelijkheid van TM. Ook de kwantitatieve overeenkomst is opmerkelijk. De simulatieresultaten zijn consistent verschoven naar hogere T met 5 tot 8 K, een verschil van minder dan 3%. Voor zowel experimenten als simulaties is de smelttemperatuur vrijwel onafhankelijk van de zoutconcentratie voor ≥ 200 mM. Deze onafhankelijkheid houdt verband met de afscherming van elektrostatische interacties bij hoge zoutconcentraties; daarom toont Fig. 3 ook de Debye-afschermingslengte die in het 3SPN.2 model wordt gebruikt voor de Debye-Hückel benadering van de elektrostatische interacties. De afschermlengte is <6 Å bij hoge zoutconcentraties, waardoor de elektrostatische afstoting onbelangrijk is. De overeenkomst tussen de TM-waarden van het experiment en de simulatie valideert de benaderende behandeling van de elektrostatica in het 3SPN.2-model. Aangezien het 3SPN.2 model alleen geparametriseerd was om het smelten van duplex B-DNA na te bootsen, suggereren de gegevens over het smelten van knooppunten dat het 3SPN.2 model overdraagbaar is op de thermodynamica van complexere DNA structuren. Tegelijkertijd is deze bevinding niet geheel onverwacht, omdat het smelten van elke arm zeer vergelijkbaar zou moeten zijn met dat van gewoon duplex-DNA.

Afhankelijkheid van de zoutconcentratie van de junctie-smelttemperatuur TM.

Bij alle concentraties verschilt TM met <3% tussen 3SPN.2 simulaties (groene cirkels) en absorptie-experimenten (rode diamanten). De lijnen zijn slechts bedoeld als richtlijn voor het oog. De figuur toont ook de Debye-afschermingslengte die door het 3SPN.2-model wordt gebruikt in de Debye-Hückel-benadering van de elektrostatische interacties. Het plateau van de smelttemperatuur valt samen met een sterke afscherming van de elektrostatische interacties.

Het passen van de gegevens met behulp van de van’t Hoff-relatie (vergelijking 1) levert een schatting op van de enthalpie en entropie van het smelten. De waarden van ΔH en ΔS uit deze fit zijn van de juiste orde van grootte die zou worden verwacht op basis van de thermodynamische parameters bepaald door Santa Lucia en collega’s47,48. De inzet van Fig. 4 toont dat de simulaties de ΔH en ΔS waarden licht overschatten ten opzichte van de experimenten en dat ΔH bijna lineair varieert met ΔS. Deze lineaire relatie wordt soms aangeduid als een “compensatie”-relatie. In feite impliceert de van’t Hoff vergelijking een specifiek verband tussen ΔH en ΔS

Thermodynamica van het smelten van juncties.

De entropie ΔS en enthalpie ΔH van het smelten, verkregen door de experimenten (rode diamanten) en simulaties (groene cirkels) te laten passen op de van’t Hoff-vergelijking (vergelijking 1). De inzet toont een bij benadering lineaire entropie-enthalpiecompensatierelatie. Zowel de experimentele als de gesimuleerde gegevens vertonen een betere overeenkomst met de van’t Hoff-vergelijking die bij TM wordt geëvalueerd (eq. 2, blauwe lijn).

die volgt uit eq. 1 door α = 1/2 bij TM te stellen. Figuur 4 toont aan dat deze relatie consistent is en verduidelijkt dat de lineaire compensatie tussen ΔH en ΔS slechts bij benadering geldt; als de TM-waarden sterker zouden variëren met de concentratie, zouden de afwijkingen van de lineariteit tussen ΔH en ΔS duidelijker zijn, terwijl eq. 2 geldig zou moeten blijven. Vanuit praktisch oogpunt is het belangrijker dat deze resultaten de doeltreffendheid aantonen van het 3SPN.2 model in het reproduceren van energetische en thermodynamische eigenschappen van de juncties die nauw overeenstemmen met de experimentele gegevens.

Conformational Abundances and Structure

Om verder te peilen naar het vermogen van het 3SPN.2 model om experimentele junctie-eigenschappen te voorspellen, onderzoeken we de relatieve populatie van junctieconformaties. Experimenteel is bekend dat de open vlakke vorm overheerst bij lage zoutconcentraties, en dat bij hogere zoutconcentraties de juncties gestapelde conformatie aannemen (Fig. 1). Bij een relatief hoge concentratie = 50 mM en T = 298 K, wijzen experimenten op een 23/77% relatieve abundantie van de gestapelde isovormen I/II, respectievelijk15. Hier gebruiken we het 3SPN.2 model om een breed scala van zoutconcentraties te onderzoeken bij T = 300 K om het model te valideren en een voorspelling te doen voor de algehele zoutconcentratie-afhankelijkheid van junction populaties. Merk op dat we het effect van Na+ onderzoeken, in plaats van Mg2+, wat vergelijkbare resultaten oplevert16,45.

