BASIC RESEARCH

Groeihormoonrespons op groeihormoon-afgevend peptide-2 bij groeihormoon-deficiënte Little muizen

Cibele N. PeroniI; Cesar Y. HayashidaII; Nancy NascimentoI; Viviane C. LonguiniII; Rodrigo A. ToledoII; Paolo BartoliniI; Cyril Y. BowersIII; Sergio P.A. ToledoII

Biotechnologie Departement, Nationale Commissie voor Kernenergie (IPEN-CNEN), Cidade Universitária, São Paulo/SP, Brazilië
IIFaculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, Departement Geneeskunde, Endocrinologie, Endocrine Genetics Unit/LIM 25, São Paulo/SP, Brazil
IIITulane University Health Sciences Center, Department of Medicine, Division of Endocrinology, Endocrine Section, New Orleans, LA/USA

ABSTRACT

DOELSTELLING: Onderzoeken van een mogelijke directe, groeihormoonafhankelijke hormoonafhankelijke werking van een groeihormoonsecretagoog, GHRP-2, in hypofysaire somatotrofe cellen in aanwezigheid van inactieve groeihormoonafhankelijke hormoonreceptoren.
MATERIALEN EN METHODEN: De reacties van serum groeihormoon op acuut ingespoten groeihormoon-afgevend P-2 in lit / lit-muizen, die een model van GH-deficiëntie als gevolg van gemuteerde groeihormoon-afgevend hormoon-receptoren vertegenwoordigen, werden vergeleken met die waargenomen in de heterozygoot (lit / +) nestgenoten en wild-type (+ / +) C57BL / 6J muizen.
RESULTATEN: Na toediening van 10 mcg groeihormoon-afgevende P-2 aan muizen met lit/lit, werd een groeihormoon-afgifte van 9,3±1,5 ng/ml waargenomen, vergeleken met 1,04±1,15 ng/ml bij controles (p<0,001). Ter vergelijking, een intermediaire groeihormoonafgifte van 34,5±9,7 ng/ml en een hogere groeihormoonafgifte van 163±46 ng/ml werden geïnduceerd in de lit/+ muizen en wild-type muizen, respectievelijk. Aldus stimuleerde GHRP-2 groeihormoon in de lit/+ muizen, en is de afgifte van groeihormoon in vivo wellicht slechts gedeeltelijk afhankelijk van groeihormoon-afgevend hormoon. Bovendien werden de plasma leptine en ghreline niveaus geëvalueerd in de lit/lit muizen onder basale en gestimuleerde condities.
CONCLUSIES: Hier hebben wij aangetoond dat lit/lit muizen, die een kiembaan mutatie in het groeihormoon-afgevend hormoon gen dragen, een beperkte maar statistisch significante groeihormoon verhoging behouden na exogene stimulatie met GHRP-2. De huidige gegevens weerspiegelen waarschijnlijk een direct, groeihormoon-onafhankelijk effect op Groeihormoon S (ghreline) stimulatie in de resterende hypofyse somatotrofen van kleine muizen dat wordt gemedieerd door groeihormoon S-R 1a.

Trefwoorden: Ghreline; GH; GHRH-R; GHRP-2; Leptine; Kleine muis.

INLEIDING

De synthese en secretie van groeihormoon (GH) worden primair gereguleerd door de hypothalamische hormonen GH-releasing hormoon (GHRH) en somatostatine door de negatieve terugkoppeling van GH en IGF-I en door het natuurlijke endogene GH-releasing hormoon ghreline (1-8). Normale somatotrofe maturatie, proliferatie, en somatische groei en ontwikkeling vereisen GHRH (9). In de late differentiatiefase van somatotrofe cellen activeert GHRH Gs alfa, cAMP en de proteïne kinase A route via zijn celmembraanreceptor GHRH-R (1,10,11). Omgekeerd werkt ghreline, dat oorspronkelijk werd geïsoleerd uit de maag en de hypothalamus van de rat, via de GHS-receptor (GHS-R 1a), die gekoppeld is aan leden van de Gq/i-familie en fosfolipase C activeert (2,12,13).

Synthetische GHS’s zijn ghrelinereceptor-agonisten die de GH-secretie in vitro en in vivo stimuleren. Zij omvatten GH-releasing peptiden (GHRP’s), zoals GHRP-2, en niet-peptide verbindingen. Synthetische GHS’s en ghreline stimuleren ook de afgifte van ACTH/cortisol en prolactine via hypothalamische effecten en er is aangetoond dat zij de voedselinname, het energieverbruik, de slaap en de harttonus verhogen (15-17). Hoewel hun chemische structuur varieert, lijken alle GHS’s via de GHS-R te werken om de GH-secretie en de voedselopname te bevorderen. GHS-R mRNA is geïdentificeerd in de hypofyse, de arcuate kern van de hypothalamus, en in andere weefsels (6,15-17). Voor maximale GH-stimulatie vereisen GHRP’s een gelijktijdige secretie van hypothalamisch GHRH (18-21). Bovendien versterken ghreline en synthetische GHS’s de door GHRH geïnduceerde cAMP-productie en verhogen zij de niveaus van verschillende GHRH-R’s, wat ook kan resulteren in veranderde interacties tussen GHS-R en GHRH (22-25). In dit verband kan een dubbele en complementaire werking van ghreline en GHRP op de hypothalamus en de hypofyse optreden. Voorts moet worden gewezen op een paracrien effect op de arcuate kern van de hypothalamus, die betrokken is bij de regeling van de voedselinname en de energie-uitgaven (17).

Het voornaamste werkingspunt van GHS’s voor de GH-secretie is niet volledig vastgesteld. GHS-R’s zijn zowel in de hypofyse als in de hypothalamus geïdentificeerd, en GHS’s kunnen op één van beide of op beide plaatsen werkzaam zijn. Er zijn aanwijzingen dat de GH-secretieve werking van GHS’s en ghreline hoofdzakelijk in de hypothalamus plaatsvindt, met een marginaal direct effect op de hypofyse (25-27). Dienovereenkomstig werd voor het eerst een beperkte maar statistisch significante GH-verhoging (p<0,05) gedocumenteerd na een acute stimulus met GHRP2 bij GH-deficiënte patiënten met een korte gestalte als gevolg van een kiembaanmutatie in het GHRH-R-gen (28). Kort daarna ondersteunden andere studies deze eerste bevindingen (29,30), wat wijst op een directe werking van GHRP-2 in de hypofyse. Het klonen van het muizen- en humane groeihormoon-releasing hormoon receptor gen (ghrhr) werd bereikt na de ontdekking dat verschillende mutaties analoog aan de ghrhr Asp60Gly inactiverende mutatie van GH-deficiënte kleine muizen ook voorkwamen bij GH-deficiënte mensen (31-37). De ghrhr-mutatie bij lit/lit-muizen leidde tot een volledig ontbreken van door GHRH gemedieerde GH-afgifte, hetgeen verder werd gestaafd door de bevinding dat het gemuteerde GHRH-R-eiwit niet aan GHRH bindt (32,33). Zoals verwacht is het volledig ontbreken van een GH-respons op GHRH1-29NH2 gerapporteerd bij kleine muizen (38-40). Het volledig ontbreken van een GH-respons op GHRP-6 is ook gemeld bij kleine muizen (41). Aangezien GHSs echter specifiek via de GHS-R werken, is het redelijk aan te nemen dat een GH-respons kan optreden als reactie op een GHS-uitdaging bij kleine muizen. Ter ondersteuning van deze hypothese is aangetoond dat GHRP-2 de GH-afgifte uit hypofyses van ratten in vitro verhoogt, zelfs nadat de GHRH-R was geblokkeerd met de antisense oligonucleotide-methode (42).

