Bacteriële isolatie en RdFucI-identificatie

Een kolonie die uitgroeide in het medium met l-fucoidan afkomstig van Laminaria Japonica (Carbosynth, Compton, Berkshire, UK) als enige koolstofbron werd geïsoleerd uit een abalone darm geoogst in Zuid-Korea (Additional file 1: Fig. S1). Vergelijking van de sequentie-identiteit op basis van 16S ribosomaal RNA met de NCBI database toonde aan dat het isolaat fylogenetisch dicht bij de leden van het genus Raoultella stond (Additional file 1: Fig. S1). Daarom werd de geïsoleerde stam geïdentificeerd als Raoultella sp. KDH14. Na het uitvoeren van volledige genoomsequencing werd RdFucI geïdentificeerd van Raoultella sp. KDH14 op basis van gensequentie-identiteit.

RdFucI bestaat uit 595 aminozuren met een molecuulmassa van 65,5 kDa en een iso-elektrisch punt van 5,5. De resultaten van de basic local alignment search tool (BLAST) wezen op de hoge sequentie-identiteit van RdFucI (> 90%) met andere l-FucI’s van verschillende bacteriën die behoren tot de families Raoultella, Klebsiella, en Citrobacter.

De geïdentificeerde RdFucI werd overgeproduceerd in E. coli BL21(DE3) met de N-terminale hexa-histidine tag en gezuiverd met his-tag affiniteits-chromatografie. Bij analyse met natriumdodecylsulfaat-polyacrylamide gelelektroforese (SDS-PAGE) verscheen de enkele band rond 65 kDa, consistent met de berekende molecuulmassa van de monomeer-subeenheid.

RdFucI-gekatalyseerde reactie bevordert l-fucosevorming

Om de isomerase-activiteit van RdFucI te onderzoeken, werd de enzymreactie uitgevoerd met l-fucose of l-fuculose als substraat (Fig. 2). De enzymactiviteit voor voorwaartse (l-fucose naar l-fuculose) en omgekeerde (l-fuculose naar l-fucose) reacties werd bepaald. De productie van l-fuculose uit l-fucose werd bevestigd door dunne laag chromatografie (TLC) en gaschromatografie/massaspectrometrie analyse (GC/MS) (Additional file 2: Fig. S2). Bij de interconversie tussen l-fucose en l-fuculose werd geen nevenproduct waargenomen, wat betekent dat één substraat één product oplevert (Additional file 2: Fig. S2). We vinden het dus redelijk om de berekende hoeveelheid l-fuculoseconcentratie te gebruiken door de hoeveelheid l-fucose experimenteel te meten.

Enzymatische omzetting van a l-fucose naar l-fuculose (voorwaartse reactie) en b l-fuculose naar l-fucose (omgekeerde reactie) door RdFucI. De enzymatische reactie werd uitgevoerd door 3 µg RdFucI met hetzij a l-fucose of b l-fuculose bij 10 mM als uitgangssubstraat bij 30 °C gedurende 10 min in 20 mM natriumfosfaat (pH 7,0) in aanwezigheid van 1 mM Mn2+. De l-fucoseconcentratie werd experimenteel gemeten en de l-fuculoseconcentratie werd berekend door de experimenteel bepaalde l-fucoseconcentratie af te trekken van de totale suikerconcentratie (10 mM). Experimentele gegevens zijn gemiddelden ± standaardafwijkingen van drie replicaten

De omgekeerde reactie was 6,6 maal sneller dan de voorwaartse reactie, en de specifieke activiteit voor l-fuculose (63,9 U/mg) was hoger dan die voor l-fucose (9,6 U/mg). In beide reacties was de evenwichtsverhouding tussen l-fucose en l-fuculose, die experimenteel werd bepaald, ongeveer 9:1, waardoor de evenwichtsconstante (Keq) op 0,11 kwam. De waarde van Keq werd ook theoretisch bepaald op 0,23, gebaseerd op de thermodynamische relatie van de standaard Gibbs vrije energieverandering van de reactie en Keq bij evenwicht, (\mathop \Delta \limits_{r} G^{ \circ } = – RT\ln K_{text{eq}}), waarbij R en T respectievelijk de gasconstante (8,314 J/mol K) en de temperatuur (K) zijn. \) staat voor de standaard vrije energieverandering van Gibbs voor de reactie van l-fucose tot l-fuculose (0,859993 kcal/mol), die is opgenomen in de database BioCyc (https://biocyc.org). Er was enige discrepantie tussen de experimentele en theoretische waarden van Keq. Een Keq < 1 geeft aan dat de omgekeerde reactie wordt begunstigd. RdFucI-gekatalyseerde isomerisatie bevorderde de omgekeerde reactie, waarbij l-fucose uit l-fuculose werd geproduceerd met een opbrengst van ongeveer 90% bij 30 °C en pH 7.

