Snelle proteïnevloeistofchromatografie (FPLC) en vloeistofchromatografie met hoge prestaties (HPLC): twee vloeistofchromatografische methoden in directe vergelijking. In dit artikel worden de verschillen tussen beide technieken besproken, met bijzondere nadruk op de vereisten van hun respectieve analyten.
De namen fast protein liquid chromatography (FPLC) en high performance liquid chromatography (HPLC) geven een hint naar de verschillen tussen deze chromatografische methoden. Terwijl HPLC met hoge druk werkt om kleine chemische verbindingen te analyseren, zuivert FPLC grote biomoleculen zoals eiwitten of DNA. De chromatografie van biomoleculen is zeer veeleisend en gevoelig omdat zij niet bestand zijn tegen hoge temperaturen, hoge druk of de oplosmiddelen die gewoonlijk bij HPLC worden gebruikt. Om deze redenen vereist de scheiding van biomoleculen een alternatieve benadering van HPLC.
Er worden verschillende termen gebruikt voor snelle eiwitvloeistofchromatografie, zoals biochromatografie, bioseparatie, of biopurificatie. Deze speciale vorm van chromatografie wordt toegepast voor de zuivering van grote biomoleculen van enkele kilodaltons (kDa) zoals eiwitten, nucleotiden of peptiden (figuur 1). Het doel van de FPLC-gebruiker is een zo zuiver en natief mogelijk product te verkrijgen. De doelstellingen van klassieke HPLC daarentegen zijn het identificeren en kwalificeren van analyten, gewoonlijk kleine verbindingen die in grootte variëren van enkele atomen tot ongeveer 3000 Da.
De uitdaging om een zuiver eiwit uit een celextract te verkrijgen
Typisch worden biomoleculen gezuiverd uit bacteriële of eukaryotische cellen, die vol zitten met proteïnen, DNA, RNA en celmembranen. Daarom kan de zuivering van het gewenste eiwit uit een celextract een grote uitdaging vormen. Biochemici passen verschillende trucs toe: één daarvan is het gebruik van recombinante eiwitten, die door de cellen worden overgeëxpresseerd. Overexpressie van het betrokken eiwit maakt het mogelijk het in grotere hoeveelheden te zuiveren. De tweede truc bestaat erin aan het belanghebbende eiwit een tag toe te voegen, die specifiek door de hars (kolommateriaal) wordt herkend. Eiwitten zonder tag binden niet aan de kolom en elueren onmiddellijk, terwijl het gewenste eiwit wordt verrijkt en gemakkelijk kan worden gescheiden.
Biomoleculen worden gezuiverd uit cellulaire lysaten, wat veel grotere monstervolumes betekent dan in analytische HPLC. Daarom worden grotere monsterlussen of zelfs pompen met hogere stroomsnelheden gebruikt om het monster te injecteren. Bovendien zijn de kolommaterialen voor FPLC en HPLC totaal verschillend. Voor HPLC worden silicakorrels met zeer kleine deeltjesgrootte en met een grote weerstand tegen hoge druk gebruikt, terwijl voor FPLC agarose- of polymeermateriaal met grotere deeltjesgrootte nodig is voor de meeste methoden. De harsen die voor FPLC worden gebruikt, zijn niet zo drukstabiel als silicakorrels en zijn zeer gevoelig voor luchtbellen. Bovendien verschilt niet alleen het kolommateriaal maar ook de kolomhardware. Bij klassieke HPLC worden drukvaste kolommen van roestvrij staal gebruikt. Zoals reeds gezegd, is drukstabiliteit niet belangrijk voor FPLC en kan dus worden gewerkt met transparante en biocompatibele glazen kolommen. Dit is een groot voordeel omdat de gebruiker de kolom kan controleren op luchtbellen of de conditie van het materiaal tijdens een zuiveringsrun kan controleren.
Diverse biomoleculen, diverse zuiveringsmethoden
De verschillen in het kolommateriaal komen ook tot uiting in de methoden. Bij analytische HPLC is reversed phase-chromatografie met hydrofobe stationaire fasen en polaire mobiele fasen de voorkeursmethode, terwijl bij FPLC een grotere verscheidenheid van methoden wordt toegepast (figuur 2). Een van de FPLC-methoden is grootte-exclusiechromatografie (SEC), waarbij moleculen op basis van hun grootte worden gescheiden. Kleinere moleculen kunnen in de poriën van de korrels diffunderen, terwijl grotere moleculen vrijwel ongehinderd door de kolom gaan. De kleinere moleculen elueren later uit de kolom, waardoor een gradiënt van deze moleculen naar gelang van hun grootte ontstaat. Een andere scheidingsmethode is ionenwisselingschromatografie. Biomoleculen worden gescheiden en gezuiverd op basis van hun specifieke lading, die afhangt van de pH van de buffer. Hoe meer geladen het eiwit is, hoe beter het zich zal binden aan de tegenovergestelde geladen hars. Om het eiwit uit de kolom te elueren wordt de concentratie zoutionen tijdens de run verhoogd. De zoutionen concurreren met het eiwit voor binding aan de hars. Een andere belangrijke FPLC-methode is affiniteitschromatografie, waarbij het betrokken molecuul zich specifiek aan de kolom kan binden, terwijl de andere moleculen dat niet kunnen en zonder binding zullen elueren. Hierbij worden kolommen met speciale media gebruikt die het gewenste biomolecuul herkennen. Een speciale vorm van affiniteits-chromatografie is geïmmobiliseerde metaalion-affiniteit (IMAC). Het eiwit van interesse moet genetisch worden gewijzigd door een tag aan het eiwit toe te voegen, die meestal uit zes histidines bestaat. De IMAC-hars herkent specifiek deze “Hisâtag”. Elutie vindt plaats door verhoging van de concentratie imidazool die concurreert met de His-getagde eiwitten. Bovendien kunnen eiwitten ook worden gescheiden op basis van hun specifieke hydrofobiciteit met behulp van de hydrofobe-interactie scheidingsmethode. De hars wordt zo samengesteld dat de meest hydrofobe eiwitten zich het sterkst aan de kolom binden en worden geëlueerd door de zoutgradiënt te verlagen.
