Is formamide een plausibele prebiotische precursor?

De aard van de chemische stoffen die de rol speelden van prebiotische precursoren op de primitieve Aarde is nog steeds een omstreden argument. In een algemene benadering van het probleem moet rekening worden gehouden met de volgende fysische en chemische eigenschappen van de beschouwde eenvoudige organische verbindingen. Namelijk: (i) de relatieve overvloed van de biogene uitgangsmaterialen, te beschouwen als een eerste vereiste voor het vroege begin van genetische processen op deze planeet; (ii) hun stabiliteit; (iii) hun vermogen om te reageren tot complexere structuren volgens reproduceerbare routes. De vorming van precursoren op basis van eenvoudige chemische processen, en de quasi-simultane aanwezigheid van alle bouwstenen die gebruikt moeten worden voor de assemblage van informatiemoleculen, zijn andere belangrijke vereisten.

(i) Beschikbaarheid

Formamide (H2NCOH) voldoet aan de vereiste criteria van abundantie en verspreiding in het heelal. De analyse van de moleculaire samenstelling van kometen-asteroïden en van de interstellaire wolken toont aan dat de verbindingen gemaakt van de 4 meest voorkomende en biologisch relevante elementen H, O, C en N (exclusief He) isocyanaat HNCO en formamide H2NCOH zijn. Formamide werd gedetecteerd in de gasfase van het interstellaire medium , in de komeet Hale-Bopp , en voorlopig in de vaste fase van korrels rond het jonge stellaire object W33A . Mogelijke formamideproductie onder Europa-achtige omstandigheden werd waargenomen (Hand, K.; Carlson, R. W., Department of Geological & Environmental Sciences, Stanford University; persoonlijke mededeling, juli 2006).

(ii) Stabiliteit

Formamide voldoet aan de vereiste criteria van stabiliteit. Dit onderwerp moet worden beschouwd in samenhang met de chemie van waterstofcyanide (HCN). Sinds het cruciale experiment van Orò over de synthese van adenine uit HCN, werden talrijke studies gewijd aan de rol van deze verbinding in de oorsprong van de oer-nucleïnezuren. Twee problemen in de prebiotische relevantie van de chemie van HCN blijven echter onopgelost: (i) de thermodynamische instabiliteit van HCN onder hydrolytische omstandigheden, (ii) de beperkte groep van nucleobasen, beperkt tot purines, die door het condensatieproces kunnen worden gevormd. In het licht van deze laatste observatie werd een volledig purine precursor van nucleïnezuren voorgesteld, waarin de pyrimidines die aanwezig zijn in bestaande nucleïnezuren post-enzymatische substituten zouden zijn voor hun isoelectronische en isogeometrische purines. HCN is een gas in een breed scala van omgevingsomstandigheden. Zo vereist de chemie van HCN in homogene oplossing (het algemeen aanvaarde chemische prebiotische scenario op de primitieve Aarde) eerst absorptie in water. Na het adsorptieproces concurreren polymerisatie en hydrolyse van HCN, waarbij de resultaten worden bepaald door de concentratie. De twee reacties zijn equivalent bij concentraties van HCN tussen 0,01 en 0,1 M (tussen pH 8 en 9). Hydrolyse tot formamide (figuur 1, vergelijking A) overheerst in verdunde oplossingen, terwijl polymerisatie de overhand neemt bij hogere concentraties. De stationaire concentratie van HCN in de primitieve oceaan werd, op basis van de geraamde productie- en hydrolysesnelheden, berekend op 4 × 10-12 M bij pH7 bij 100°C en 2 × 10-5 M bij O°C. Deze concentraties zijn veel te laag om polymerisatie tot nucleobasen te laten plaatsvinden, waardoor hydrolyse tot formamide wordt bevorderd.

Omdat HCN vluchtiger is dan water kan het niet worden geconcentreerd door eenvoudige verdamping bij een pH lager dan zijn pKa (9,2 bij 25°C). Dit suggereerde eutectisch bevriezen als een middel voor HCN om de voldoende concentratie voor polymerisatie te bereiken.

In dezelfde studie werd de hydrolysesnelheid (en de stationaire concentratie) van formamide tot ammoniumformiaat (figuur 1, vergelijking B) ook geschat op 2 × 10-18, 1 × 10-15 en 1 × 10-9 M, bij respectievelijk 200, 100 en 0°C, ervan uitgaande dat in de primitieve oceaan formamide alleen werd gevormd door hydrolyse van HCN.