De kleine muis is een gevestigd diermodel voor de beoordeling van de directe GHRH-onafhankelijke effecten van GHSs en ghreline op hypofysaire somatotrofe cellen (33-35). Hier evalueerden we de GH respons op GHRP-2 in kleine muizen (lit/lit), hun heterozygote (lit/+) nestgenoten, en wild-type (+/+) controles. Daarnaast werd een mogelijke rol van GHRH en GHRH-R op de secretie en werking van ghreline geëvalueerd door het nuchtere en gevoede plasma ghreline en serum leptine niveaus te meten in deze dieren.

MATERIALEN EN METHODEN

Dieren en huisvestingsomstandigheden

Kleine muizen (C57BL/6J lit/lit) en hun heterozygote (lit/ +) nestgenoten werden gekocht van The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA), en een fokkolonie werd opgericht in ons dierenverblijf (43). Mutant muizen werden geproduceerd door het paren van C57BL / 6J lit / Lit vrouwtjes aan C57BL / 6J lit / + mannetjes. Muizen van beide geslachten op de leeftijd van 45-90 dagen werden gebruikt in de tests. Als controles werden wild-type (+/+) C57BL-muizen gebruikt, die werden verkregen van de afdeling Tropische Geneeskunde, Universiteit van São Paulo School of Medicine (São Paulo, Brazilië), op een leeftijd van 45-90 dagen (lichaamsgewicht van 30 g). Het lichaamsgewicht van de muizen lit/lit en lit/+ bedroeg ongeveer 10-12 g respectievelijk 20-25 g op dezelfde leeftijd en werd verkregen met een gevoelige methode (43).

De muizen werden gehouden in een kamer met airconditioning bij een temperatuur van 24±1ºC. Water en voedsel werden ad libitum verstrekt, en het licht werd geregeld op een 12-h licht/12-h donker schema.

Een groep muizen werd vastend gehouden door het voedsel ’s middags om ongeveer 17:00 uur te verwijderen. De volgende dag werd om 09:00 uur bloed afgenomen van de nuchtere en de niet-vaste muizengroep.

Dit onderzoek werd goedgekeurd door de plaatselijke ethische commissie en voldeed aan de criteria voor dierproeven.

Sequencing analyse

Genotypering werd uitgevoerd ter bevestiging en genetische karakterisering van de lit/lit, lit/+, en wt/wt muizen. De muizen werden gegenotypeerd door de PCR amplificatie van staart-DNA geïsoleerd met behulp van het standaard fenolprotocol van ons laboratorium (44,45). Twee primers, 5′-TGAGCTTGCATGTCTTCA GG-3′ en 5′-GGGATTAGACCAGCCAGTGA-3′ (anneal ing temperatuur, 60ºC), werden gebruikt om het gengebied van de ghrhr Asp60Gly-mutatie te amplificeren die resulteert in het fenotype van de kleine muis (24). De mutatie-analyse werd uitgevoerd door geautomatiseerde sequencing met de Big Dye Terminator v3.1 (310 Sequencer, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).

De voorwaartse en achterwaartse strengen werden geanalyseerd in duplo DNA-monsters. Twee sequencing editor softwareprogramma’s (Gene StudioTM Professional Edition, Suwanee; en Mutation Surveyour, Softgenetics, PA, USA) werden gebruikt om DNA-afwijkingen te identificeren.

Preparaten en injecties

GHRP-2 (200 µg/ml; lot KP102-HQ007; Pramorelin: D-alanyl-3-(2-naftyl)-D-alanyl-L-tryptofyl-D-fenylalanyl-L-lysinamide dihydrochloride) werd verkregen van Fujisawa USA, Inc. (Deerfield, IL). De muizen kregen intra-peritoneale (i.p.) injecties en werden gewogen. Dep eindigend op de experimentele opzet, werden bloedmonsters verzameld uit de sinus orbitalis voor de metingen van GH, IGF-I, leptine, of ghreline.

Immunoassays

De serumspiegels van GH (mGH) bij muizen werden bepaald door een zeer gevoelige in-house specifieke RIA met behulp van reagentia verkregen van Dr. A. F. Parlow van het National Hormone and Pituitary Program (NHPP, Torrance, CA) (46). Alle monsters werden in duplo onderzocht. In elke test werden pools van wt/wt C57BL en lit/lit muizensera gebruikt als interne controles. Er werden acht muizen van elke stam gebruikt en het gepoolde (n = 8) serumgehalte van GH was 1,3±0,7 ng/ml bij de lit/lit muizen en 6,5±1,8 ng/ml bij de wt/wt C57BL muizen. De oorspronkelijke GH-spiegels in de lit/+ muizen verschilden niet significant van die in de wt/wt C57BL muizen, waarschijnlijk vanwege het aantal dieren. De gevoeligheid van de GH-test, die via een vertraagde toevoeging van een verklikstof werd uitgevoerd, was 0,25±0,15 ng/ml, berekend volgens de definitie van Rodbard (47). De inter-test variatiecoëfficiënt was minder dan 10%.

Hoeveelheden IGF-I werden in duplo bepaald met behulp van een ratten IGF-I RIA-kit (DSL-2900, Diagnostic Systems Laboratories Inc., Webster, Texas, VS) met een minimum detectieniveau van 21 ng/ml en meetbare concentraties variërend van 150 tot 4.500 ng/ml.

Leptine niveaus werden bepaald met behulp van een RIA-kit voor leptine bij ratten (Linco Research Inc., St. Charles, MO, VS) met een minimale detectiewaarde van 0,2 ng/ml en een meetbaar concentratieniveau van 0,2-12,8 ng/ml.

Totale ghreline (geoctanoyleerd + gedesoctanoyleerd)(48) niveaus werden bepaald met behulp van een rat ghreline RIA kit (Phoenix Pharmaceuticals Inc., Belmont, CA, USA) met een gevoeligheid van ~ 5,4 pg/tube en een bereik van 1-128 pg/tube. Actieve ghreline (octanoylated) niveaus werden bepaald met behulp van de Linco Research kit (St. Charles, MO). Voor deze metingen werden bloedmonsters verzameld in buisjes met 0,78 mg K2EDTA (250-500 ml bloed/buisje), op ijs bewaard en in een gekoelde centrifuge gedraaid. PMSF (0,1 mg/ml plasma) en 1 M HCl (50 ml/ml plasma) werden aan de plasmamonsters toegevoegd. De monsters werden bevroren bewaard bij -70ºC totdat de ghrelinegehalten werden gemeten. Voor de actieve ghrelinekit bedroegen de intra- en inter-assay variatiecoëfficiënten respectievelijk 6,5-9,5% en 9,6-16,2%. Voor de totale ghrelinekit bedroegen de intra- en inter-assay variatiecoëfficiënten respectievelijk <10% en <15%.