Effect van temperatuur en pH op de activiteit van RdFucI en evenwicht

Enzymatische reacties werden uitgevoerd bij verschillende temperaturen variërend van 10 tot 80 °C en pH’s variërend van 4 tot 11 met l-fuculose als substraat (Fig. 3). De isomerisatie van l-fuculose naar l-fucose door RdFucI was sterk afhankelijk van de temperatuur, en maximale of bijna maximale activiteiten (> 80% van het maximum) werden vertoond bij temperaturen tussen 30 en 50 °C (Fig. 3a). Om het effect van de temperatuur op het evenwicht voor de isomerisatie van l-fucose naar l-fuculose te onderzoeken, werd de evenwichtsverhouding onderzocht bij 30, 40 en 50 °C, waarbij maximale of bijna maximale activiteiten (> 80% van het maximum) werden vertoond. Als resultaat was er geen significant verschil in evenwichtsverhouding tussen de drie temperaturen (l-fucose/l-fuculose = 9:1; p > 0.05). Met andere woorden, l-fucose werd gesynthetiseerd uit l-fuculose met een opbrengst van ongeveer 90% bij alle geteste temperaturen (Additional file 3: Fig. S3a).

Effect van a temperatuur en b pH op de relatieve activiteit van RdFucI tegen l-fuculose. Enzymatische reacties werden uitgevoerd a) bij verschillende temperaturen van 10 tot 80 °C en b) bij verschillende pH-waarden van 4 tot 11. De gebruikte buffers waren 50 mM2 (1,5 mg/l). De gebruikte buffers waren 50 mM natriumacetaat (pH 4, 5, en 6), 50 mM natriumfosfaat (pH 6, 7, en 8), 50 mM Tris-HCl (pH 7, 8, en 9), en 50 mM glycine-NaOH (9, 10, en 11). Experimentele gegevens vertegenwoordigen gemiddelden ± standaardafwijkingen van drie replicaten

Het effect van pH werd onderzocht. Hoge activiteiten van RdFucI (> 70% van het maximum) werden waargenomen bij alkalische en bijna neutrale pH’s (pH’s 9, 10 en 11 en pH’s 6, 7 en 8). Onder pH 6, de enzymactiviteit sterk afgenomen, met weinig activiteit waargenomen bij pH 4. Ondanks de hoge specifieke activiteiten bij alkalische omstandigheden, de l-fucose opbrengst bij evenwicht (60 min incubatie) was veel lager bij pH 10 (54%) dan bij pH 7 (88%) (Additional file 3: Fig. S3b). De relatieve activiteiten bij pH 7, 8, en 9 waren veel lager in Tris-HCl buffer dan de activiteiten in natriumacetaat of glycine-NaOH buffer, wat impliceert dat Tris de enzymatische activiteit van RdFucI sterk remt. De voorgaande enzymatische experimenten in deze studie zijn uitgevoerd in reactiemengsels met Tris van 1 mM, dat afkomstig was van de bufferwisselstap na de enzymzuivering. Om te onderzoeken of Tris in het reactiemengsel RdFucI kon remmen, werden de isomerisatie-activiteiten van de reacties die plaatsvonden in afwezigheid en aanwezigheid van 1 mM Tris vergeleken (Additional file 4: Fig. S4). Er was geen significant verschil in de enzymactiviteit van de twee reacties, wat aangeeft dat 1 mM Tris de activiteit van RdFucI niet remt.

