HNPCC mutaties in het menselijke DNA mismatch repair gen hMLH1 beïnvloeden de assemblage van hMutLα en hMLH1-hEXO1 complexen

Hereditaire nonpolyposis colorectale kanker (HNPCC) is een genetisch heterogene aandoening die wordt veroorzaakt door kiembaanmutaties in een van de verschillende MMR genen (Jiricny, 1998a,b), hoewel er momenteel aanwijzingen zijn dat kiembaanmutaties in hMSH2 en hMLH1 verantwoordelijk zijn voor de meerderheid van de HNPCC-gevallen (Peltomäki en Vasen, 1997). Dragers van het HNPCC-gen erven een mutatie in één van de allelen die coderen voor een MMR-gen, en de tweede kopie wordt gemuteerd of gaat verloren als een vroege gebeurtenis in de ontwikkeling van een tumor. Deze tweede gebeurtenis maakt cellen DNA mismatch repair (MMR) deficiënt, wat vermoedelijk leidt tot de snelle accumulatie van mutaties die tumorontwikkeling stimuleert. Wat precies de oorzaak is van de onderliggende aanleg voor colorectale kanker bij HNPCC individuen moet nog worden opgehelderd. Er is aangetoond dat een nauwkeurige assemblage van menselijke MMR complexen essentieel is voor een efficiënte MMR om de genomische integriteit te behouden (Drummond et al., 1997). Deze gegevens suggereren dat, afhankelijk van de aard van de mutatie in de MMR genen, en de expressie hiervan, de samenstelling, en daarmee de activiteit, van de DNA reparatie complexen varieert tussen HNPCC individuen. Ook kan de betrokkenheid van ten minste hMLH1 en hMSH2 bij andere cellulaire pathways, zoals DNA-recombinatie en controlepuntregulatie van de celcyclus (Jiricny, 1998a,b), die de stabiliteit van het genoom controleren, worden beïnvloed door mutaties in de hMLH1- en hMSH2-genen. Daarom kunnen de ontwikkeling van de tumor en het ziektebeloop variëren tussen HNPCC families (Jäger et al., 1997). Het belang van eiwit-eiwit interacties in de reparatiecomplexen wordt ondersteund door de bevindingen dat hMSH2 bestaat in complex met ofwel hMSH6 (hMutSα) of hMSH3 (hMutSβ) en het hMLH1 eiwit in complex met ofwel hPMS2 (hMutLα), hPMS1 (hMutLβ) of hMLH3 (Drummond et al., 1995; Li and Modrich, 1995; Lipkin et al., 2000; Palombo et al., 1995; Papadopoulos et al., 1995; Räschle et al., 1999). Er is ook interactie aangetoond tussen het hMSH2 eiwit en het humane exonuclease 1 (hEXO1) (Rasmussen et al., 2000; Schmutte et al., 1998). Hoewel het niet bekend is of hEXO1 betrokken is bij MMR, vertonen giststammen met een tekort aan exonuclease 1 activiteit een verhoogd spontaan mutatiepercentage en een kleine toename in recombinatie wanneer het heteroduplex intermediair base-base mismatches of kleine lussen bevat (Nicholson et al., 2000; Tischkoff et al., 1997, 1998). Het is bekend dat zowel exonuclease 1 (EXO1) als MMR-eiwitten betrokken zijn bij homologe recombinatie (Fiorentini et al., 1997; Saparbaev et al., 1996; Sugawara et al, 1997) en dat gist EXO1 een rol speelt bij dubbelstrengs breukreparatie en meiotische crossing over (Tsubouchi and Ogawa, 2000).

Vele studies van HNPCC hebben zich geconcentreerd op identificatie van mutaties in de hMLH1 en hMSH2 genen. Mutatie-analyse van deze genen geeft echter geen uitsluitsel over de moleculaire en biochemische defecten die aan deze ziekte ten grondslag liggen. Om de relatie tussen het verlies van de functie van het hMLH1 gen en HNPCC beter te begrijpen, hebben wij specifieke eiwit-eiwit interacties van de hMutLα en hMLH1-hEXO1 complexen gekarakteriseerd, gebruik makend van mutant vormen van hMLH1 die gevonden zijn in HNPCC patiënten. We gebruikten zowel het yeast two-hybrid systeem als een glutathione S-transferase (GST)-fusie-interactie (pull-down) assay om dergelijke eiwit-eiwit interacties respectievelijk in vivo en in vitro te bestuderen.

