FRAP kan ook worden gebruikt om eiwitten buiten het membraan te controleren. Nadat het betrokken eiwit fluorescerend is gemaakt, meestal door expressie als een GFP-fusie-eiwit, wordt een confocale microscoop gebruikt om een gebied van het cytoplasma, de mitotische spindel, de kern of een andere cellulaire structuur te fotobleachen en te controleren. De gemiddelde fluorescentie in het gebied kan dan worden uitgezet tegen de tijd sinds de fotobleaching, en de resulterende curve kan kinetische coëfficiënten opleveren, zoals die voor de bindingsreacties van het eiwit en/of de diffusiecoëfficiënt van het eiwit in het medium waar het wordt gevolgd. Vaak worden alleen diffusie en bindings/ontbindingsinteracties als dynamica beschouwd, maar in principe kunnen eiwitten ook via stroming bewegen, d.w.z, Dit kan te wijten zijn aan stroming van het cytoplasma of nucleoplasma, of transport langs filamenten in de cel zoals microtubuli door moleculaire motoren.

De analyse is het eenvoudigst wanneer het fluorescentieherstel wordt beperkt door ofwel de snelheid van diffusie in het gebleekte gebied of door de snelheid waarmee gebleekte eiwitten zich losmaken van hun bindingsplaatsen binnen het gebleekte gebied en worden vervangen door fluorescerend eiwit. Laten we eens kijken naar deze twee grenzen, voor het veel voorkomende geval van het bleken van een GFP fusie-eiwit in een levende cel.

Diffusie-beperkte fluorescentie herstelEdit

Voor een cirkelvormige bleekvlek met een straal w {Displaystyle w}

en diffusie-gedomineerde terugwinning, wordt de fluorescentie beschreven door een vergelijking afgeleid door Soumpasis (die gemodificeerde Bessel-functies I 0 {\displaystyle I_{0}}

en I 1 {\displaystyle I_{1}}

) f ( t ) = e – 2 τ D / t ( I 0 ( 2 τ D / t ) + I 1 ( 2 τ D / t ) ) {\displaystyle f(t )=e^{-2\tau _{D}/t}(I_{0}(2\tau _{D}/t)+I_{1}(2\tau _{D}/t)}

met τ D {{Displaystyle \tau _{D}}

de karakteristieke tijdschaal voor diffusie, en t {\displaystyle t}

is de tijd. f ( t ) {Displaystyle f(t)}

is de genormaliseerde fluorescentie (gaat naar 1 als t {{displaystyle t}

naar oneindig gaat). De diffusietijdschaal voor een gebleekte vlek met een straal w {\displaystyle w}

is τ D = w 2 / ( 4 D ) {\displaystyle \tau _{D}=w^{2}/(4D)}

, met D de diffusiecoëfficiënt.

Merk op dat dit geldt voor een instantverbleking met een stapfunctieprofiel, d.w.z. dat de fractie f b {{b}}

van eiwit verondersteld instantaan te worden gebleekt op tijdstip t = 0 {\displaystyle t=0}

is f b ( r ) = b , r < w {\displaystyle f_{b}(r)=b,~~r<w}

, en f b ( r ) = 0 , r > w {{bisplaystyle f_{b}(r)=0,~~r>w}

, voor r {{displaystyle r}

de afstand tot het centrum van het gebleekte gebied is. Ook wordt aangenomen dat het herstel kan worden gemodelleerd door diffusie in twee dimensies, die bovendien uniform en isotroop is. Met andere woorden, dat de diffusie optreedt in een uniform medium, zodat de effectieve diffusieconstante D overal gelijk is, en dat de diffusie isotroop, d.w.z. dat zij langs alle assen in het vlak met dezelfde snelheid optreedt.

In de praktijk zal in een cel geen van deze veronderstellingen strikt waar zijn.

1. Blèren zal niet ogenblikkelijk gebeuren. Vooral als een groot oppervlak sterk moet worden gebleekt, kan het bleken een aanzienlijk deel van de diffusietijdschaal τ D in beslag nemen.
   

   . Dan zal een aanzienlijk deel van het gebleekte eiwit tijdens het bleken uit de gebleekte regio diffunderen. Als hiermee geen rekening wordt gehouden, ontstaat een aanzienlijke fout in D.

2. Het gebleekte profiel zal geen radiale stapfunctie zijn. Als de gebleekte vlek in feite één enkele pixel is, zal het bleken als functie van de positie typisch diffractiebeperkend zijn en worden bepaald door de optica van de gebruikte confocale laserscanningmicroscoop. Dit is geen radiale stapfunctie en varieert ook langs de as die loodrecht op het vlak staat.
3. Cellen zijn natuurlijk driedimensionaal en niet tweedimensionaal, evenals het gebleekte volume. Het verwaarlozen van diffusie buiten het vlak (wij nemen aan dat dit het xy-vlak is) zal slechts een redelijke benadering zijn indien de fluorescentie zich hoofdzakelijk herstelt via diffusie in dit vlak. Dit zal bijvoorbeeld het geval zijn indien een cilindrisch volume wordt gebleekt met de as van de cilinder langs de z-as en met dit cilindrische volume over de gehele hoogte van de cel. Dan veroorzaakt diffusie langs de z-as geen fluorescentieherstel omdat alle eiwit uniform langs de z-as wordt gebleekt, en is verwaarlozing ervan, zoals de vergelijking van Soumpasis doet, dus ongevaarlijk. Als diffusie langs de z-as echter wel bijdraagt tot fluorescentieherstel, dan moet daarmee rekening worden gehouden.
4. Er is geen reden om te verwachten dat het cytoplasma of nucleoplasma van de cel volledig ruimtelijk uniform of isotroop is.