Op grond van deze gegevens suggereren de auteurs dat “het onwaarschijnlijk is dat formamide een rol van betekenis heeft kunnen spelen in de prebiotische chemie”, een vrij definitieve uitspraak voor deze verbinding!

Bij deze veronderstelling wordt echter geen rekening gehouden met het feit dat (i) formamide kan worden gevormd uit andere prebiotische verbindingen dan HCN die grotendeels op de primitieve Aarde zijn verspreid, en (ii) dat formamide vloeibaar is onder een groot bereik van temperatuur- en drukwaarden, met een kookpunt van 210°C en zeer beperkte azeotropische effecten . In tegenstelling tot HCN kan formamide in een drooglagermodel dus gemakkelijk geconcentreerd worden, waardoor de stabiliteit bij concentratie toeneemt en er voldoende concentratie is om polymerisatie tot nucleobasen te laten plaatsvinden. De hydrolyse van formamide in water werd opnieuw onderzocht door het bestuderen van het deuterium kinetisch isotoop effect van het oplosmiddel. Deze analyse leverde een waarde op van de constante khyd van 1,1 × 10-10 s-1, overeenkomend met een t1/2 van ca. 200 jaar bij 25°C en pH 7,0.

(iii) Reactiviteit

Als een organische verbinding die in staat is om “in situ” vele andere eenvoudige chemische stoffen te genereren die nuttig zijn voor de synthese van nucleobasen, kan formamide worden beschouwd als een multifunctionele prebiotische precursor. De verhouding van de verkregen precursoren hangt af van de specifieke omgevingsomstandigheden.

Bij 190-210°C onder atmosferische druk ontleedt formamide thermisch tot ammoniak (NH3) en koolmonoxide (CO) (figuur 1, vergelijking C) of tot HCN en water (figuur 1, vergelijking D). De vorming van HCN wordt meestal bevorderd in aanwezigheid van geschikte katalysatoren, d.w.z. met aluminiumoxiden bedraagt het rendement bij temperaturen tussen 400°C en 600°C >90%, terwijl bij afwezigheid van katalysatoren de reactie waarbij NH3 en CO worden gevormd, overheerst. Andere ontledingsproducten worden ook gedetecteerd. Hiertoe behoren polymere waterstofcyanidederivaten die onder hydrolytische omstandigheden nucleobasen kunnen produceren. Door zijn hoge diëlektrische constante is formamide bovendien een uitstekend oplosmiddel voor zowel metaaloxiden als anorganische zouten, die als katalysator kunnen fungeren tijdens de condensatieprocessen tot nucleobasen.

Dus wordt de samenstelling van een reactiemengsel op basis van formamide als hoofdbestanddeel afgestemd door de samenstelling van de omgevingsreactor die, afgezien van HCN, alle prebiotische precursoren levert die nodig zijn voor de synthese van zowel purine- als pyrimidine-nucleobasen. De samenstelling van het panel van de prebiotische producten is afhankelijk van de specifieke fysische en chemische eigenschappen van de in het reactiemedium aanwezige katalysatoren, zoals hieronder nader wordt beschreven.

De synthese van nucleïne precursors uit formamide

Nucleïne basen, een aminozuur en een condensator

Nucleïne basen

We hebben waargenomen dat formamide de unieke eigenschap heeft om te condenseren tot zowel purine als pyrimidine nucleobasen eenvoudigweg bij verhitting bij 110-160°C in aanwezigheid van grotendeels verspreide metaaloxiden en mineralen . De verkregen producten zijn opgenomen in tabel 1, gekruist met de geteste katalysatoren en gegroepeerd als functie van (bij benadering) toenemende complexiteit. Purine is de enige verbinding die wordt verkregen door verhitting van formamide in afwezigheid van katalysatoren. De meest relevante aspecten van dit grote ensemble van producten zijn:

– het panel van verbindingen dat in aanwezigheid van elke katalysator wordt verkregen, is “schoon”. Er worden slechts enkele producten waargenomen, waarbij in bepaalde gevallen de synthese zeer specifiek is, zoals in het geval van het fosfaatmineraal pyromorfiet dat uitsluitend cytosine oplevert of in het geval van kinderiet dat vrijwel uitsluitend N-formylglycine oplevert. In andere gevallen worden rijkere groepen producten verkregen, zoals met pyrofosfaat Na4P2O7, dat (naast purine) adenine, hypoxantine (een bio-isoster van guanine), uracil, cytosine, N-formylglycine en carbodiimide oplevert; en met TiO2 dat (naast purine) adenine, N9-formylpurine, N9-N6-diformyladenine, cytosine, thymine en 5-hydroxymethyluracil oplevert.