Effect van metaalionen op de activiteit van RdFucI

Suikerisomerases, inclusief l-fucoseisomerases, hebben tweewaardige kationen nodig, zoals Mn2+ en Co2+, als cofactoren voor hun isomerisatie-activiteiten. Om het effect van tweewaardige kationen op de katalytische activiteit van RdFucI op l-fuculose te bestuderen, werd de enzymactiviteit getest in de afwezigheid en aanwezigheid van ofwel 1 mM van verschillende metaalionen of ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) (Tabel 1). Het natieve RdFucI-enzym dat niet aan metaalionen of EDTA werd blootgesteld vertoonde een lage activiteit, en metaalchelatie door EDTA verminderde de enzymactiviteit. Van de geteste metaalionen resulteerden Mn2+, Mg2+, Co2+, Cd2+, en Zn2+ in een duidelijke toename van de enzymactiviteit. In het bijzonder, de toevoeging van Mn2+ verhoogde de activiteit van RdFucI maximaal met ongeveer 7,4-voudig. Ca2+, Cu2+ en Fe3+ daarentegen remden de activiteit van RdFucI.

Substraatspecificiteit en kinetische parameters van RdFucI

In het algemeen vertonen suiker- en suikerfosfaatisomerasen een brede specificiteit voor diverse substraten. Om te beoordelen of ketose-favorerende activiteit van RdFucI getoond met l-fuculose ook duidelijk was met andere substraten, werd de substraatspecificiteit van RdFucI onderzocht tegen verschillende aldose suikers (l-fucose, d-arabinose, d-altrose, d-galactose, d-mannose, en d-glucose) en hun overeenkomstige ketose suikers (l-fuculose, d-ribulose, d-psicose, d-tagatose, en d-fructose) (Fig. 4). Van al deze substraten, inclusief aldose- en ketose-suikers, werden de hoogste activiteiten waargenomen met l-fuculose (115,3 U/mg) en d-ribulose (127,3 U/mg), die beide ketose-suikers zijn. De activiteiten van RdFucI voor l-fuculose en d-ribulose waren veel hoger dan die voor de andere substraten. Onder de aldose suikers was de activiteit voor l-fucose het hoogst (21,0 U/mg), terwijl de andere substraten specifieke activiteiten opleverden variërend van 4,7 tot 7,9 U/mg. Andere ketose-suikers dan l-fuculose en d-ribulose vertoonden specifieke activiteiten van 0,0 tot 10,8 U/mg. Aldus waren l-fuculose en d-ribulose de voorkeurssubstraten voor RdFucI en werd ketose-favorerende activiteit van RdFucI alleen aangetoond met l-fuculose en d-ribulose.

Substraatspecificiteit van RdFucI. Enzymreacties werden uitgevoerd tegen 10 mM van verschillende aldose- en ketose-substraten bij 40 °C en pH 10. Voor aldose-substraten werden l-fucose, d-arabinose, d-altrose, d-galactose, d-mannose en d-glucose gebruikt. Voor ketose-substraten werden l-fuculose, d-ribulose, d-psicose, d-tagatose en d-fructose gebruikt. Experimentele gegevens zijn gemiddelden ± standaardafwijkingen van drie replicaten

Kinetische parameters werden bepaald met l-fuculose en d-ribulose als de substraten (Additional file 5: tabel S1). De waarden van Km (Michaelis-constante) en kcat (omzettingsgetal van substraat) voor l-fuculose waren respectievelijk 1,9- en 1,2-maal lager dan die voor d-ribulose. De katalytische efficiëntie van RdFucI, weergegeven als kcat/Km, voor l-fuculose, was 1,5-voudig hoger dan die van d-ribulose, wat aangeeft dat l-fuculose de voorkeur heeft als substraat van RdFucI.

Overkoepelende kristalstructuur van RdFucI

Om de moleculaire functie beter te begrijpen, bepaalden we de kristalstructuur van RdFucI (Additional file 6: Tabel S2). De elektronendichtheidskaart van RdFucI was goed gedefinieerd vanaf de residuen Ser5-Arg591 voor zes subeenheden in de asymmetrische eenheid. De monomeer RdFucI bestaat uit 19 α-helixen en 23 β-strengen die de N1-, N2- en C-domeinen omvatten (Fig. 5a). Het N1-domein (Ser5-Met172) neemt een α/β-vorm aan en is betrokken bij de substraatherkenning van de hexamerische vorming van RdFucI. De N2 (Lys173-Leu352) en C (Thr353-Arg591) domeinen bevatten de metaalbindingsresiduen die betrokken zijn bij de katalytische activiteit (Fig. 5a). In de asymmetrische eenheid vormen RdFucI subeenheden de hexamerische formatie gerangschikt als een dimeer van trimeren met D3h pseudosymmetrie (Fig. 5b). Dit is consistent met het resultaat van analytische maatexclusiechromatografie waarin RdFucI in oplossing als homohexamer bleek te bestaan (Additional file 7: Fig. S5).