Zoals Thirumalai en collega’s benadrukten26, kan de overeenkomst tussen een tijdgemiddelde en het ensemblegemiddelde (ergodiciteit) voor vierwegsjoints worden verbroken over vrij grote observationele tijdschalen, als gevolg van de snelheid van de conversie tussen junctieconformatie. Om de relatieve populaties van de gestapelde conformiteiten te schatten, hebben we dus een aanzienlijk ensemble van simulaties nodig. Daarom voeren we voor elke zoutconcentratie 100 onafhankelijke simulaties uit, elk beginnend vanuit de open configuratie, aangezien deze conformatie snel en willekeurig converteert naar ofwel iso-I ofwel iso-II. Elke simulatie wordt uitgevoerd gedurende 2 μs, wat 200 μs totaal van trajectgegevens voor elke zoutconcentratie, verdeeld over 100 onafhankelijke monsters. Dit geeft een eerste schatting voor de relatieve bevolking van elke conformatie. Op basis van deze schatting hebben we 100 simulaties met een verhouding van open, iso-I of iso-II initiële configuraties die overeenkomen met de voorlopige schatting van de bevolking om te zien of onze resultaten gevoelig zijn voor het starten vanuit de open toestand. We vinden dat de populatieschattingen stabiel blijven binnen onze statistische onzekerheid, zodat we geen significante effecten vinden als gevolg van het starten in de open toestand. Onze resultaten worden beïnvloed als we ofwel alle iso-I of alle iso-II initiële configuraties gebruiken, als gevolg van de relatief langzame inter-conversie van deze toestanden.

Om de junction populaties te evalueren, moeten we een metriek identificeren die nauwkeurig onderscheid maakt tussen de drie primaire junction conformaties. Experimenteel, FRET studies gebruiken meestal de afstand tussen de uiteinden van de geselecteerde armen (die de inter-duplex hoek definieert) om conformatie staten te onderscheiden. Wij onderzochten aanvankelijk de inter-duplex hoek, maar ontdekten (zoals later wordt besproken) dat de IDA aanzienlijk fluctueert in elke isovorm, waardoor het moeilijk is om eenduidig conformaties te onderscheiden. In plaats daarvan vonden wij dat de inter-base scheidingen in de buurt van het hart van de junctie een meer betrouwbare indicator van junctieconformatie bieden. Deze afstanden moeten ook experimenteel toegankelijk zijn met behulp van een paar fluorescerende nucleotide base-analogen, zoals 6-methyl isoxanthopterine (6-MI) of 2-aminopurine, oordeelkundig dicht bij het knooppunt centrum geplaatst. De onderste panelen van Fig. 1 tonen de acht basen in de kern van de verbinding in de iso-I en iso-II-conforme vorm, evenals de open vorm. In de iso-I-conforme vorm is de scheiding dTT van de T-basen (op de strengen X en H) en de scheiding dCC van de C-basen (ook op de strengen X en H) veel kleiner dan de scheidingen dAG van de A- en G-basen (op de B- en R-strengen); in de iso-II-conforme vorm leidt de omgekeerde stapeling tot het tegenovergestelde gedrag van de relatieve afstanden. In de open vorm zijn al deze afstanden vergelijkbaar, maar groter dan de afstanden van de gestapelde iso-I en II-conformeren.

Daarom zouden we in staat moeten zijn om onderscheid te maken tussen iso-I en II eenvoudigweg op basis van deze inter-base scheidingen. Om dit te bevestigen, zetten we in Fig. 5 de genormaliseerde frequentieverdeling van de inter-base afstanden P(dTT ∪ dCC) en P(dAG) uit, die de aanwezigheid van twee verschillende pieken aantoont voor alle concentraties ≥50 mM. Voor P(dAG) (Fig. 5a) geeft de piek bij de kleine scheiding de iso-II-conforme toestanden aan en de piek bij de grotere scheiding is te wijten aan iso-I of open conformaties. Voor P(dTT ∪ dCC) (fig. 5b) duidt de piek bij kleine afstanden op iso-I-conforme toestanden en de piek bij grotere afstanden op iso-II-conforme of open conformaties. We nemen een cut-off van 12 Å afstand, de geschatte locatie van het minimum van de verdelingen, om knooppunten te onderscheiden als ofwel de gestapelde iso-I of iso-II conformer. De configuraties die noch als iso-I noch als iso-II worden geïdentificeerd, worden geclassificeerd als open conformers. In overeenstemming met de verwachting dat de open conformatie domineert bij lage zoutconcentratie, heeft geen van beide verdelingen een piek voor kleine scheidingen en worden dus bijna alle configuraties bij laag zout geïdentificeerd met de open conformatie.

