Typen hemocyten bij krekels

Figuur 1A toont een differentieel interferentie contrast (DIC) microscopie beeld van krekel hemocyten, met cellen van verschillende grootte en vorm. Voor een nauwkeurige identificatie van deze hemocyten, werden ongeveer 1.000 cellen geclassificeerd door hun grootte en morfologie (data niet weergegeven) in zes types (Fig. 1B ~ G). Zoals getoond in Fig. 1B, werd de typische granulocyt waargenomen in de hemolymfe. De granulocyten waren meestal rond of ovaal van vorm, en er werden veel polymorfe granules waargenomen in het cytoplasma. Kleine pseudopodia of filopodia werden waargenomen op het plasmamembraan van de granulocyt (Fig. 1B, aangegeven met witte pijlen). De cel getoond in Fig. 1C werd beschouwd als plasmatocyten vanwege hun typische spindelvorm en de lange, haarachtige structuren waargenomen aan beide uiteinden van het plasmamembraan (aangegeven met witte pijlen). Figuur 1D toont een prohemocyte, dat zijn de kleinste ronde cellen waargenomen in het insect hemolymfe. De kernen waren groot in verhouding tot de celgrootte en bevonden zich in het midden van de cel (Fig. 1D). Het cytoplasma en de kern van de prohemocyten waren dus vaak niet te onderscheiden. Figuur 1E toont een coagulocyt met verschillende cytoplasmatische granules. De plasmamembranen van de coagulocyten waren glad, zonder enige structuur, en hun kernen waren groot en gemakkelijk waar te nemen. De oenocytoïden waren het grootste type hemocyt dat werd waargenomen en waren schaars in de hemolymfe (Fig. 1F). De oenocytoïden hadden meestal een ronde spiegeleivorm met talrijke cytoplasmakorrels. Figuur 1G toont een sferulocyte, die rond en middelmatig groot waren met vele kleine donkere of glimmende granules in het cytoplasma. Zoals getoond in Fig. 1D~G waren er geen structuren zichtbaar op de plasmamembranen van de prohemocyten, coagulocyten, oenocytoïden, of sferulocyten, die optisch zeer glad waren.

De zes typen hemocyten die in het bloed van krekels werden waargenomen. Algemene vorm en relatieve grootte van hemocyten in de hemolymfe (A). De zes typen hemocyten die bij G. bimaculatus werden aangetroffen, werden op basis van grootte en morfologie ingedeeld in granulocyten (B ; GR), plasmatocyten (C ; PL), prohemocyten (D ; PR), coagulocyten (E ; CO), oenocytoïden (F ; OE), en sferulocyten (G ; AD). De waaiervormige of amoebe-achtige structuren op de plasmamembraan van granulocyten en plasmatocyten zijn aangegeven met witte pijlen (B en C). Schaalbalk = 25 µm (A) of 10 µm (B~G).

Nodulatie en inkapseling door hemocyten

In insecten worden cellulaire immuunreacties zoals nodulatie, inkapseling, en fagocytose uitgevoerd door immune hemocyten zoals granulocyten en plasmatocyten. Na blootstelling aan pathogenen veranderen deze hemocyten van vorm en ontwikkelen ze grote amoebe- of waaierachtige structuren in hun plasmamembranen. Om deze snelle morfologische veranderingen in real time te observeren, ontwikkelden wij een techniek die ons in staat stelt insectenhemocyten gedurende 7 dagen te kweken met behoud van fysiologische activiteit (beschreven in de Materialen en Methoden). Hoewel we niet konden stabiele hemocyte lijnen die kunnen worden doorgegeven voor meerdere jaren vast te stellen, waren we in staat om de morfologie van hemocyten te observeren in reactie op pathogenen in vitro. Aanvullende Movie C toont alleen hemocyten na 12 uur incubatie. De meeste gekweekte cellen waren actief in beweging. Sommige cellen vertoonden netten rond het celmembraan tijdens de kweek en bleken vast te zitten aan de kweekglaasjes. De hemocyten aggregeerden zelden of vormden grote clusters.