– Heel interessant is dat TiO2 ook de synthese van purine acyclonucleosiden katalyseert (niet gerapporteerd in tabel 1, zie Ref 23). Deze observatie is van bijzonder prebiotisch belang vanwege de bekende moeilijkheid om onder prebiotische condities de β-glycoside binding tussen afzonderlijk gesynthetiseerde nucleobasen en suikers tot stand te brengen. Hoe dan ook, zelfs in het geval van relatief complexere mengsels behouden de productprofielen hun karakter van netheid en bevatten gewoonlijk geen afbraakproducten of extra klassen van verbindingen.

Glycine en carbodiimide

Het α-aminozuurderivaat N-formylglycine werd gedetecteerd in op formamide gebaseerde syntheses gekatalyseerd door fosfaat-mineralen, vaak vergezeld van carbodiimide . De synthese van carbodiimide, een belangrijk middel voor de condensatie van aminozuren tot peptiden, zou verantwoordelijk kunnen zijn voor de vorming van formylglycine uit in situ gegenereerd glycine , wat een rol suggereert voor het formamide-fosfaat systeem in de prebiotische synthese van peptiden.

Intermediairs van de synthetische routes voor componenten van bestaande nucleïnezuren zijn ook waargenomen, d.w.z, 4-aminoimidazool-5-carboxamide (AICA), 4-formylaminoimidazool-5-carboxamide (f-AICA) en 5-hydroxymethyluracil.

De chemische mechanismen waarop al deze syntheses zijn gebaseerd, worden beschreven en kritisch besproken in .

Het chemomimesis concept als een selector van prebiotische precursoren

Zoals hierboven vermeld, is de identiteit van de eerste prebiotische precursoren van nucleïnezuren nog steeds een punt van discussie. Anderzijds brengt de analyse van het reactiemechanisme van eenvoudige organische moleculen gevallen aan het licht waarin ook belangrijke tussenproducten worden geproduceerd die overeenkomen met die welke in bestaande biologische routes worden waargenomen. Het begrip chemomimesis is van toepassing op deze overeenkomsten. Deze term, die voor het eerst in 1992 door Eschenmoser en Loewenthal werd geïntroduceerd, verwijst in het algemeen naar een chemisch reactiepad dat kan worden gebruikt als sjabloon voor de enzymatische processen die later in de evolutie zullen optreden en dezelfde eindproducten zullen opleveren. Deze eigenschap kan in principe twee klassen van prebiotische precursoren onderscheiden: de precursoren die een chemomimetisch proces kunnen genereren en die welke dat niet kunnen. De formamide chemie vertoont interessante gevallen van chemomimesis.

Als voorbeeld kunnen 5-aminoimidazool-4-carboxamide (AICA) en 5-formamido-imidazool-4-carboxamide (f-AICA) worden genoemd, die in hoge opbrengst naast hypoxanthine worden verkregen bij verhitting van formamide in de aanwezigheid van montmorillonieten (tabel 1), zijn ook belangrijke tussenproducten (als ribonucleotide-5′-monofosfaten) in de laatste stappen van de nog bestaande biosynthese van inosine-5′-monofosfaat (IMP), de hoofdroute naar purinenucleotiden in de cel (figuur 2).

Ook de toevoeging van formaldehyde aan een voorgevormde uracil scaffold tijdens de synthese van thymine uit formamide en TiO2 is een belangrijke stap voor de introductie van het methylgedeelte, in overeenstemming met de extante biosynthese van thymidine. In deze reactie wordt een formaldehyde-eenheid toegevoegd aan uridine, gemaskeerd als de geactiveerde methyleeneenheid van methyleentetrahydrofolaat (MTHF) om 5-hydroxymethyluracil-5′-monofosfaat (HMU-5′-monofosfaat) te geven. Thymidine wordt verkregen door opeenvolgende hydride-shift herschikkingen.

De mogelijkheid dat vroege chemische gebeurtenissen de rol speelden van sjablonen voor de ontwikkeling van meer complexe (maar ook meer efficiënte en selectieve) enzymatische routes is een fascinerend concept dat verder geëvalueerd moet worden in de studie van de moleculaire evolutie van informatiepolymeren.