Opzet van de studie

Twee groepen van leeftijd-gematchte, wild-type (+/+) C57BL muizen werden aanvankelijk i.p. geïnjecteerd met ofwel 1 µg (32 dieren / groep) of 10 µg (18 dieren / groep) GHRP-2, en bloedmonsters voor de GH metingen werden verzameld op verschillende tijdstippen tot 1 uur na de injectie. Drie muizen werden gebruikt voor elk tijdstip, en het bloed werd slechts eenmaal afgenomen voordat de dieren werden opgeofferd. In een pilotstudie werd 10 µg GHRP-2 i.p. toegediend aan 2-3 muizen lit/lit, lit/+ en (wt/wt) (n = 18 dieren/groep), en de GH-respons werd gemeten op verschillende tijdstippen tot 1 uur na de injectie om de effecten van dosis en timing te beoordelen.

Een onafhankelijke studie van twee weken werd uitgevoerd met lit/lit muizen die dagelijks werden behandeld met 10 µg GHRP-2 i.p. per muis (n = 6 muizen voor de controlegroep en n = 8 muizen voor de experimentele groep). Het lichaamsgewicht werd gemeten, en bloed werd afgenomen om de 3-4 dagen om de GH, IGF-I en leptine niveaus te meten. Zoals eerder beschreven, werd het lichaamsgewicht gemeten met behulp van een nauwkeurige, zeer gevoelige methode (40). Kort gezegd werden de lichaamsgewichten van de dieren gedurende het hele experiment dagelijks gemeten en vervolgens gebruikt om individuele groeicurven te berekenen; de hellingen van de groeicurven werden vervolgens gebruikt als responsparameters. Voor de verlichte/verlichte muizen bedroeg de aanvaardbare dagelijkse gewichtsvariatie in de laatste tien dagen vóór elke test (pre-assay periode) binnen 0,0025±0,0045 g/dag (36,40). Derhalve werd ongeveer 10% van de homozygote dwergmuispopulatie afgekeurd. Onze criteria voor het selecteren van de lit/lit muizen waren gebaseerd op de groeicurven van de homozygote (lit/lit) en heterozygote (lit/+) muizen van de C57BL/6J stam, die al in een eerdere studie waren vastgesteld (36) en verder werden bevestigd door de hier uitgevoerde genotypering.

Om de gebieden onder de curve van de hormonale waarden te evalueren en te vergelijken, werd een arbitraire eenheid van concentratie (ng/ml/tijd (min)) gedefinieerd.

Statistieken

Om de leptine niveaus en hormonale reacties zoals gemeten door het gebied onder de curve (AUC) gegevens te analyseren, werd een twee-weg analyse van variantie (ANOVA) uitgevoerd met tijd en behandeling als de onafhankelijke variabelen. Student’s t-test met Bonferroni’s correctie werd gebruikt voor alle waarden verkregen na de start van de behandeling. Bij alle andere metingen werd Student’s gepaarde t-test gebruikt om de significantie van de verschillen te evalueren. p,0,05 werd als significant beschouwd.

RESULTATEN

ghrhr mutatie-analyse

DNA werd geëxtraheerd uit een bloedmonster van een lit/lit muis met behulp van routinemethoden elders beschreven (44,45). PCR met eerder gerapporteerde primers werd uitgevoerd, gevolgd door de sequentieanalyse van het ghrhr-gen.

Een germline homozygote ghr Asp60Gly mutatie werd bevestigd in de lit/lit muis, terwijl een heterozygote ghr Asp60Gly mutatie werd geverifieerd in de lit/+ nestgenoten. Omgekeerd hadden wild-type (+/+) C57BL/6J muizen deze kiembaanmutatie niet (figuur 1). Deze gegevens bevestigden de genotypes van de drie muizen lineages gebruikt in de huidige studie, respectievelijk: +/+, Asp60Asp; lit/+, Asp60Gly en lit/lit, Gly60Gly (figuur 1).

Basale GH- en IGF-I-spiegels bij normale en homozygote muizen

De gemiddelde basale mGH-spiegels bij de 18 homozygote lit/lit muizen (1,16±0,97 ng/ml; bereik, 0,28-4.0 ng/ml) waren significant lager dan die waargenomen bij de 46 wild-type (+/+) controles (5,36±2,60 ng/ml; bereik, 1,05-14,0 ng/ml; p<0,001) of hun 12 heterozygote (lit/+) nestgenoten (6,60±2,35 ng/ml; bereik, 4,25-11,5 ng/ml; p<0,001). Bovendien verschilden de basale GH-concentraties die bij de muizen met lit/+ en +/+ werden waargenomen, niet significant.

De basale serum IGF-I waarde bij de 8 lit/+ muizen (231±103 ng/ml; range, 120-420) was duidelijk lager dan die bij de 8 +/+ controles (473±104 ng/ml; range, 330560 ng/ml; p<0.001).

Respons van GH op acute GHRP-2 toediening

Er werd aanvankelijk aangetoond dat de toename van GH in de C57BL wild-type controlemuizen als reactie op 1 µg GHRP-2 significant minder was (~tweevoudige toename boven basale niveaus) dan de toename in reactie op 10 mg i.p. GHRp-2 (24-voudige toename boven basale waarden; p<0.05). Derhalve werd de 10-µg GHRP-2 dosis geselecteerd voor de beoordeling van de GH responsen in de drie groepen muizen (+/+, lit/+ en lit/lit).

De gemiddelde piek GH respons in de controlegroep (+/+) was 163 ng/ml, en het trad op 10 min na de toediening van GHRP-2 met een 24-voudige stijging ten opzichte van de basislijn niveaus (figuur 2). Bij de muizen lit/+ en lit/lit was er een significante GH-respons op GHRP-2 bij 5-10 min. Twintig minuten na de injectie met GHRP-2 keerde het GH-niveau terug naar de uitgangswaarden.

Deze gegevens geven aan dat de GH-respons op 10 µg GHRP-2 (9,3±1,5 ng/ml; range 8-11 ng/ml) die werd waargenomen bij de homozygote lit/lit muizen significant hoger was dan die bij de met zout geïnjecteerde lit/lit muizen (1,04±1,15 ng/ml; p<0,001). Bovendien was de reactie van GH op GHRP-2 in de lit/lit muizen significant lager dan die waargenomen in de heterozygote (lit/+) nestgenoten (9,3±1,5 ng/ml vs. 34,5±9,7 ng/ml; p<0,01) of in de wildtype ( +/+) muizen (163±46 ng/ml; p<0,005). De GH-respons op GHRP-2 bij de lit/+ muizen was dus intermediair ten opzichte van die bij de lit/lit en +/+ muizen (figuur 2).