Criterium voor het onderscheiden van conformatie van knooppunten.

Distributie van de afstand tussen de basen in het midden van de junctie voor (a) de AG basen, waar een kleine afstand de iso-II conformer identificeert en (b) TT of CC paren, waar een kleine afstand de iso-I conformer identificeert. De langere afstandspiek bij lage zoutconcentratie is te wijten aan open conformatie; bij hoger zout is hij voornamelijk het gevolg van de complementaire gestapelde vorm. De verticale stippellijn geeft het afkapcriterium aan dat we gebruiken om vervolgens conformatiestoestanden van individuele configuraties te identificeren.

Door deze criteria te gebruiken om conformers te onderscheiden, identificeren we individuele configuraties met een van de drie isomeren en tonen representatieve tijdreeksen van junctieconformaties voor vijf simulaties bij = 300 mM in Fig. 6a. Figuur 7a toont representatieve configuraties van deze conformers. De tijdreeksgegevens tonen kwalitatief aan dat de open conformatie extreem kort leeft en fungeert als een overgangstoestand tussen de langlevende iso-I en iso-II conformeren. Dit is eerder afgeleid uit enkelvoudige molecuul experimenten8,15,16,50 en in deze studie observeren en bevestigen we expliciet het overgangsmechanisme tussen evenwichtsconformere toestanden. We tonen de rol van de open conformatie als intermediair kwantitatief aan door de negen overgangskansen (inclusief overgangen naar dezelfde conformatie) tussen de drie conformeren te evalueren. Uit figuur 6b blijkt dat de overgangskansen voor Iso I→II en II→I op de schaal van deze plots vanishingly klein zijn (nul, binnen de onzekerheid van onze berekening). Bijgevolg loopt het enige pad tussen de gestapelde conformeren door de open conformeer, waardoor deze de overgangstoestand wordt. Figuur 6c laat zien hoe de overgangskansen tussen de gestapelde en open conformatie variëren met de zoutconcentratie, waarbij de overgang naar de open toestand overheerst bij lage zoutconcentraties. De vijf tijdreeksen in Fig. 6a laten ook zien dat het tijdsgemiddelde van de gegevens varieert van monster tot monster. Het is duidelijk dat 2 microseconden onvoldoende is voor een ergodische bemonstering van de conformationele overvloed en onze benadering van het gebruik van een ensemble van simulaties noodzakelijk maakt. Deze aanpak is mogelijk voor het grofkorrelige model, maar gaat de huidige computermiddelen voor een all-atom model te boven. Deze “gebroken ergodiciteit” is vergelijkbaar met de experimentele bevinding dat conformatiebemonstering niet-ergodisch is op grote tijdschalen26. We moeten er echter op wijzen dat de gebroken ergodiciteit hier volledig te wijten is aan de stochastische aard van de conformationele bemonstering, terwijl in de experimenten van ref. 26 ook variaties in de binding van ionen aan individuele knooppunten een rol spelen.

Molecuul-tot-molecuul variaties in conformatiebemonstering en conformatie-overgangswaarschijnlijkheden.

(a) Voorbeeld tijdreeks van conformatie van knooppunten voor vijf van de 100 ensembleleden bij = 300 mM. De open isovorm is van korte duur en fungeert als overgangstoestand tussen iso-I en iso-II. (b) Matrix van de overgangskansen van een gegeven begintoestand naar de eindtoestand bij = 300 mM. De overgangskansen naar dezelfde toestand (diagonale elementen) worden niet getoond, omdat de neiging om in de huidige toestand te blijven de schaal van andere overgangskansen domineert49. Merk op dat de overgangskansen voor iso I→II (en vice-versa) bijna nul zijn. (c) Afhankelijkheid van de zoutconcentratie van de vier belangrijkste overgangskansen.