Problemen in prebiotische polymerisatie

Geactiveerde precursoren

Evolutie van de genetische informatie op basis van lineaire polymeren impliceert een sjabloon-gemedieerd replicatiemechanisme. Door voortplanting volgens een sjabloon kan de geaccumuleerde informatie in stand worden gehouden en zo nu en dan worden gewijzigd, waardoor chemisch gebaseerde evolutionaire regels tot stand komen. Niet-enzymatische zelf-replicerende systemen gebaseerd op template-gestuurde synthese van oligonucleotiden werden gerapporteerd (waaronder die gerapporteerd in , herzien in ), en leverden het principebewijs voor de plausibiliteit van dit algemene mechanisme. De eerste pre-genetische polymeren waren niet noodzakelijkerwijs gemaakt van de suikermotieven waaruit de huidige nucleïnezuren zijn opgebouwd, noch waren de nucleosiden geforceerd met elkaar verbonden door de fosfoesterverbindingen die wij vandaag de dag ervaren. Uitvoerige analyses van de mogelijke alternatieven werden gerapporteerd. Bij gebrek aan directe bewijzen of solide aanwijzingen voor het tegendeel, wordt echter veilig aangenomen dat de genetische evolutie is ontstaan op basis van RNA-achtige polymeren, dat ribose- en fosfodiësterverbindingen de eigenlijke componenten waren waarvan de eigenschappen de evolutie mogelijk maakten en in gang hebben gezet, dat de moleculaire paarden tijdens de loop niet zijn veranderd. De redenen die pleiten voor fosfaat als verbindend element zijn welbekend.

Een algemeen probleem vloeit voort uit het feit dat de vorming van een fosfodiesterbinding thermodynamisch bergopwaarts gaat. Aldus vereiste de sjabloongerichte eiwitvrije prebiotische synthese van fosfodiester-gekoppelde oligonucleotiden hoogstwaarschijnlijk het gebruik van chemisch geactiveerde nucleotiden.

Formamide-gekatalyseerde fosforylering van nucleosiden

De prebiotische relevantie van de voorgestelde mechanismen voor de productie van geactiveerde nucleosiden is twijfelachtig. De overigens belangrijke waarneming dat door het drogen van het chemisch geactiveerde nucleoside 5′-fosforimidazolide-adenosine (ImpA) op het oppervlak van een montmorillonietklei een vooraf geabsorbeerd decanucleotide kon worden verlengd met maximaal 30 extra nucleotiden en soortgelijke resultaten in vergelijkbare systemen in , lijden aan dezelfde beperking. Er was dus waarschijnlijk sprake van een efficiënt en robuust katalytisch mechanisme voor de activering (mogelijk fosforylering) van nucleosiden. Wij hebben waargenomen dat fosforylering van nucleosiden gemakkelijk optreedt in aanwezigheid van formamide en van een fosfaatdonor. De donor kan een oplosbaar mono-, di- of trifosfaat zijn; of een ander gefosforyleerd nucleoside; of een van de verschillende kristallijne fosfaatmineralen waaronder hydroxylapatiet, libetheniet en pseudomalachiet (gegevens niet gedetailleerd, ingediend voor publicatie elders). Fosforylering vond plaats op de 5′, of de 3′, of de 2′ C-atomen van het ribosegedeelte, en 2′:3′ en 3′:5′ cyclische fosfoester vormen werden ook waargenomen. Gebaseerd op de baanbrekende waarneming van Orgel dat dinucleoside difosfaten zich vormden uit adenosine 2′:3′ cyclisch fosfaat, is dit cyclisch fosfaat ribonucleotide systeem van mogelijk bijzondere prebiotische relevantie.

Vochtig versus niet-waterig

De chemisch relatief gemakkelijke vorming van lineaire polymeren uit geactiveerde precursoren lost het probleem van hun oorsprong niet op. Het probleem van de standaard-toestand Gibbs vrije energieverandering (ΔG°’), zoals kritisch geëvalueerd door van Holde , en de intrinsieke instabiliteit van polymeren in oplossing beperken de vorming en het voortbestaan van polymeren in waterige milieus. Het ΔG°’ probleem is het belangrijkste obstakel voor polymerisaties in vloeibare fase in prebiotische omstandigheden.

De bovenvermelde fosforylering van nucleosiden op minerale oppervlakken werd verkregen in aanwezigheid van formamide. Aldus kunnen geactiveerde nucleïsche monomeren worden gevormd in een vloeibaar niet-waterig milieu onder omstandigheden die verenigbaar zijn met de thermodynamica van polymerisatie, waardoor een operationele oplossing wordt geboden. Als formamide geactiveerde precursoren zou leveren door fosforylering van nucleosiden en hun polymerisatie mogelijk zou maken door een eenvoudige trans-fosforyleringreactie (een nog hypothetisch maar chemisch plausibel proces), zou de beperkende factor voor de evolutie van pre-genetische moleculen de stabiliteit worden van de resulterende gepolymeriseerde vormen. Met andere woorden, wanneer wordt gekeken naar de omstandigheden waarin pre-genetische polymeren spontaan zouden kunnen polymeriseren, repliceren en evolueren, zijn de fysisch-chemische parameters die het voortbestaan van de zeer polymerische toestand bevorderen of mogelijk maken, van het grootste belang. Vandaar het belang van het definiëren van de initiële thermodynamische niches waarin de polymere toestand bevoordeeld zou kunnen zijn boven de monomere.