De absolute GH toename ten opzichte van de uitgangswaarde in de lit/lit, lit/+, en +/+ muizen waren respectievelijk 8,3, 28,8, en 156 ng/ml, hetgeen de duidelijke verschillen in GH secretie tussen de drie bestudeerde muizen stammen bevestigt. De toename van het GH niveau ten opzichte van de uitgangswaarde na acute toediening van 10 µg GHRP-2 verschilde niet significant tussen de lit/lit en lit/+ muizen (8,9-voudig vs. 6,1-voudig; p>0,05). De toename van de GH als reactie op GHRP-2 was echter significant lager bij de muizen met lit/lit (p<0,005) en lit/+ (p<0,01) vergeleken met de controles. De individuele gebieden onder de curve (AUC’s) van het serum GH in reactie op de acute toediening van GHRP-2 bevestigden verder de significante verschillen tussen de GHRP-2- en zout-behandelde lit/lit muizen (figuur 3).

Respons op de twee weken durende toediening van GHRP-2

Zoals verwacht werd een duidelijke toename van het lichaamsgewicht waargenomen bij de lit/lit muizen wanneer 10 µg GHRP-2 eenmaal daags i.p. werd geïnjecteerd (49) gedurende twee weken in vergelijking met injectie van het controlemedium (p<0.02; figuur 4). De GH- en IGF-I-spiegels namen echter niet significant toe tijdens de twee weken durende toediening van GHRP-2 (gegevens niet aangetoond). Bovendien werden duidelijk verhoogde (p<0.005) leptine niveaus in de verlichte / verlichte muizen waargenomen op dag 15 van de GHRP-2 behandeling.

Serum ghreline en leptine niveaus

De concentraties van plasma acyl ghreline en totaal (acyl + deacyl) ghreline, die onafhankelijke en onderling gerelateerde biologische acties kunnen hebben, en de concentraties van serum leptine bij de +/+, lit/+, en lit/lit muizen in de nuchtere en gevoede toestand worden weergegeven in tabel 1. In de nuchtere toestand waren het gemiddelde plasma-cyl-ghrelinegehalte en het totale ghrelinegehalte bij de lit/lit-muizen aanzienlijk lager (respectievelijk 78,9% en 37,6%) dan bij de +/+-muizen. De heterozygote lit/+ muizen hadden ook significant lagere niveaus van nuchtere acyl ghreline en totale ghreline (met 80,5% en 44,9%, respectievelijk) vergeleken met de controlegroepen. Bij de muizen met lit/lit was het plasma-cyl-ghrelinegehalte in de nuchtere toestand 93,8% hoger dan in de nuchtere toestand. Daarentegen was bij de wild-type muizen het plasma acyl ghreline 82,5% lager (p<0,001), en het totaal ghreline 61% lager (p<0,001) in de voedingstoestand dan in de nuchtere toestand. Het verschil in de plasma acyl ghreline niveaus in de voedingstoestand tussen de twee groepen (157±70 pg/ml voor +/+ muizen vs. 67±18 pg/ml voor lit/lit) was significant (p<0.05). Bovendien waren de totale ghrelinegehalten 23,4% hoger in de nuchtere toestand dan in de nuchtere toestand voor de muizen met lit/lit.

De serum leptine niveaus van de nuchtere lit/lit muizen waren 348% hoger dan die in de nuchtere +/+ muizen (p<0.005). De nuchtere lit/+ muizen verschilden ook van de lit/lit (50% lager, p<0.02) en +/+ muizen (123% hoger, p<0.005). Bovendien daalden bij de lit/lit muizen de serum leptinegehalten in de voedingstoestand met 35% ten opzichte van de nuchtere toestand (p>0,05). Bovendien waren de leptinespiegels in de gevoede lit/+ en +/+ muizen respectievelijk 37% en 16% hoger dan in de nuchtere dieren (p>0,05).

DISCUSSIE

Er zijn verschillende spontane homozygote kiembaanmutaties in muizen gedocumenteerd die resulteren in een tekort aan hypofysaire hormonen en dwerggroei (34). Zo zijn de fenotypes van de Ames dwergmuizen het gevolg van mutaties in het Prop1-gen en vertonen een congenitaal tekort van meerdere hypofysehormonen, waaronder GH (50). Bovendien hebben Snell dwergmuizen met mutaties in het Pit gen dwerggroei als gevolg van GH deficiëntie, hypothyreoïdie, en onvruchtbaarheid (51). Bovendien is het fenotype van de dwergmuis het gevolg van homozygote mutaties in het ghrh-r gen (33). Gelijkwaardige germline homozygote mutaties in de PROP1-, PIT- en GHRH-R-genen zijn gemeld bij mensen die een ernstig klein gestalte hebben (37,52,53).

GHRH-R-mutaties zijn specifiek genoemd als oorzaak van het ontbreken van een GH-respons op GHRP-2 bij mensen (54). In verschillende andere onderzoeken is echter een beperkte maar statistisch significante stijging van de GH gemeten na toediening van GHRP-2 aan deze patiënten (28-30). Evenzo is gesuggereerd dat de kleine muis resistent is tegen de werking van GHRP-2 en geen toename van GH vertoont na toediening van dit peptide (41). Het hoofddoel van de huidige studie was dan ook te onderzoeken of kleine muizen een absolute resistentie hebben tegen de werking van GHRPs, zoals eerder beschreven, of dat zij een statistisch significante GH respons vertonen op één van de GHRPs, namelijk GHRP-2, zoals waargenomen bij de mens. Om kleine GH-schommelingen in het serum op te sporen, hebben wij een verbeterde mGH-methode gebruikt om mogelijke GH-verhogingen na de toediening van GHRP-2 beter te kunnen onderscheiden.

Voor zover wij weten, heeft tot op heden geen enkel ander artikel deze kwestie specifiek opnieuw onderzocht bij kleine muizen. Van belang is dat volledige GH-resistentie tegen GHRP-2 in ghrh-knockout muizen is gedocumenteerd. Echter, de ghrh-knockout muizen en kleine muizen hebben mutaties in verschillende genen, hoewel hun fenotypes vergelijkbaar zijn. Bovendien kunnen verschillende GH-methoden en experimentele omstandigheden van invloed zijn geweest op deze ogenschijnlijk tegenstrijdige resultaten.

GH reacties op GHRP-2

De ontwikkeling en functie van somatotrofe cellen zijn GHRH-afhankelijk (1), zoals aangegeven door onze bevindingen van een beperkte GH respons op acute GHRP-2 toediening in lit / Lite muizen die een homozygote mutatie in ghrhr dragen. Ervan uitgaande dat ghrhr volledig inactief is in muizen met lit/lit (39), wijzen onze huidige bevindingen erop dat ten minste een deel van de GHRH-onafhankelijke GHS-GH-afgifte plaatsvindt door de activering van de GHS-R.

Naast rijpe GHRH-afhankelijke somatotrofen zijn er GH-producerende stamcellen aangetroffen in de hypofyse van muizen met lit/lit en in 60 dagen oude volwassen muizen (26).

Het is echter niet bekend of GHRP-2 en/of ghreline fungeren als een trofische factor voor de GH-producerende stamcellen onafhankelijk van de hypofysewerking van GHRH.