Figuur 2A toont hemocyten gekweekt met E. coli (zie ook Supplementary Movie 1). Sommige hemocyten waren meer geaggregeerd en in beweging. Naarmate de incubatietijd toenam, werden netten (amoebe-achtige haren of extracellulaire vallen) geproduceerd door specifieke hemocyten, en verschillende hemocyten werden bijeengebracht door deze netten om grote clusters te vormen (Fig. 2A-1~A-6; amoebe-achtige haren of extracellulaire vallen aangegeven met zwarte pijlen). Zoals getoond in Fig. 2A-1, werden drie groepen hemocyten (aangegeven door zwarte cirkels) uiteindelijk tot één cluster getrokken door de netten (Fig. 2A-5 en A-6).

Live-cell beelden van krekel hemocyten geïnfecteerd met E. coli of Sephadex kralen. (A) Lichtmicroscoop beelden tonen hemocyten gekweekt met E. coli. Naarmate de incubatietijd toenam, werden netten (amoebe-achtige haren of extracellulaire vallen; aangegeven met zwarte pijlen) geproduceerd door specifieke hemocyten. Alle zes soorten hemocyten werden geaggregeerd tot grote clusters door deze netten (A-1 ~ A-6; aangegeven door zwarte vakken). Film beschikbaar als Movie 1 (tijd in minuten post-inoculatie). (B) Lichtmicroscoop beelden tonen hemocyten gekweekt met Sephadex kralen. Sephadexkorrels rond de hemocyten waren willekeurig gelabeld SP1, SP2, SP3, SP4, en SP5. Na verloop van tijd, de Sephadex kralen (SP1, SP2, SP3, en SP4) werd omgeven door hemocyten en ingekapseld door verschillende soorten netten (B-1 ~ B-9, aangegeven met zwarte pijlen). Film beschikbaar als Movie 2 (tijd in minuten post-inoculatie). Schaalbalk = 25 µm (A en B). Film C toont hemocyten die alleen zijn gekweekt, zonder Sephadex-korrels. De meeste hemocyten waren actief in beweging. Enkele cellen waren met netten van plasmamembranen aan de kweekglaasjes bevestigd. Grote clusters van hemocyten werden echter niet waargenomen.

Het was echter niet mogelijk om vast te stellen of het hierboven beschreven samenkomen van de hemocyten werd uitgelokt door E. coli. Om deze vraag te beantwoorden, werden de hemocyten geactiveerd met Sephadex korrels (120 μm diameter), die gemakkelijk kunnen worden waargenomen met een DIC microscoop (Fig. 2B, Supplementary Movie 2). Zoals getoond in Fig. 2A, werden de Sephadex kralen gevangen door de netten gegenereerd door specifieke hemocyten (Fig. 2B; netten aangegeven door zwarte pijlen in de gele vakken). De Sephadexkorrels rond de hemocyten werden willekeurig gelabeld als SP1, SP2, SP3, SP4 en SP5. Zoals te zien is door Fig. 2B-2 en B-3 te vergelijken, werden SP1, SP2, en SP3 samengetrokken en in het gebied aangegeven door het gele vakje. Bovendien werd SP1 uiteindelijk volledig omgeven door verschillende hemocyten (Fig. 2B-9). De kraal gelabeld SP4 werd ook opgenomen in de cluster met SP1, SP2, en SP3 (Fig. 2B-4 ~ B-9; aangegeven door het gele vakje). Na verloop van tijd, alle Sephadex kralen (SP1, SP2, SP3, en SP4) werd omgeven door vele hemocyten. Daarentegen werden individuele hemocyten waargenomen in contact met SP5, maar deze werd niet getrokken in het gebied aangegeven door het gele vakje, ook al bevond deze zich in een vergelijkbare positie als SP1. Daarom leek nodulatie door hemocyten willekeurig te gebeuren.