Het hMLH1 eiwit bestaat overwegend in een complex met hPMS2 ook bekend als het hMutLα heterodimer (Li en Modrich, 1995). De vorming van een hMutLα complex is essentieel voor MMR activiteit (Baker et al., 1995, 1996; Edelmann et al., 1996) en dus zou het onvermogen van HNPCC-hMLH1 eiwitten om een complex te vormen met hPMS2 kunnen resulteren in inefficiënte MMR activiteit bij HNPCC individuen. Om de mogelijke oorzaak die ten grondslag ligt aan HNPCC te onderzoeken, hebben we onderzocht of drie hMLH1-mutanten die geïdentificeerd zijn in Deense HNPCC-patiënten (Figuur 1) in staat waren tot interactie met hPMS2. De mutaties omvatten een threonine naar methionine missense mutatie bij codon 117 (T117M) van hMLH1 en twee nieuwe HNPCC mutaties, een nonsense mutatie (CAG naar TAG) bij codon 426 (Q426X) en een frame-shift mutatie (insertie van A bij nucleotide 1813) resulterend in een voortijdige stop bij codon 609 (1813insA) (figuur 1). De pull-down assay met recombinante GST-getagde HNPCC-eiwitten en in vitro getranscribeerd en vertaald (IVTT) hPMS2 toonde zoals verwacht de vorming van een complex tussen hMLH1 en hPMS2 (figuur 2a, lanen 5 en 10). Bovendien ontdekten we de vorming van een complex tussen HNPCC-hMLH1 (T117M) en hPMS2 (figuur 2a, rijstrook 11). Hoewel we vonden dat het HNPCC-hMLH1 (T117M) eiwit tot expressie komt in eukaryote NIH3T3 cellen (gegevens niet weergegeven) konden we de interactie met hPMS2 niet reproduceren in de gist two-hybrid assay (figuur 3a). Een verklaring voor deze discrepantie zou kunnen zijn de driemaal verminderde complexvorming tussen hPMS2 en het HNPCC-hMLH1 (T117M) mutante eiwit in vergelijking met de hPMS2 en hMLH1 eiwitten zoals gekwantificeerd met een fosfoimager (gegevens niet weergegeven) (figuur 2a, lanen 10 en 11). Complexvormingen tussen de hMLH1-eiwittrimcations, HNPCC-hMLH1 (Q426X) en HNPCC-hMLH1 (1813insA), en hPMS2 werden daarentegen in geen van de assays gedetecteerd (figuur 2a, rijstroken 12 en 13 en figuur 3a). In de pull-downreactie met HNPCC-hMLH1 (1813insA) en hPMS2 was een zwakke band zichtbaar (figuur 2a, laan 13), maar de intensiteit was vergelijkbaar met de band die werd verkregen in de reactie die alleen hPMS2-eiwit bevatte (figuur 2a, laan 3) en het is daarom onwaarschijnlijk dat deze band een echt complex tussen HNPCC-hMLH1 (1813insA) en hPMS2 vertegenwoordigt.

Consistent is eerder door middel van deletiemutagenese aangetoond dat de interactie tussen hMLH1 en hPMS2 wordt gemedieerd door het C-terminale deel van hMLH1 (aminozuren 506-756) en het C-terminale deel van hPMS2 (aminozuren 675-850) (figuur 1b) (Guerrette et al, 1999). De HNPCC-hMLH1 (T117M) mutatie is gerapporteerd in negen niet-verwante HNPCC-families uit verschillende delen van de wereld (www.nfdht.nl/database/mlh1-4.htm en gegevens niet weergegeven), wat suggereert, zoals reeds aangetoond in gist (Shcherbakova en Kunkel, 1999; Shimodaira et al., 1998), dat de mutatie geen gekoppeld polymorfisme is. De HNPCC-hMLH1 (T117M)-mutatie kleeft aan een geconserveerde sequentie (figuur 1), waarvan wordt aangenomen dat die direct betrokken is bij binding en/of hydrolyse van ATP (Ban et al., 1999). De HNPCC-hMLH1 (T117M) missense mutatie kan dus de MMR activiteit inactiveren door een verandering in het vermogen van dit mutante eiwit om ATP te binden en/of te hydrolyseren en daarmee complexvorming met andere MMR eiwitten. In overeenstemming met deze hypothese tonen wij aan dat HNPCC individuen die drager zijn van de HNPCC-hMLH1 (T117M), HNPCC-hMLH1 (Q426X) en HNPCC-hMLH1 (1813insA) mutaties verzwakt zijn in de vorming van hMutLα heterodimeren, wat leidt tot een defect in MMR activiteit wanneer het tweede hMLH1 allel verloren of geïnactiveerd is.