Het eerder gemelde ontbreken van een GH-respons in muizen met lit/lit op een ander type GHS, GHRP-6 (41), kan te maken hebben met het gebruik van een minder gevoelige GH-assay (10 ng/ml versus 0,25 ng/ml voor onze assay). Bovendien heeft GHRP-2 een grotere biologische potentie (ongeveer zes keer zo groot) dan GHRP-6 voor het op gang brengen van de vrijgave van GH (14-16). De afwezigheid van GH-respons op GHRP-6 werd aanvankelijk ook gesuggereerd bij mensen met een Glu72Stop GHRH-R mutatie (42). Diverse andere onderzoeken hebben echter de aanwezigheid van een statistisch significante, zij het verminderde, GH-respons op GHRP-2 aangetoond bij patiënten met een genetische korte gestalte die drager zijn van een ernstig afgekapt GHRHR-gen (28-30).

Daarnaast werden noch acute noch chronische GH-stijgingen waargenomen bij ghrh-knockout-muizen, en werd geconcludeerd dat GHRP-2 een groeistimulerend effect heeft dat de door JI-38 geïnduceerde respons versterkt (55,56). Het is echter belangrijk op te merken dat a) knock-out muizen en dieren met vergelijkbare of zelfs gelijkwaardige spontane kiembaanmutaties zich verschillend kunnen gedragen; b) de mGH-methoden die zijn gebruikt om de kleine muizen en de knock-out muizen te bestuderen verschillend kunnen zijn; en c) in deze studies verschillende experimentele ontwerpen zijn gebruikt (28-30,55,56).

De intermediaire GH responsen op GHRP-2 in de lit/+ muizen kunnen het gevolg zijn van kwalitatieve en/of kwantitatieve verschillen in de somatotrofe cellen, hoewel verder onderzoek over dit onderwerp moet worden uitgevoerd om deze bevindingen te bevestigen. Deze gegevens kunnen wijzen op een genetisch doseringseffect op de werking van de somatotrofe cellen, die met het stijgen van de leeftijd nog slechter zou worden. Op soortgelijke wijze werd eerder een genetisch doseringseffect voorgesteld voor gevallen met een mutatie in het GHRHR-gen (52).

Belangrijk is dat onze GH RIA-methode in staat was om de aanwezigheid van zeer lage GH-spiegels (~0,25 ng/ml) in kleine muizen met aanvaardbare precisie aan te tonen; soortgelijke gegevens zijn zelden in de literatuur beschikbaar. GH-kits met lagere gevoeligheden zijn door anderen gebruikt. Er zijn echter geen andere rapporten gevonden die betrekking hadden op de serum GH-spiegels van lit/lit muizen, verkregen met een specifieke homologe RIA. Cheng et al. meldden serum GH-spiegels van 0,61±0,09 ng/ml in mannelijke en vrouwelijke muizen met lit/lit en 8,50±0,75 ng/ml en 2,85±0,33 ng/ml in mannelijke en vrouwelijke muizen met lit/+, respectievelijk. Marmary et al. meldden serum GH-spiegels van 1,08±0,06 ng/ml en 20,35±22,9 ng/ml bij Snell dwergmuizen en hun controle nestgenoten, respectievelijk (58). Hoge schattingen van het absolute niveau van serum GH bepaald met behulp van een heterologe rat GH RIA zijn ook gemeld (59,60).

Groei na toediening van GHRP-2

In deze studie werd een duidelijke toename van het lichaamsgewicht van kleine muizen waargenomen na toediening van GHRP-2.

Deze bevindingen komen overeen met andere studies die een significante toename van het lichaamsgewicht documenteerden bij ghrh-knockout muizen behandeld met GHRP-2 en bij muizen na toediening van ghreline, wat aantoont dat beide peptiden adipositas induceren bij deze dieren (61). Opmerkelijk is dat Alba et al. geen toename van de longitudinale groei van ghrh-knockout muizen hebben waargenomen gedurende een zes weken durende behandeling met GH RP-2 in een dosis van 10 µg die tweemaal daags onderhuids (s.c.) werd geïnjecteerd, hetgeen de centrale rol van GHRH in de GH secretie en de daaropvolgende lichaamsgroei bevestigt (48). Bovendien heeft een chronische zes weken durende behandeling met 10 µg s.c. GHRP-2 de acute GH respons (30-min) niet verhoogd. Deze ap-ouder discrepantie met onze bevindingen kan het gevolg zijn van verschillen in het tijdstip van bloedafname of de gevoeligheid van de GH-test, verschillende methoden van toediening van het geneesmiddel (s.c. vs. i.p.), of een combinatie van deze factoren.

Leptine en ghreline niveaus in de verlichte/verlichte muizen

We evalueerden ook of GHRP-2 de leptine en ghreline niveaus zou beïnvloeden.

De nuchtere niveaus van acyl ghreline en totaal ghreline waren hoger bij de wild-type +/+ muizen dan bij de gevoede muizen (61-63). De fysiologische regulatie van het plasma ghreline (d.w.z. de toename en afname ervan in de nuchtere en de gevoede toestand, respectievelijk) was verschillend bij de verlichte/verlichte muizen. Deze bevinding kan het gevolg zijn van een gebrek aan effect van de werking van GHRH en zijn inactieve GHRH-R, hoewel deze hypothese verder moet worden getest.

Hoge basale serum leptine niveaus en een extra toename na langdurige GHRP-2 toediening bij lit/lit muizen zijn ook waargenomen bij muizen behandeld met ipamoreline (34). Deze bevindingen worden beschouwd als een weerspiegeling van de toegenomen vetweefselmassa in GH-deficiënte muizen en het adipogene effect van GHRP-2 en ghreline (61-63).

Om de lipogene effecten van deze peptiden bij muizen te onderzoeken, waren de doses van GHRP-2 die in de huidige studie werden gebruikt vergelijkbaar met die van Tschop et al. en met de GHRP-6 doses die werden gebruikt door Jansson et al. en Lall et al. (38,49,61). Op basis van het lichaamsgewicht waren deze doses echter verhoudingsgewijs veel hoger dan de doses die werden getest bij mensen met een GHRH-R-mutatie, wat zou kunnen duiden op verschillen tussen de soorten in de gevoeligheid voor GHSs (61).

Onze beperkte gegevens over de octanoyl ghreline (ghreline) en serum leptine niveaus in gevoede versus nuchtere (17 uur) wild-type (+/+) en lit/lit muizen (-/-) kunnen wijzen op disfunctionele relaties tussen deze twee metabole hormonen. Zoals verwacht waren de plasma ghreline-spiegels normaal bij de gevoede wild-type muizen en verhoogd bij de nuchtere wild-type muizen, hoewel ook het tegenovergestelde effect werd waargenomen, aangezien ghreline en leptine verhoogd waren in de nuchtere toestand en niet verder toenamen in de nuchtere toestand. Bovendien kwamen de resultaten bij de muizen met lit (+/-) gedeeltelijk overeen met die bij de muizen met lit (-/-), in die zin dat de plasma-ghrelinespiegels niet stegen bij het vasten, en dat tijdens het vasten de serumleptinespiegels verhoogd bleven bij de gevoede en nuchtere muizen met lit (+/en -/-). Het beperkte aantal onderzochte dieren verhinderde echter verdere conclusies te trekken. Tenslotte kan de meting van totaal ghreline als een indicator van octanoyl ghreline niveaus problematisch zijn. Hoewel de totale en octanoylated ghreline niveaus gedeeltelijk parallel kunnen lopen, wordt deze overeenkomst minder duidelijk onder pathofysiologische condities, zoals in de huidige muizenstudie. Toenemend bewijs ondersteunt de biologische activiteit van de desoctanoyl ghreline molecuul en dus op zijn beurt ondersteunt de meting van het plasma desoctanoylated ghreline niveaus door een specifieke assay, zoals die gepubliceerd door Akamizu et al. (64).