Junction conformatie, abundantie en structuur.

(a) Representatieve conformaties waargenomen in onze simulaties; alleen de DNA-backbone wordt getoond, voor de eenvoud. (b) De relatieve abundantie van de primaire isovormen als functie van de zoutconcentratie. De identiteit van de isovormen wordt bepaald door de basenscheidingen aan de binnenkant van de junctie, zoals beschreven in de tekst. (c) Inter-duplex hoek (IDA) voor elke conformatie. Merk op dat de open vlakke conformatie alleen overheerst bij laag zout. Bij een hoger zoutgehalte neemt de kleine fractie open conformaties (gemiddeld) een tetrahedrale conformatie aan.

Op basis van de tijdreeksgegevens voor junctieconformatie evalueren we direct de fractie configuraties in de open, iso-I of iso-II conformaties als functie van de zoutconcentratie (Fig. 7b). Zoals we verwachten, zien we bij lage zoutconcentraties (= 10 mM) in wezen alleen de open vlakke toestand met vierkante geometrie. Bij alle hogere zoutconcentraties hebben de gestapelde conformatievormen de voorkeur, met een gemiddelde van ≈58% in iso-II en 36% in iso-I (voor ≥200 mM). Onze simulaties voorspellen dat, behalve voor vrij lage zoutconcentraties, de relatieve fractie van conformeren niet significant afhangt van het zout. De dominantie van gestapelde conformaties bij hoge zoutconcentraties kan worden verwacht als gevolg van de sterke screening van elektrostatische interacties, vergelijkbaar met de zoutconcentratie-afhankelijkheid van de smelttemperatuur. Deze screening verklaart echter niet de voorkeur voor de gestapelde iso-II-conformatie. Het verschil in isomeerpopulatie moet het gevolg zijn van basevolgorde-effecten in de buurt van de junctiekern, zoals experimenteel is waargenomen16,17. Het feit dat het model de experimenteel bekende neiging tot iso-II reproduceert, geeft aan hoe succesvol het grofkorrelige model is in het vastleggen van de volgorde-afhankelijke structuur. We vinden ook een kleine fractie, 6%, van junctieconfiguraties in de open toestand bij hoog zout. Zoals hierboven besproken, zijn deze conformatievormen van korte duur en vergemakkelijken ze transformaties tussen de gestapelde conformatievormen. Vergeleken met de experimenten van Ha en collega’s15 bij relatief hoge zoutconcentraties, voorspelt het 3SPN.2 model de bias naar iso-II met ongeveer 15%. Het verschil kan gedeeltelijk te wijten zijn aan het verschil in experimentele en computationele criteria die gebruikt worden om isovormen te definiëren; meer bepaald onderzoeken wij de basenscheidingen aan de binnenkant van de junctie, terwijl de FRET-experimenten labels gebruiken die gevoelig zijn voor de scheiding van de uiteinden van de R- en X-armen van de junctie (effectief de IDA). Voor H-achtige conformatie met een open junctiecentrum (experimenteel waargenomen in aanwezigheid van endonucleasen12), zouden deze alternatieve benaderingen systematisch verschillen in hun classificatie: (i) op basis van junctie-einden zouden H-conformaties worden geclassificeerd als iso-I of II; (ii) omgekeerd, op basis van scheiding in de junctiekern, zouden H-conformaties worden geclassificeerd als open, zodat onze criteria altijd een kleinere gestapelde fractie zullen opleveren.