Om een gewenst eiwit te zuiveren, wordt meestal een combinatie van methoden gebruikt. In de eerste stap, de zogenaamde “capture”-stap, wordt het eiwit gezuiverd uit het ruwe extract. Gewoonlijk wordt voor deze eerste zuiveringsstap affiniteits-chromatografie gebruikt. In de tweede stap, de “tussenstap”, wordt verdere verontreiniging verwijderd door ionenuitwisselingschromatografie of hydrofobe interactie. Het doel van de laatste “polijst”-stap – meestal een maatexclusiechromatografiestap – is zich te ontdoen van alle resterende onzuiverheden om een product met hoge zuiverheid te verkrijgen. Deze strategie voor de zuivering van eiwitten is volledig afhankelijk van de specifieke biomolecule. In sommige gevallen kan een zuivering in twee stappen voldoende zijn. Hoe meer methoden worden gecombineerd, hoe meer van het betrokken eiwit tijdens de zuivering verloren gaat, maar een hogere zuiverheid kan worden bereikt.
Na de zuivering kan het verkregen monster worden geanalyseerd op zuiverheid, concentratie en enzymfunctie of -activiteit met behulp van HPLC, natriumdodecylsulfaat polyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE), enzymactiviteitstests, of massaspectrometrie.
FPLC-vereisten
Proteïnen zijn opgebouwd uit aminozuren die als een keten op een rij staan. Deze keten is gevouwen tot een driedimensionale structuur, die de sleutel is tot de functie en activiteit van elk eiwit. Daarom is het van groot belang dat deze eiwitstructuur tijdens het zuiveringsproces behouden blijft. Externe factoren zoals hoge temperatuur, hoge druk, extreme pH, of oplosmiddelen kunnen de eiwitstructuur verstoren en worden daarom bij FPLC vermeden. De werktemperatuur voor eiwitten is meestal 4 °C. Daarom wordt een FPLC-machine vaak in een koude kamer of koelruimte geplaatst, waar zij niet alleen aan lage temperaturen maar ook aan condenserende vochtigheid wordt blootgesteld. De componenten van een FPLC-systeem moeten speciaal voor deze omstandigheden worden ontworpen. Bovendien stuiten de FPLC-componenten op een extra uitdaging, namelijk de zoutbufferoplossingen die als eluenten worden gebruikt. Gewoonlijk wordt gekozen voor een isosmotische pH en zoutconcentraties die vergelijkbaar zijn met het celmilieu. Chromatografiesystemen zijn over het algemeen vervaardigd van roestvrij staal. Enerzijds kan het zout in de buffers leiden tot corrosie en anderzijds kunnen de metaalionen van het roestvrij staal interfereren met het eiwit en de structuur ervan verstoren. Daarom is het belangrijk roestvrij staal te vermijden en biocompatibel materiaal te gebruiken zoals polyether ether ketone (PEEK) keramiek of titanium wanneer FPLC wordt uitgevoerd. Net als HPLC-systemen worden ook FPLC-systemen door software gestuurd. Er zijn aanzienlijke verschillen tussen FPLC- en HPLC-software. Laatstgenoemde wordt hoofdzakelijk gebruikt voor de analyse van de monsters en bevat veel analyse-instrumenten. In FPLC daarentegen zijn niet veel analyse-instrumenten nodig en is het gebruikelijk methoden te genereren op basis van volume of zelfs kolomvolume (figuur 3). Voor de meeste FPLC-toepassingen wordt de voorkeur gegeven aan op kolomvolume gebaseerde methoden, waardoor opschaling gemakkelijk wordt. FPLC-software is meestal zeer intuïtief en gebruikersvriendelijk en omvat directe controle, waardoor de parameters tijdens een run kunnen worden aangepast. Daardoor kan de gebruiker zeer spontaan reageren op verschillende situaties.
Het is dus duidelijk dat er grote verschillen zijn tussen deze twee chromatografische gebieden (tabel 1). De methoden, hardware en software verschillen sterk naar gelang van de vraag of het molecuul wordt geanalyseerd of gezuiverd. Voor FPLC-toepassingen wordt de uitdaging nog groter door de gevoelige aard van de monsters en het streven om deze zo natief mogelijk te houden. Over het geheel genomen zijn beide technieken zeer interessante gebieden waarvan iedereen die op dit gebied werkzaam is op de hoogte zou moeten zijn.
Stephanie Runde is afgestudeerd aan de Technische Universiteit van München, Duitsland, met een diploma in de biochemie. Ze promoveerde aan de Freie Universität Berlin, Duitsland, en werkt momenteel bij Knauer Wissenschaftliche Geräte GmbH als productmanager voor FPLC.