Concluderend zijn onze bevindingen de eerste die de aanwezigheid van statistisch significante toenames in GH na de toediening van GHRP-2 bij kleine muizen documenteren. De gegevens geven verdere steun aan een directe werking van GHRP-2 in de hypofyse van kleine muizen. Bovendien hebben de heterozygote lit/+ muizen mogelijk subtiele verstoringen in hun GHRH/GHRH-R/GH-as, wat een genetisch doseringseffect suggereert, hoewel aanvullende gegevens nodig zijn om deze conclusie te bevestigen.

ACKNOWLEDGMENTS

We erkennen Cristina T. Kanamura, B.S., en Venâncio A. F. Alves, M.D., van de afdeling Pathologie, Instituut Adolfo Lutz, São Paulo, voor technische ondersteuning. Onze dank gaat uit naar Dr. Heitor F. Andrade Jr., die de C57BL wt/wt dieren heeft geleverd. Dit onderzoek werd gedeeltelijk ondersteund door FAPESP (01/11091-0). S.P.A.T. en P.B. zijn onderzoekers van de Nationale Onderzoeksraad (CNPq). RAT ontvangt een FAPESP postdoctorale beurs (2009/15386-6). SPAT ontvangt een CNPq-beurs en -subsidie (401990/2010-9).

AUTOR BIJDRAGEN

Peroni CN, Nascimento N, en Bartolini P voerden de experimenten uit en werkten mee aan het opstellen van het manuscript. Hayashida CY heeft meegewerkt aan het schrijven van het manuscript. Toledo RA en Longuini VC hebben de genetische analyses uitgevoerd. Bowers CY werkte mee aan de producttesten (ghrp-2), de metingen van ghreline en leptine en de voorbereiding van het manuscript. Toledo SP schreef en coördineerde het onderzoeksproject en was als senior onderzoeker verantwoordelijk voor het opstellen van het manuscript.

1. Mayo KE, Miller TL, De Almeida V, Zheng J, Godfrey PA. The growth hormone-releasing hormone receptor: signal transduction, gene expression, and physiological function in growth regulation. Ann N Y Acad Sci. 1996;805:184-203, http://dx.doi.org/10.1111/j.1749-6632.1996.tb17483.x.

2. Kojima M, Hosada H, Date Y, Nakazato M, Matsui H, Kangawa K. Ghrelin is a growth-hormone-releasing acylated peptide from stomach. Nature. 1999;402:656-60, http://dx.doi.org/10.1038/45230.

3. Nass R, Gaylinn BD, Thorner MO. The role of ghrelin in GH secretion and GH disorders. Mol Cell Endocrinol. 2011;340:10-4, http://dx.doi.org/10.1016/j.mce.2011.03.021.

4. Gahete MD, Durán-Prado M, Luque RM, Martínez-Fuentes AJ, Quintero A, Gutiérrez-Pascual E, et al. Understanding the multifactorial control of growth hormone release by somatotropes: lessons from comparative endocrinology. Ann N Y Acad Sci. 2009;1163:137-53, http://dx.doi.org/10.1111/j.1749-6632.2008.03660.x.

5. Kamenicky P, Lombès M, Chanson P. New insights in growth hormone physiology and pathophysiology. Ann Endocrinol (Parijs). 2010;71(Suppl 1):S25-32, http://dx.doi.org/10.1016/S0003-4266(10)70004-4.

6. Cannata D, Vijayakumar A, Fierz Y, LeRoith D. The GH/IGF-1 axis in growth and development: new insights derived from animal models. Adv Pediatr. 2010;57:331-51, http://dx.doi.org/10.1016/j.yapd.2010.

7. Veldhuis JD, Bowers CY. Determinants of GH-releasing hormone and GH-releasing peptide synergy in men. Am J Physiol Endocrinol Metab. 2009;296:E1085-92, http://dx.doi.org/10.1152/ajpendo.91001.2008.

9. Frohman LA, Kineman RD, Kamegai J, Park S, Teixeira LT, Coschigano KT, et al. Secretagogues and the somatotrope: signaling and proliferation. Rec. Prog Horm Res. 2000;55:269-91.

10. De Almeida VI, Mayo KE. The growth hormone-releasing hormone receptor. Vitam Horm. 2001;63:233-76, http://dx.doi.org/10.1016/S0083-6729(01)63008-5.

11. Olsen LE, Rosenfeld MG. Perspective: genetic and genomic approaches in elucidating mechanisms of pituitary development. Endocrinologie. 2002;143:2007-11, http://dx.doi.org/10.1210/en.143.6.2007.

12. Howard AD, Feighner SD, Cully DF, Arena JP, Liberator PA, Rosenblum CI, et al. A receptor in pituitary and hypothalamus that functions in growth hormone release. Science. 1996;273:974-77, http://dx.doi.org/10.1126/science.273.5277.974.

13. Horvath TL, Diano S, Sotonyi P, Heiman M, Tschop M. Minireview: ghrelin and the regulation of energy balance-a hypothalamic perspective. Endocrinologie. 2001;142:4163-9, http://dx.doi.org/10.1210/en.142.10.4163.

14. Bowers CY. Growth hormone-releasing peptide (GHRP). Cell Mol Life Sci. 1998;54:1316-29, http://dx.doi.org/10.1007/s000180050257.

15. Bowers CY. GH releasing peptides (GHRPs). In: Kostyo J, Goodman H eds. Handboek voor fysiologie. New York: Oxford University Press. 1999;267-97.

16. Bowers CY. Unnatural growth hormone-releasing peptide begets natural ghrelin. J Clin Endocrinol Metab. 2001;86:1464-69, http://dx.doi.org/ 10.1210/jc.86.4.1464.

17. Laferrere B, Hart AB, Bowers CY. Obese personen reageren op het stimulerende effect van de ghreline-agonist groeihormoon-releasing peptide-2 op de voedselinname. Obesitas. 2006;14:1056-63, http://dx.doi.org/10.1038/oby.2006.121.

18. Dickson SL, Doutrelant-Viltart O, Leng G. GH-deficient dw/dw rats and lit/lit mice show increased Fos expression in the hypothalamic arcuate nucleus following systemic injection of GH-releasing peptide-6. J Endocrinol. 1995;146:519-26, http://dx.doi.org/10.1677/joe.0.1460519.

19. Yokote R, Sato M, Matsubara S, Ohye H, Niimi M, Murao K, et al. Molecular cloning and gene expression of growth hormone-releasing peptide receptor in rat tissues. Peptiden. 1998;19:15-20, http://dx.doi.org/10.1016/S0196-9781(97)00263-5.