In een poging om weefselspecifieke MMR-geassocieerde factoren te identificeren, hebben wij en anderen onlangs een menselijk exonuclease geïdentificeerd dat interageert met hMSH2 (Rasmussen et al., 2000; Schmutte et al., 1998; Tishkoff et al., 1998; Wilson III et al., 1998). Wij toonden aan dat hMSH2 interageert met beide vormen van hEXO1, hEXO1b en hEXO1a/HEX1, en dat deze interactie wordt gemedieerd door hun C-terminale domeinen. In tegenstelling hiermee hebben we geen interactie tussen hMSH6 en hEXO1 gevonden in het two-hybrid systeem (Rasmussen et al., 2000). Het is niet bekend of hEXO1 een rol speelt in MMR of dat zijn interactie met hMSH2 belangrijk is voor recombinatie. Wij laten zien dat het hMLH1 eiwit, net als hMSH2, interacteert met beide vormen van hEXO1 (hEXO1b en hEXO1a/HEX1) en dat deze interactie gemedieerd wordt via de C-terminale domeinen van de exonucleasen (figuur 2b, lanen 5 en 8 en figuur 3). We detecteerden geen interactie tussen hPMS2 en hEXO1 (figuur 3a,c). Onze voorlopige gegevens suggereren dat de aanwezigheid van zowel hMLH1- als hPMS2-eiwitten niet verhinderde dat hEXO1 zich aan hMLH1 bindt (gegevens niet weergegeven). Daarom denken wij niet dat de vorming van hMutLα noodzakelijkerwijs de binding van hEXO1 aan hMLH1 blokkeert. Om de interactie tussen hMLH1 en hEXO1 verder te karakteriseren, hebben we fluorescente eiwitfusies van zowel hMLH1 als hEXO1 geconstrueerd en deze in NIH3T3-cellen ingebracht (figuur 4). Onze resultaten tonen aan dat CFP-hMLH1 voornamelijk aanwezig is in de kern, maar we detecteren ook een fractie van dit eiwit in het cytoplasma (figuur 4, paneel 1). In tegenstelling, we alleen detecteren YFP-hEXO1 in de kern (Figuur 4, paneel 2). Bij cotransfectie met YFP-hEXO1, echter, CFP-hMLH1 was volledig nucleaire (figuur 4, panelen 3 en 4).

Samenvattend tonen deze resultaten aan dat ten minste twee MMR-eiwitten, namelijk hMSH2 en hMLH1, interageren met humaan exonuclease 1, terwijl twee andere MMR-eiwitten, hPMS2 en hMSH6, niet direct betrokken zijn bij de interactie met hEXO1 wanneer deze in de in vivo two-hybrid assay worden beoordeeld.

Om te onderzoeken of de interacties tussen hMLH1 en hEXO1 mogelijk zijn aangetast bij HNPCC patiënten, werd de associatie van de drie hierboven beschreven hMLH1 mutante eiwitten met hEXO1 gekarakteriseerd. Positieve interactie werd alleen aangetoond tussen HNPCC-hMLH1 (T117M) en het full-length hEXO1b eiwit via de in vitro pull-down assay (figuur 2b, laan 9). Met behulp van de in vivo two-hybrid assay konden eiwit-eiwit interacties tussen de HNPCC-hMLH1 eiwitten en de geteste exonuclease 1 constructen echter niet worden gedetecteerd (figuur 3). We konden de interactie tussen full-length hEXO1 gefuseerd met het GAL4 activeringsdomein en de hMLH1 eiwitten niet bestuderen omdat deze constructen niet functioneel zijn in de gist two-hybrid assay (Rasmussen et al., 2000). Evenzo vonden we dat de hMLH1 en de hMLH1 derivaten gefuseerd met het GAL4 activeringsdomein resulteerden in fusie-eiwitten die niet functioneel zijn in de two-hybrid assay (figuur 3 en data not shown).

Concluderend blijkt uit onze resultaten dat drie nieuwe HNPCC-hMLH1 mutaties waarvan bekend is dat ze samengaan met de gevoeligheid voor kanker in HNPCC patiënten leiden tot een defect in de assemblage van het hMutLα heterodimeer dat kan resulteren in een verminderde MMR activiteit. Evenzo zijn de HNPCC-hMLH1 mutante eiwitten ook niet in staat tot interactie met het nieuw geïdentificeerde hEXO1 eiwit, een eiwit dat nu blijkt te interageren met hMLH1 en hMSH2, maar niet met hMSH6 en hPMS2. Op dit moment blijven de precieze biologische routes en algemene bijdragen van deze gedocumenteerde interacties onduidelijk, grotendeels omdat hMLH1 een rol blijkt te spelen in zowel MMR als recombinatie. Het ontleden van de moleculaire defecten in HNPCC door het testen van pathogene MMR eiwitten in functionele assays ontworpen om interacties in de eiwitcomplexen te kwantificeren zou, samen met mutatie screening, immunohistochemie en microsatelliet analyse, moeten helpen bij het ontwikkelen van strategieën om HNPCC dragers te diagnosticeren en te behandelen.

Virtual world

Geef een antwoord Antwoord annuleren

Recente berichten