Granulocyte activering door carboxylaat gemodificeerde polystyreen latex korrels

Volgende, onderzochten we welke hemocyten de netten produceerden en deelnamen aan de verschillende stappen van de immuunrespons, inclusief inkapseling en nodulatie. Voor dit doel werden carboxylaat gemodificeerde polystyreen latex kralen, die gemakkelijk kunnen worden waargenomen met een DIC microscoop, gebruikt in plaats van pathogenen, en real-time beelden van de hemocyten werden verzameld. Figuur 3A toont hemocyten gestimuleerd met carboxylaat gemodificeerde polystyreen latex kralen gedurende 12 uur (Supplementary Movie 3). De netten geproduceerd door de hemocyten (aangegeven door zwarte pijlen) actief bewogen rond de latex kralen (aangegeven door rode pijlen) (Fig. 3A-1). Na verloop van tijd werden de parels opgeslokt door de netten en uiteindelijk kon worden gezien in het cytoplasma van de hemocyten (Fig. 3A-2~A-4). Echter, niet elke carboxylaat gemodificeerde polystyreen latex kraal die een net tegenkwam werd gefagocytoseerd. De beweging van de geactiveerde hemocyten leek dus niet precies overeen te komen met de beweging van de korrels.

Live-cell beelden van granulocyten gestimuleerd met carboxylaat gemodificeerde polystyreen latex korrels. (A) Lichtmicroscoop beelden tonen hemocyten gekweekt met gecarboxyleerd-gemodificeerde polystyreenlatex korrels voor 12 h. A-1 ~ A-4, gekweekte hemocyten na 12 ~ 18 min. De netten geproduceerd door de hemocyten (zwarte pijlen) kan worden gezien vormen rond de latex bolletjes (aangegeven door rode pijlen). De latex bolletjes werden opgeslokt door de netten en uiteindelijk gevangen in het cytoplasma van de hemocyten (A-4). Film beschikbaar als Movie 3 (tijd in minuten na stimulatie). Schaal balk = 40 µm. (B) Vergrote beelden. (B-1) Na 4 uur werden veel carboxylaat gemodificeerde polystyreen latex bolletjes gevangen door hemocyten (latex bolletjes, rode pijlen; en specifieke hemocyten, witte cirkels). (B-2 ~ B-6) Gekweekte granulocyten op 0, 2, 4, 12, en 48 uur na stimulatie. (B-2) Rustende granulocyten, die rond of ovaal van vorm zijn. (B-3) Op 2 uur na stimulatie, de granulocyten begon te morfologische veranderingen te vertonen, en ventilator-achtige of amoebe-achtige plasmamembraan structuren (witte pijlen) kan worden gezien. (B-4 en -5) Een groot aantal latexbolletjes had zich in het cytoplasma van de granulocyten opgehoopt bij 4 en 12 uur na de besmetting. (B-6) Door 48 h post-infectie, had veel latex parels geaccumuleerd in de granulocyte cytoplasma, maar netten werden niet meer waargenomen, en veel granulocyten leek te zijn inert. Schaalbalk = 15 µm (B-1) of 10 µm (B-2~B-6).

Gedetailleerde waarnemingen werden gemaakt met behulp van een confocale microscoop met hoge vergroting (Fig. 3B). Bij 4 uur na infectie konden de carboxylaatgemodificeerde polystyreenlatexbolletjes binnen bepaalde hemocyten worden waargenomen (fig. 3B-1; bolletjes aangegeven met rode pijlen, en specifieke hemocyten aangegeven met witte cirkels). We vervolgens waargenomen welke specifieke cellen opgeslokt de latex bolletjes in meer detail (Fig. 3B-2 ~ B-6). Figuur 3B-2 toont granulocyten in rust, die meestal rond of ovaal van vorm waren, met veel polymorfe donkere korrels in het cytoplasma. 2 uur na stimulatie met carboxylaat-gemodificeerde polystyreenlatexkorrels begonnen de granulocyten morfologische veranderingen te vertonen, waaronder waaiervormige of amoebe-achtige uitsteeksels van het plasmamembraan (fig. 3B-3; aangegeven met witte pijlen). Carboxylaat gemodificeerde polystyreen latex bolletjes werden waargenomen in het cytoplasma van granulocyten bij 4 uur na stimulatie, en een groot aantal latex bolletjes had zich opgehoopt in het cytoplasma van veel granulocyten bij 12 uur na stimulatie (Fig. 3B-4 en B-5; bolletjes aangegeven met rode pijlen, en netten aangegeven met witte pijlen). Bovendien werden de netten groter en breder in de tijd (Fig. 3B-4 en B-5). 48 uur na stimulatie hadden zich veel latex korrels opgehoopt in het cytoplasma van de granulocyten, maar de netten waren niet langer zichtbaar en veel granulocyten leken inert (Fig. 3B-6; korrels aangegeven met rode pijlen).