20. Ribeiro AC, LeSauter J, Dupré C, Pfaff DW. Verband tussen opwinding en circadiaan anticiperend gedrag: ventromediale hypothalamus: één knooppunt in een honger-arousal netwerk. Eur J Neurosci. 2009;30(9):1730-8, http://dx.doi.org/10.1111/j.1460-9568.2009.06969.x.

21. Tamura H, Kamegai J, Shimizu T, Ishii S, Sugihara H, Oikawa S. Ghrelin stimuleert GH maar niet voedselinname in arcuate nucleus ablated rats. Endocrinology. 2002;143:3268-75, http://dx.doi.org/10.1210/en.2002-220268.

22. Bowers CY, Reynolds GA, Durham D, Barrera CM, Pezzoli SS, Thorner MO. Growth hormone (GH)-releasing peptide stimulates GH release in normal men and synergistically with GH-releasing hormone. J Clin Endocrinol Metab. 1990;70:975-82, http://dx.doi.org/10.1210/jcem-70-4-975.

23. Pandya N, DeMott-Friberg R, Bowers CY, Barkan AL, Jaffe CA. Growth hormone (GH) releasing peptide-6 requires endogenous hypothalamic GH-releasing hormone for maximal GH stimulation. J Clin Endocrinol Metab. 1998;83:1186-89, http://dx.doi.org/10.1210/jc.83.4.1186.

24. Horikawa R, Tachibana T, Katsumata M, Ishikawa H, Tanaka T. Regulation of pituitary growth hormone-secretagogue and growth hormone-releasing hormone receptor RNA expression in young dwarf rats. Endocr J. 2000;47:S53-S56, http://dx.doi.org/10.1507/endocrj.47.SupplMarch_S53.

25. Cunha SR, Mayo KE. Ghrelin and growth hormone (GH) secretagogues potentiate GH-releasing hormone (GHRH)-induced cyclic adenose 39,59monophosphate production in cells expressing transfected GHRH and GH secretagogue receptors. Endocrinology. 2002;143:4570-82, http://dx.doi.org/10.1210/en.2002-220670.

26. Dickson SL, leng G, Dyball RE, Smith RG. Central actions of peptide and non-peptide growth hormone secretagogues in the rat. Neuro-end ocrinology. 1995;61:36-43, http://dx.doi.org/10.1159/000126825.

27. Popovic V, Damjanovic S, Micic D, Djurovic M, Diegez C, Casanueva FF. Blocked growth hormone-releasing peptide (GHRP-6)-geïnduceerde GH secretion and absence of the synergic action of GHRP-6 plus GHreleasing hormone in patients with hypothalamopituitary disconnection: evidence that GHRP-6 main action is exerted at the hypothalamic level. J Clin Endocrinol Metab. 1995;80:942-47, http://dx.doi.org/10.1210/jc.80.3.942.

28. Gondo RG, Aguiar-Oliveira MH, Hayashida CY, Toledo SP, Abelin N, Levine MA, et al. Growth hormone-releasing peptide-2 stimulates GH secretion in GH-deficient patients with mutated GH-releasing hormone receptor. J Clin Endocrinol Metab. 2001;86:3279-83, http://dx.doi.org/10.1210/jc.86.7.3279.

29. Maheshwari HG, Pezzoli SS, Rahim A, Shalet SM, Thorner MO, Baumann G. Pulsatile growth hormone secretion persists in genetic growth hormone-releasing hormone resistance. Am J Physiol Endocrinol Metab. 2002;282:E943-E951.

30. Roelfsema F, Biermasz NR, Veldman RG, Veldhuis JD, Frölich M, Stokvis-Brantsma WH, et al. Growth hormone (GH) secretion in patients with an inactivating defect of the GH-releasing hormone (GHRH) receptor is pulsatile: evidence for a role for non-GHRH inputs in the generation of GH pulses. J Clin Endocrinol Metab. 2001;86:2459-64, http://dx.doi.org/10.1210/jc.86.6.2459.

31. Mayo KE. Molecular cloning and expression of a pituitary-specific receptor for growth hormone-releasing hormone. Mol Endocrinol. 1992;6:1734-44, http://dx.doi.org/10.1210/me.6.10.1734.

32. Godfrey P, Rahal JO, Beamer WG, Copeland NG, Jenkins NA, Mayo KE. GHRH receptor of little mice contains a missense mutation in the extracellular domain that disrupts receptor function. Nat Genet. 1993;4:227-32, http://dx.doi.org/10.1038/ng0793-227.

33. Lin SC, Lin CR, Gukovsky I, Lusis AJ, Sawchenko PE, Rosenfeld MG. Molecular basis of the little mouse phenotype and implications for cell type-specific growth. Nature. 1993;364:208-13, http://dx.doi.org/10.1038/364208a0.

34. Beck JA, Lloyd S, Hafezparast M, Lennon-Pierce M, Eppig JT, Festing MFW, et al. Genealogies of mouse inbred strains. Nat Genet. 2000;24:235, http://dx.doi.org/10.1038/71641.

35. Wajnrajch MP, Gertner JM, Harbison MD, Chua SC Jr, Leibel RL. Nonsense mutatie in de menselijke groeihormoon-afgiftehormoonreceptor veroorzaakt groeistoornissen analoog aan de kleine (lit) muis. Nat Genet. 1996;12:88-90, http://dx.doi.org/10.1038/ng0196-88.

36. Netchine I, Talon P, Dastot F, Vitaux F, Goossens M, Amselem S. Uitgebreide fenotypische analyse van een familie met groeihormoon (GH) deficiëntie veroorzaakt door een mutatie in het GH-releasing hormone receptor gen. J Clin Endocrinol Metab. 1998;83:432-36, http://dx.doi.org/10.1210/jc.83.2.432.

37. Salvatori R, Hayashida CY, Aguiar-Oliveira MH, Phillips JA 3rd, Souza AH, Gondo RG, et al. Famial dwarfism due to a novel mutation of the growth hormone-releasing hormone receptor gene. J Clin Endocrinol Metab. 1999;84:917-23, http://dx.doi.org/10.1210/jc.84.3.917.

38. Jansson JO, Downs TR, Beamer WG, Frohman LA. Receptor-geassocieerde weerstand tegen groeihormoon-afgevende factor in dwerg ”kleine” muizen. Science. 1986;232:511-2.

39. Gaylinn BD, De Almeida VI, Lyons CE Jr, Wu KC, Mayo KE, Thorner MO. The mutant growth hormone-releasing hormone (GHRH) receptor of the little mouse does not bind GHRH. Endocrinology. 1999;140:5066-74, http://dx.doi.org/10.1210/en.140.11.5066.

40. Clark RG, Robinson ICAF. Effects of a fragment of human growth hormone-releasing factor in normal and little mice. J Endocrinol. 1985;106:1-5, http://dx.doi.org/10.1677/joe.0.1060001.

41. Jansson JO, Downs TR, Beamer WG & Frohman LA. The dwarf little (lit/ lit) mouse is resistent to growth hormone (GH)-releasing peptide (GHRP-6) as well as to GH-releasing hormone (GRH). Programma van de 68e jaarlijkse bijeenkomst van de Endocrine Society, Anaheim, CA, 1986; p.130 (abstract).