Deze niches werden geïdentificeerd voor zowel de deoxyribo als de ribo systemen, waarbij wordt aangetoond dat bepaalde combinaties van temperatuur en oplosmiddel de polymere toestand bevorderen. Deze niches zijn opmerkelijk breder voor RNA dan voor DNA (cfr gegevens in versus ).

In het kader van de “RNA-wereld”-hypothese toont deze bevinding aan dat naast de drie belangrijke eigenschappen van RNA ook de eigenschap van begunstigde persistentie in aanmerking moet worden genomen. Deze vierde eigenschap bestaat uit het geheel van thermodynamische en kinetische parameters die betrekking hebben op het polymerisatieproces en de stabiliteit van de polymeren. De omstandigheden die oligomere persistentie bevorderen zouden mogelijk informatie kunnen verschaffen over de omgeving waarin de ur-genetische moleculen ontstonden en overleefden.

Stabiliteit als kritisch fenotype voor de evolutie van informatiedragende polymeren

Bij het reconstrueren van de overgang van monomeren naar de informatiedragende polymeren die wij thans kennen, en het samenvatten van de hierboven gerapporteerde gegevens, hebben wij waargenomen dat formamide 1) condenseert tot alle nucleïnebasen die nodig zijn om de huidige nucleïnezuren te vormen. Dit proces vereist slechts een gematigde temperatuur (110-160°C) en gemakkelijk verkrijgbare katalysatoren. 2) Er worden verschillende verbindingen gevormd die een verborgen β-glycoside binding omsluiten, waarmee mogelijk de chemische rebus wordt opgelost die is ontstaan door de non-reactiviteit van nucleïnebasen met suikers. 3) Op formamide gebaseerde fosforylering van voorgevormde nucleosiden werd waargenomen (elders ingediende gegevens), hetgeen een plausibele oplossing biedt voor het probleem van het chemisch robuuste mechanisme dat nodig is voor een niet-fastidieuze productie met hoge opbrengst van geactiveerde precursors. De vorming van polymeren zou kunnen worden verondersteld via een formamide-gedreven sjabloon-gestuurd trans-fosforylatieproces. Het geschikte sjabloon zou kunnen worden geleverd door een mineraal oppervlak of door nucleaire polymeren. Deze processen leveren een eenvoudig-chemisch kader waarin alle stappen van de één-koolstofatoomverbinding H2NCOH tot geactiveerde nucleotiden zijn beschreven. Al deze reacties vereisen formamide als bouwstof en/of als katalysator.

Overlevende organismen leven echter in water, niet in formamide. En de structuur en eigenschappen van nucleïnezuren wijzen er sterk op dat interactie met water een van hun meest intieme eigenschappen is. In welk stadium kan de overgang van een formamide omgeving naar water hebben plaatsgevonden?

Op dit punt bevinden we ons op hypothetische gronden. Laten we uitgaan van een model waarin de synthese van een ribo-oligonucleotide heeft plaatsgevonden door het verbinden van vooraf gesynthetiseerde nucleosiden ], gefosforyleerd door formamide-gekatalyseerde fosforylering en verbonden door formamide-gekatalyseerde trans-phosphorylering (hypothetisch). Fosfodiesterbruggen tussen nucleosiden zouden kunnen zijn ontstaan tussen monomeren die als afzonderlijke eenheden zijn gebonden aan fosfaatminerale oppervlakken die zowel een bron voor fosfaatmoleculen als een correcte ruimtelijke ordening bieden. De P-P afstand in een uitgerekt nucleïnezuur is een welbepaalde 9,15 Å, in goede overeenstemming met de afmetingen van de kristalcellen van fosfaatmineralen waarvan de a- en b-waarden in een groot aantal verschillende mineralen liggen tussen 6 en 10 Å (eerste generatie stadium). Als alternatief, of in een later stadium, zouden zich fosfodiësterbruggen hebben gevormd tussen geactiveerde monomeren die als afzonderlijke eenheden aan nucleïnezuursjablonen zijn gebonden (tweede generatiestadium). Beide stadia vereisen formamide als de drijvende chemische stof voor de vorming van fosfaatbruggen.