Zoals te zien in Fig. 2, bleken de granulocyten zich niet alleen aan andere granulocyten te hechten, maar ook aan verschillende typen hemocyten met behulp van deze netten. Bij geen enkel ander celtype werd fagocytose waargenomen, behalve bij een klein aantal plasmatocyten (gegevens niet weergegeven). Bovendien hebben wij geen immunologische activiteit of morfologische veranderingen waargenomen in enig ander celtype dan granulocyten en een klein aantal plasmatocyten.

Granulocytaire lysosomen werden geactiveerd door injectie van E. coli deeltjes

Om te onderzoeken of de vacuolen die binnen de granulocyten werden waargenomen pathogeen-gerelateerde fagosomen waren, werden krekels geïnjecteerd met E. coli deeltjes, die voornamelijk worden gebruikt als markers van fagocytose en groen fluoresceren wanneer ze aangezuurde organellen zoals intracellulaire lysosomen bereiken. Tegelijkertijd werden totale hemocyten gekleurd met LysoTracker Red, dat lysosomen labelt. Zoals getoond in Fig. 4A-1, werd een groen fluorescerend signaal (gefagocyteerde E. coli deeltjes) waargenomen in het cytoplasma van de granulocyten onmiddellijk na injectie van de deeltjes. Op hetzelfde moment, een rood fluorescerend signaal, dat geactiveerde lysosoomvorming aangeeft, werd ook waargenomen (Fig. 4A-2). Bij 4 h post-injectie, zeer polymorfe vacuolen kon worden gezien in veel granulocyten (Fig. 4A-4 en A-5). Samengevoegde beelden van het groene fluorescente signaal (gefagocyteerde E. coli deeltjes) en het rode fluorescente signaal (geactiveerde lysosomen) worden getoond (Fig. 4A-6). Op 12 h na de injectie, de groene fluorescerende signaal begon te dimmen, terwijl de rode fluorescerende signaal bleef (Fig. 4A-7 ~ A-9). Op 24 uur na de injectie, hadden beide fluorescerende signalen gedimd (Fig. 4A-10~A-12). Het rode fluorescente signaal in granulocyten werd echter opnieuw waargenomen bij 48 h post-injectie (Fig. 4A-13~A-15). Figuur 4Aa ~ Ao toont de insets in de panelen A-1 ~ A-15 (aangegeven door witte vakken) bij een hogere vergroting. Krekels die werden geïnjecteerd met PBS buffer alleen waren negatief voor rode en groene fluorescentie op alle tijdstippen na de injectie (Fig. 4B).