Overkoepelende structuur van RdFucI. a Schematische weergave van het RdFucI monomeer. Het RdFucI-monomeer bestaat uit N1- (geel), N2- (roze) en C-(groen) domeinen. b Oppervlakte-voorstelling van het RdFucI-hexamer. Subunit A, B, C, D, E, en F zijn respectievelijk geel, roze, cyaan, paars, groen, en oranje gekleurd. Een metaalbindingsplaats op een substraatbindingszak is aangegeven met een rode stip

In de hexamere formatie staat subeenheid A (totale oppervlakte: 23011.7 Å2) een wisselwerking met vier verschillende subeenheden B (residuen in het grensvlak: 47/oppervlak: 1909,6 Å2), C (58/1837,6 Å2), D (42/1482,9 Å2), en E (34/1086,2 Å2). Subunit A heeft geen interactie met de resterende subunit F (Fig. 5b). Subunit A van RdFucI heeft een totaal begraven oppervlak van 2569.1 Å2, wat 27.45% van het totale oppervlak vertegenwoordigt. Deze begraven interface wordt gestabiliseerd door interactie waarbij 59 waterstofbruggen en 26 zoutbruggen van andere subeenheden betrokken zijn (Additional file 8: Tabel S3, Additional file 9: Tabel S4, Additional file 10: Tabel S5, Additional file 11: Tabel S6).

Substraatbindingsplaats en actieve plaats van RdFucI

De substraatbindingszak wordt gevormd door de N2- en C-domeinen van subeenheid A en het N1-domein van subeenheid B (Fig. 6a-c) en heeft in totaal zes substraatbindingsplaatsen in het homohexamerische RdFucI. De ingang van de substraatbindingszak, waar het substraat nadert, is ongeveer 11 × 12,5 Å (fig. 6a). De substraatbindingszak, waar de metaalbindingsplaats wordt gevormd, heeft een negatief geladen oppervlak van ongeveer 4 × 5 Å (fig. 6b). De afstand tussen de metaalbindingsplaats en het oppervlak van de substraatbindingszak is ongeveer 16,7 Å (Fig. 6d), wat impliceert dat het actieve centrum diep in een zak ligt. Dit wijst erop dat zowel de open keten als de ringvorm van het substraat toegankelijk zijn voor het centrum van de actieve zone en dat, omgekeerd, een bulksaccharide niet toegankelijk zou zijn voor de actieve zone die zich in het binnenste van de substraatbindingszak bevindt.

Substraatbindingszak en actieve site van RdFucI. a De substraatbindingszak wordt gevormd door assemblage door de subeenheden A en C. b Elektrostatisch oppervlak van de substraatbindingszak. c Weergave van de B-factor van het substraatbindende oppervlak. d Doorsnede van het oppervlak van de substraatbindende zak. e De 2Fo-F elektronendichtheidskaart (grijs raster, gecontourd op 1,0 σ) op de metaalbindingsplaatsen van RdFucI gedrenkt in een oplossing die 10 mM Mn2+ bevat. f Geometrische analyse van de Mn2+ bindingsplaatsen van RdFucI