42. Roh SG, Chen C, Choi KC, Shrestha Y, Sasaki S. Is GHRH receptor essential to GHRP-2-induced GH secretion in primary cultured rat pituitary cells? Endocrinology. 2002;143:1964-47, http://dx.doi.org/10.1210/en.143.5.1964.

43. Bellini MH, Bartolini P. In vivo bioassay for the potency determination of human growth hormone in dwarf ”little mice”. Endocrinology. 1993;132:2051-55, http://dx.doi.org/10.1210/en.132.5.2051.

44. Lourenço DM Jr, Toledo RA, Coutinho FL, Margarido LC, Siqueira SA, dos Santos MA, et al. The impact of clinical and genetic screenings on the management of the multiple endocrine neoplasia type 1. Clinics. 2007;62:465-76, http://dx.doi.org/10.1590/S1807-59322007000400014.

45. Toledo RA, Mendonça BB, Fragoso MCBV, Soares IC, Almeida MQ, Moraes MB, et al. Isolated familial somatotropinoma: 11q13-loh and gene/protein expression analysis suggests a possible involvement of aip also in non-pituitary tumorigenesis. Clinics. 2010;65:40715, http://dx.doi.org/10.1590/S1807-59322010000400010.

46. Rodbard D. Statistical estimation of the minimal detectable concentration (sensitivity) for radioligand assays. Anal Biochem. 1978;90:1-12, http://dx.doi.org/10.1016/0003-2697(78)90002-7.

47. Bellini MH, Mathor MB, De Luca M, Cancedda R, Bartolini P. Ultrasensitive in vivo bioassay detects bioactive human growth hormone in transduced primary human keratinocytes. J Endocrinol Invest. 1998;21:1-6, http://dx.doi.org/10.3109/07435809809031865.

48. Ghigo E, Arvat E, Muccioli G, Camanni F. Groeihormoon-afgevende peptiden. Eur J Endocrinol. 1997;136:445-60, http://dx.doi.org/10.1530/eje.0.1360445.

49. Lall S, Tung LYC, Ohlsson C, Jansson JO, Dickson SL. Growth hormone(GH)-independent stimulation of adiposity by GH secretagogues. Biochem Biophys Res Commun. 2001;280:132-38, http://dx.doi.org/10.1006/bbrc.2000.4065.

50. Sornson MW, Wu W, Dasen JS, Flynn SE, Norman DJ, O’Connell SM, et al. Pituitary lineage determination by the Prophet of Pit-1 homeodomain factor defective in Ames dwarfism. Nature. 1996; 384:327-33, http://dx.doi.org/10.1038/384327a0.

51. Li S, Crenshaw EB 3rd, Rawson EJ, Simmons DM, Swanson LW, Rosenfeld MG, Dwarf locus mutants lacking three pituitary cell types result from mutations in the POU-domain gene pit-1. Nature. 1990;347:528-33, http://dx.doi.org/10.1038/347528a0.

52. Hayashida CY, Gondo RG, Ferrari C, Toledo SP, Salvatori R, Levine MA, et al. Familiaire groeihormoondeficiëntie met gemuteerd GHRH-receptorgen: klinische en hormonale bevindingen bij homozygote en heterozygote personen uit Itabaianinha. Eur J Endocrinol. 2000;142:557-63, http://dx.doi.org/10.1530/eje.0.1420557.

53. Pernasetti F, Toledo SP, Vasilyev VV, Hayashida CY, Cogan JD, Ferrari C, et al. Impaired adrenocorticotropin-adrenal axis in combined pituitary hormone deficiency caused by a two-base pair deletion (301-302delAG) in the prophet of Pit-1 gene. J Clin Endocrinol Metab. 2000;85:390-7, http://dx.doi.org/10.1210/jc.85.1.390.

54. Maheshwari HG, Rahim A, Shalet SM, Baumann G. Selective lack of growth hormone (GH) response to the GH-releasing peptide hexarelin in patients with GH-releasing hormone receptor deficiency. J Clin Endocrinol Metab. 1999;84:956-59, http://dx.doi.org/10.1210/jc.84.3.956.

55. Fintini D, Alba M, Schally AV, Bowers CY, Parlow AF, Salvatori R. Effects of combined long-term treatment with a growth hormonereleasing hormone analogue and a growth hormone secretagogue in the growth hormone-releasing hormone knock out mouse. Neuroen docrinology. 2005;82:198-207, http://dx.doi.org/10.1159/000092520.

56. Alba M, Fintini D, Bowers CY, Parlow AF, Salvatori R. Effects of longterm treatment with growth hormone-releasing peptide-2 in the GHRH knockout mouse. Am J Physiol Endocrinol Metab. 2005;289:E762-E767, http://dx.doi.org/10.1152/ajpendo.00203.2005.

57. Cheng TC, Beamer WG, Phillips JA, Bartke A, Mallonee RL, Dowling C. Etiologie van groeihormoondeficiëntie bij Little, Ames en Snell dwergmuizen. Endocrinologie. 1983;113:1669-78, http://dx.doi.org/10.1210/endo-113-5-1669.

58. Marmary Y, Parlow AF, Goldsmith CM, He X, Wellner RB, Satomura K, et al. Construction and in vivo efficacy of a replication-deficient recombinant adenovirus encoding murine growth hormone. Endocrinology. 1999;140:260-65, http://dx.doi.org/10.1210/en.140.1.260.

59. Hammer RE, Palmiter RD, Brinster RL. Partial correction of murine hereditary growth disorder by germ line incorporation of a new gene. Nature. 1984;311:65-7, http://dx.doi.org/10.1038/311065a0.

60. Hahn TM, Copeland KC, Woo SLC. Fenotypische correctie van dwerggroei door constitutieve expressie van groeihormoon. Endocrinology. 1996;137:4988-93, http://dx.doi.org/10.1210/en.137.11.4988.

61. Tschop M, Smiley DL, Heiman ML. Ghreline induceert adipositas bij knaagdieren. Nature. 2000;407:908-13, http://dx.doi.org/10.1038/35038090.

62. Toshinai K, Mondal MS, Nakazato M, Date Y, Murakami N, Kojima M, et al. Upregulation of ghrelin expression in the stomach upon fasting, insulin-induced hypoglycemia, and leptin administration. Biochem Biophys Res Commun. 2001;281:1220-25, http://dx.doi.org/10.1006/ bbrc.2001.4518.

63. Tschop M, Statnich MA, Suter TM, Heiman ML. GH-releasing peptide-2 increases fat mass in mice lacking NPY: indication for a crucial mediating role of hypothalamic agouti-related protein. Endocrinology. 2002;143:558-68, http://dx.doi.org/10.1210/en.143.2.558.

64. Akamizu T, Shinomiya T, Irako T, Fukunaga M, Nakai Y, Nakai Y, et al. Separate measurement of plasma levels of acylated and desacyl ghrelin in healthy subjects using a new direct ELISA assay. J Clin Endocrinol Metab. 2005;90:6-9, http://dx.doi.org/10.1210/jc.2004-1640.