LysoTracker Red etikettering van granulocyte lysosomen in krekels geïnjecteerd met groen fluorescerende E. coli deeltjes. (A) Ontwikkeling van granulocyt lysosomen bij 0 h, 4 h, 12 h, 24 h, en 48 h post-injectie van E. coli deeltjes. (A-1, A-4, A-7, A-10, en A-13) De E. coli deeltjes, die worden gebruikt als markers van fagocytose, fluoresceren groen wanneer ze aangezuurde organellen zoals intracellulaire lysosomen te bereiken. (A-2, A-5, A-8, A-11, en A-14) Confocale fluorescentiemicroscoopbeelden van granulocyten, gekleurd met LysoTracker Red (een lysosomale merker). (A-1 en A-2) De groene en rode fluorescente signalen konden worden waargenomen in het cytoplasma van granulocyten vanaf 1 uur na de injectie. (A-4 en A-5) Veel granulocyten vertoonden groene en rode fluorescentie in de sterk polymorfe vacuolen van granulocyten bij 4 uur na de injectie. (A-7 en -8) Na 12 uur na de injectie was het groene fluorescentiesignaal gedimd, maar het rode fluorescentiesignaal bleef. (A-10 en A-11) 24 uur na de injectie waren de groene en rode fluorescerende signalen beide bijna verdwenen. (A-13 en A-14) 48 uur na de injectie was het groene fluorescerende signaal volledig verdwenen, maar het rode fluorescerende signaal werd opnieuw waargenomen. Samengevoegde beelden van de groene en rode fluorescente signalen worden getoond (A-3, A-6, A-9, A-12, en A-15). (a ~ o) De inzetstukken in de panelen A-1 ~ A-15 (aangegeven door witte vakken) bij hogere vergroting. (B) De rode fluorescentiesignaal in granulocyten van krekels die werden geïnjecteerd met PBS (negatieve controle). (C) Flowcytometrische analyse op 1 h ~ 48 h post-injectie. (C-1 en C-2) Het groene fluorescerende signaal was 2,08% bij 1 uur na injectie en steeg tot 24,6% bij 4 uur na injectie. (C-3~C-5) Het groene fluorescente signaal daalde geleidelijk, tot 10,87% bij 12 h, 3,98% bij 24 h, en 1,74% bij 48 h. (C-1-1~C-4-1) Het rode fluorescente signaal steeg tot 69,54% bij 12 h post-injectie en daalde tot 5,78% bij 24 h post-infectie. (C-5-1) Het rode fluorescerende signaal nam opnieuw toe, tot 30,25%, bij 48 uur na de injectie. (C-1-2~C-5-2) Het rood-fluorescente signaal in granulocyten van krekels die alleen met PBS-buffer werden geïnjecteerd. (D) De flowcytometrie-analyses werden driemaal herhaald.

Om de groene en rode fluorescente signalen in PBS- of E. coli-geïnjecteerde krekels te kwantificeren, werden hemocyten geanalyseerd door flowcytometrie op 0~48 h post-injectie (Fig. 4C). Bij 0 uur na de injectie, waren 2,08% van de hemocyten positief voor groene fluorescentie, en dit steeg tot 24,36% bij 4 uur na de injectie (Fig. 4C-1 en C-2). Het groene fluorescentiesignaal nam geleidelijk af tot 10,87% van de hemocyten na 12 uur, 3,98% na 24 uur, en 1,74% na 48 uur (Fig. 4C-3~C-5). Deze resultaten geven aan dat E. coli deeltjes actief werden opgeslokt en verteerd door granulocyten en volledig werden gewist tegen 48 uur na de injectie. Op 12 h post-injectie, 69,54% waren positief voor rode fluorescentie, en het signaal daalde tot 5,78% van de hemocyten op 24 h post-injectie (Fig. 4C-1-1~C-4-1). In overeenstemming met onze microscopische waarnemingen nam het rood fluorescerende signaal toe tot 30,25% van de hemocyten op 48 uur na de injectie. Krekels die werden geïnjecteerd met PBS waren daarentegen negatief voor groene en rode fluorescentie op alle tijdstippen (Fig. 4C-1-2~C-5-2). De flowcytometrie-analyse werd driemaal herhaald (Fig. 4D).