Omdat onze criteria ons in staat stellen de conformaties van individuele junctie-configuraties te categoriseren, kunnen we ook direct de gemiddelde structuur van elk van deze conformaties evalueren. Wij karakteriseren de junctiestructuur door de inter-duplexhoek (IDA), die wij definiëren als de hoek die door de XR- en RH-armen met het junctiehoekpunt wordt gevormd51. Dienovereenkomstig moet de IDA voor iso-II aanzienlijk kleiner zijn dan die van iso-I. Figuur 7c bevestigt deze verwachting, met de IDA van iso-II die 90° nadert bij hoge zoutconcentratie en de IDA van iso-I in de buurt van 140°. Een waarde van 90° voor iso-II is groot vergeleken met experimentele schattingen, die in de orde van 40-60° liggen op basis van evenwichts-FRET-metingen41,44,45, een punt waarop we nog zullen terugkomen. We moeten ook duidelijk stellen dat 90° voor iso-II geen vlakke configuratie impliceert, wat visueel duidelijk is in de representatieve configuraties in Fig. 7a; door de driedimensionale structuur kan zelfs een gestapelde structuur een hoek dicht bij 90° aannemen. Bij de laagste zoutconcentraties kunnen we de hoek voor gestapelde conformaties niet schatten, omdat ze in wezen niet worden bemonsterd. Bij = 10 mM, vinden we de IDA van de open kruising is 95 °, consistent met een bijna vlakke kruising, die ook visueel duidelijk in Fig. 7a. Bij hogere zoutconcentraties, de kleine fractie van open configuraties neemt een iets grotere hoek van ≈105 °. Deze grotere hoek komt overeen met een bijna tetrahedrale configuratie (Fig. 7a), die misschien moet worden beschouwd als verschillend van de vlakke open configuratie bij lage zoutconcentraties. Onze resultaten suggereren dus dat de overgangstoestanden tussen gestapelde conformeren overwegend open tetrahedrale conformaties zijn, eerder dan vlakke. Dergelijke tetrahedrale tussenvormen zijn eerder waargenomen in simulaties23. De mogelijkheid van een veelheid van junctieconformaties is inderdaad afgeleid uit de analyse van enkelvoudige molecuulgegevens26.

Junction Structure Comparisons

Als laatste vergelijkingspunt beschouwen we hoe de IDA geëvalueerd uit het 3SPN.2 model zich verhoudt tot experimentele metingen en die geschat uit onze all-atom AMBER simulatie. FRET-metingen hebben geschat dat de IDA van iso-II 43 ± 8° is bij T = 283 K en zoutconcentratie = 200 mM45. Daarom simuleren we zowel het AMBER als het 3SPN.2 model onder overeenkomstige condities, uitgaande van een initiële iso-II configuratie met een IDA van 43° (zie Fig. 1b). Voor zowel het 3SPN.2 als het AMBER model opent de junctie naar een grotere IDA en vestigt zich op een constante waarde na ≈50 ns (inzet Fig. 8). Het hoofdpaneel van Fig. 8 toont de IDA-waarden bemonsterd door elk model in de stationaire toestand. Het 3SPN.2-model vertoont grotere schommelingen van de IDA dan het AMBER-model, hoewel de gemiddelde IDA in beide modellen gelijk is. Kwantitatief is de gemiddelde IDA voor AMBER 85,3° met een standaardafwijking van 12,3°; voor 3SPN.2, is de gemiddelde IDA 95,7° met een standaardafwijking van 24,1°.

Vergelijking van de functiestructuur tussen het all-atom en het grofkorrelige model.

De IDA voor het all-atom AMBER-model (zwart) en het 3SPN.2 grofkorrelig model (rood) bij T= 283 K en = 200 mM. Het hoofdpaneel toont de verdeling van de bemonsterde IDA-waarden; de ononderbroken lijnen zijn de berekende frequentie en de stippellijnen zijn een normale verdeling met hetzelfde gemiddelde en dezelfde standaardafwijking als de gegevens. De inzet toont de oorspronkelijke tijdreeksen voor elk model, waaruit de verdelingen zijn bepaald. Merk op dat voor de 3SPN.2 model, hebben we 2 μs van gegevens, die niet allemaal worden weergegeven in de inzet.

De simulaties tonen beide een aanzienlijk grotere IDA dan verwacht uit de FRET metingen en kristallografische studies45,52. Dit kan erop wijzen dat geen van beide modellen een nauwkeurige schatting van de IDA geeft, of dat de benaderingen die moeten worden gemaakt om de IDA uit de FRET-gegevens te schatten, de IDA onderschatten. Zeker is dat bij bulk-FRET-experimenten de aanwezigheid van de externe kleurstoffen, de daaraan gekoppelde linkers en hun relatieve oriëntatie een aanzienlijke fout in de afstandsbepaling kunnen introduceren. De verschillen tussen de huidige IDA-bepalingen en die welke met behulp van kristallografie zijn gemeten, kunnen misschien het gevolg zijn van bepaalde beperkingen van het kristalrooster. Bij vergelijking van de all-atom en grofkorrelige modellen toont de bijna verdubbeling van de standaardafwijking duidelijk aan dat de verbindingsarmen flexibeler zijn in het grofkorrelige model. Dit kan gedeeltelijk te wijten zijn aan de afwezigheid van expliciet oplosmiddel, aangezien het oplossende water in de all-atom voorstelling noodzakelijkerwijs de flexibiliteit van de junctie-armen belemmert.