RdFucI vereist tweewaardige metaalionen voor zijn katalytische activiteit voor de isomerisatiereactie met behulp van het ene-diolmechanisme . De metaalbindingsplaats van RdFucI zou moeten worden gecoördineerd met Mn2+ door geconserveerde Glu337, Asp359, en His528 residuen (Additional file 12: Fig. S6). Er is echter geen Fo-Fc elektronendichtheidskaart (geteld bij > 5σ) waarvan vermoed wordt dat deze gebonden is aan Mn2+ als een essentieel metaal voor substraat binding (Additional file 13: Fig. S7a). Uit de B-factor analyse bleek dat de temperatuurfactor van Mn2+ (70,53 Å2) hoger is dan de gemiddelde temperatuurfactor van het eiwit (36.22 Å2), wat aangeeft dat Mn2+ aanwezig is op RdFucI met een lage bezettingsgraad. Deze bevinding was consistent met het resultaat van de biochemische analyse, waarbij het natieve enzym een lage activiteit vertoonde. Anderzijds verhoogde de toevoeging van Mn2+ de katalytische activiteit van RdFucI aanzienlijk (Tabel 1). Daarom speculeerden wij dat de toevoeging van Mn2+ aan het RdFucI-kristal de bindingsbezetting van Mn2+ zou verhogen. Na het weken van RdFucI kristallen in een oplossing van 10 mM Mn2+, werd een betrouwbare Fo-Fc elektronendichtheid (> 6σ) op de metaalbindingsplaats waargenomen waar de positie van Mn2+ werd opgehelderd in alle subeenheden (Fig. 6e en Additional file 13: Fig. S7b). Echter, de temperatuur B-factor van de Mn2 + (76,56 Å2) was hoger dan die van het hele eiwit (60,69 Å2), wat impliceert dat Mn2 + ion nog steeds niet volledig bezet is in de metaalbindingsplaats. Mn2+ werd gecoördineerd door OE1 (gemiddelde afstand: 2.62 Å) en OE2 (2.65 Å) atomen van Glu337, OD1 (2.72 Å) en OD2 (2.72 Å) atomen van Asp361, NE2 (2.52 Å) atoom van His528, en de water molecule (2.79 Å) (Fig. 6e). De gemiddelde bindingshoeken van Glu337(OE1)-Mn2+-Asp361(OD2), Glu337(OE1)-Mn2+-His528(NE2), en Asp361(OD1)-Mn2+-His528(NE2) waren respectievelijk 127.32°, 86.25°, en 73.96°. De bindingshoek tussen liganden en Mn2+ toonde een vervormde octahedrale coördinatie.

Structurele vergelijking met andere l-FucIs

De DALI server werd gebruikt om te zoeken naar structurele homologs. Uit deze zoekactie bleek dat RdFucI vergelijkbaar is met l-FucI’s van E. coli (EcFucI, PDB-code 1FUI, Z-score: 60.6, rmsd: 0.3 voor 587 Cαs atomen), Aeribacillus pallidus (ApFucI, 3A9R, Z-score: 56.6, rmsd: 0,7 voor 580 Cαs atomen), en Streptococcus pneumonia (SpFucI, 4C20, Z score: 55,9, rmsd: 0,7 voor 585 Cαs atomen). Superimpositie van de substraatbindingszak toonde aan dat de metaalbindende residuen Glu337, Asp361, en His528 (genummerd in RdFucI) positioneel identiek zijn aan de andere eiwitten, terwijl de substraatherkenningsresiduen (Arg16, W88, Gln300, Tyr437, Trp496, en Asn524) een licht conformatieverschil in hun zijketens vertonen (fig. 7a). In het bijzonder heeft de α7-α8 lus van elke l-FucI, die op het oppervlak van de substraatbindingszak ligt, een verschillende conformatie. Sequentiealignering van de l-FucI’s toonde een grote overeenkomst, maar de sequentie voor de α7-α8 lus van elke l-FucI was zeer variabel (fig. 7b). Aangezien de α7-α8-lus betrokken is bij de vorming van de architectuur van de substraatbindingszak, vormt elke l-FucI een unieke substraatbindingszak (fig. 7c). l-FucI’s hebben gewoonlijk een negatief geladen oppervlak rond de metaalbindingsplaats, maar het oppervlak van de substraatbindingszak vertoont verschillende ladingstoestanden (fig. 7c). Als gevolg hiervan zullen de structurele verschillen tussen de α7-α8-lus verschillen veroorzaken in de substraatspecificiteit van l-FucI’s.

Structurele vergelijking van RdFucI met andere l-FucI’s. Superpositie van a actief gebied en b substraatbindend oppervlak van RdFucI met EcFucI (PDB-code: 1FUI), ApFucI (3A9R) en SpFucI (4C20). Close-up view van het grote conformatieverschil van de α8-α9 lussen van l-FucI’s (links). c Gedeeltelijke sequentie alignment voor de α8-α9 lus regio voor RdFucI en EcFucI, ApFucI, en SpFucI. d Elektrostatische oppervlakte representatie van RdFucI, EcFucI, ApFucI, en SpFucI. De diepe substraatbindingszak en de α8-α9-lusgebieden zijn aangegeven met respectievelijk oranje en zwarte stippellijnen. Een metaalbindingsplaats is aangegeven met een gele asterisk