Reactivering van granulocyte lysosomen bij 48 h post-infectie

De reactivering van granulocyte lysosomen bij 48 h post-infectie werd verder onderzocht door microscopische observatie (Fig. 5A en B). Zoals getoond in Fig. 4A, werden het groene fluorescente signaal (gefagocyteerde E. coli deeltjes) en het rode fluorescente signaal (geactiveerde lysosomen) gezien bij 4 h na de injectie (Fig. 5A-1~A-3). De fluorescente signalen was gedimd door 24 uur na infectie (Fig. 5A-4 ~ A-6). Op 24 h post-infectie, zagen we dat cellen kunnen worden gezien binnen het cytoplasma van de granulocyten (Fig. 5A-4~A-6; aangegeven door witte pijlen). Dit fenomeen was duidelijker bij 48 h post-infectie (Fig. 5A-7~A-9; aangegeven door witte pijlen). Bovendien werden de lysosomen rond deze geëngineerde cellen op 48 h post-infectie geactiveerd (Fig. 5A-8). Zoals getoond in Fig. 4A-14, 4C-5-1, lijken deze microscopische waarnemingen de toename van het rode fluorescente signaal bij 48 h post-infectie te verklaren. Om dit te bevestigen werden de kernen van de granulocyten gekleurd met 4′,6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) bij 48 uur post-infectie. Zoals in fig. 5B-1 te zien is, werden granulocyten met twee kernen vaak waargenomen. Af en toe werden ook granulocyten met meer dan twee kernen, of misvormde kernen, waargenomen (fig. 5B-2 en B-3; aangegeven met witte pijlen).

Reactivering van granulocytaire lysosomen bij 48 uur na de injectie. (A) Fluorescentiemicroscoopbeelden van granulocyten na 4 uur, 24 uur en 48 uur na de injectie. (A-1 en A-2) Granulocyten toonden groene en rode fluorescerende signalen in de zeer polymorfe vacuoles op 4 h post-injectie. (A-4 en A-5) Na 12 uur na de injectie was het groene fluorescente signaal gedimd, maar het rode fluorescente signaal bleef. Bovendien werden enkele cellen waargenomen binnen het cytoplasma van de granulocyten (witte pijlen). (A-7 en A-8) Dit verschijnsel werd vaker waargenomen bij 48 uur na de injectie. Bovendien werden de lysosomen rond deze opgeslokte cellen geactiveerd (A-8). Samengevoegde beelden van de groene en rode fluorescente signalen worden getoond (A-3, A-6, en A-9). (B) Granulocyten gekleurd met DAPI op 48 h post-injectie. (B-1) Twee kernen werden waargenomen in het cytoplasma van de granulocyten. (B-2 en B-3) Af en toe werden twee of meer kernen, of vervormde kernen, waargenomen in het cytoplasma van de granulocyt (aangegeven met witte pijlen). Schaalbalk = 10 µm (A) of 20 µm (B).

Necrosis-gerelateerde granulocyte celdood op 48 h post-infectie

Zoals aangetoond in Figs. 3B-6 en 5A-8, de ophoping van fagosomen in granulocyten veranderde hun vorm en geïnduceerde celdood. 48 uur na infectie werden de hemocyten gekleurd met fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC)-geconjugeerd annexine V en propidiumjodide (PI) om apoptotische of necrotische celdood te bevestigen (Fig. 6A). Het groene fluorescente signaal (annexine V) nam slechts licht toe tussen 12 en 48 uur (Fig. A-10, A-7, en A-10), maar het rode fluorescente signaal (PI) vertoonde een sterke kleuring bij 12 uur na infectie (Fig. 6A-5). Bij 24 en 48 uur na infectie bleef het rode fluorescerende signaal aanhouden (Fig. 6A-8 en A-11). Samengevoegde beelden van het rode fluorescentiesignaal (PI) en de DIC beelden worden getoond (Fig. 6A-3, A-6, A-9, en A-12). Figuur 6Aa ~ Ad toont de inzetstukken in de panelen A-3, A-6, A-9, en A-12 aangegeven door de dozen bij een hogere vergroting. Deze resultaten geven aan dat de ophoping van fagosomen in granulocyten niet typisch apoptotische celdood, maar necrose-gerelateerde celdood te induceren. Om de PI-kleuring te kwantificeren, werden hemocyten gekleurd en onderzocht door flowcytometrie bij 0 uur, 12 uur, 24 uur, en 48 uur na infectie. Bij 12 uur post-infectie waren 71,29% van de granulocyten gekleurd met PI, vergeleken met 13,52% bij 0 uur (Fig. 6B-1 en B-2). 24 uur na de infectie was de PI-kleuring licht gedaald tot 45,97%, maar na 48 uur was deze weer toegenomen tot 76,24% (fig. 6B-3 en B-4). De flowcytometrie-analyse werd driemaal herhaald (Fig. 6C).