Dus is de Soumpasis-vergelijking slechts een nuttige benadering, die kan worden gebruikt wanneer de hierboven genoemde veronderstellingen goede benaderingen zijn van de werkelijke situatie, en wanneer het herstel van de fluorescentie inderdaad wordt beperkt door de tijdschaal van diffusie τ D {Displaystyle \tau _{D}}

. Merk op dat het feit dat de Soumpasis adequaat aan de gegevens kan worden aangepast, niet noodzakelijkerwijs betekent dat de veronderstellingen juist zijn en dat diffusie de terugwinning domineert.

Reactie-gelimiteerd herstelEdit

De vergelijking die de fluorescentie als functie van de tijd beschrijft, is bijzonder eenvoudig in een andere limiet. Als een groot aantal eiwitten zich bindt aan plaatsen in een klein volume, zodanig dat daar het fluorescentiesignaal wordt gedomineerd door het signaal van gebonden eiwitten, en als deze binding allemaal in een enkele toestand is met een uitsnelheid koff, dan wordt de fluorescentie als functie van de tijd gegeven door

f ( t ) = 1 – e – k off t {Displaystyle f(t)=1-e^{-k_{text{off}t}}

Merk op dat het herstel alleen afhangt van de snelheidsconstante voor het loslaten van de binding, koff. Het hangt niet af van de snelheid van binding. Hoewel dit wel afhangt van een aantal veronderstellingen

1. De snelheid voor binding moet voldoende groot zijn om ervoor te zorgen dat de lokale concentratie van gebonden eiwit veel groter is dan de lokale concentratie van vrij eiwit, zodat we de bijdrage aan f van het vrije eiwit kunnen verwaarlozen.
2. De reactie is een eenvoudige bimoleculaire reactie, waarbij het eiwit bindt aan gelokaliseerde plaatsen die tijdens het herstel niet noemenswaardig bewegen
3. Uitwisseling is veel langzamer dan diffusie (of welk transportmechanisme ook verantwoordelijk is voor de mobiliteit), omdat alleen dan de diffunderende fractie snel herstelt en dan fungeert als de bron van fluorescerend eiwit dat zich bindt en het gebonden gebleekte eiwit vervangt en zo de fluorescentie verhoogt. Met r de straal van de gebleekte plek betekent dit dat de vergelijking alleen geldig is als de gebonden levensduur 1 / k off >> r 2 / D {\displaystyle 1/k_{text{off}}>>r^{2}/D}
   

   .

Als aan al deze aannames wordt voldaan, dan geeft het passen van een exponentiaal aan de herstelcurve de afnamesnelheidsconstante, koff. Andere dynamieken kunnen echter herstelcurven geven die lijken op exponentialen, dus het passen van een exponentiaal impliceert niet noodzakelijkerwijs dat herstel wordt gedomineerd door een eenvoudige bimoleculaire reactie. Een manier om onderscheid te maken tussen herstel met een snelheid die bepaald wordt door onbinding en herstel dat beperkt wordt door diffusie, is op te merken dat de herstelsnelheid voor onbindbaar-beperkte herstel onafhankelijk is van de grootte van het gebleekte gebied r, terwijl het schaalt als r – 2 {\displaystyle r^{-2}}

, voor diffusie-beperkte terugwinning. Als dus een klein en een groot gebied worden gebleekt en het herstel wordt beperkt door onbinding, dan zal de herstelsnelheid gelijk zijn voor de twee maten van het gebleekte gebied, terwijl als het herstel wordt beperkt door diffusie, het veel langzamer zal zijn voor het grotere gebleekte gebied.

Diffusie en reactieEdit

In het algemeen zal het herstel van fluorescentie niet worden gedomineerd door een eenvoudige isotrope diffusie, noch door een enkele eenvoudige ontbindingssnelheid. Er zal zowel diffusie als binding zijn, en de diffusieconstante kan inderdaad niet uniform zijn in de ruimte, en er kunnen meer dan één type bindingsplaatsen zijn, en deze plaatsen kunnen ook een niet-uniforme verdeling in de ruimte hebben. Ook stromingsprocessen kunnen een rol spelen. Dit complexere gedrag impliceert dat een model met verscheidene parameters vereist is om de gegevens te beschrijven; modellen met slechts één enkele diffusieconstante D of één enkele uitsnelheidsconstante, koff, zijn ontoereikend.

Er zijn modellen met zowel diffusie als reactie. Helaas kan een enkele FRAP-curve onvoldoende bewijs leveren om (mogelijk ruisende) experimentele gegevens betrouwbaar en eenduidig te passen. Sadegh Zadeh et al. hebben aangetoond dat FRAP-krommen kunnen worden ingepast door verschillende paren van waarden van de diffusieconstante en de aan-snelheidsconstante, of, met andere woorden, dat pasvormen voor de FRAP niet uniek zijn. Dit is in drie-parameter (on-rate constante, off-rate constante en diffusie constante) past. Pasvormen die niet uniek zijn, zijn in het algemeen niet bruikbaar.

Dus voor modellen met een aantal parameters kan één enkel FRAP-experiment onvoldoende zijn om alle modelparameters te schatten. Dan zijn meer gegevens nodig, b.v. door gebieden van verschillende grootte te bleken, sommige modelparameters onafhankelijk te bepalen, enz.