… (Zhang et al., 2009), veroorzaakte ernstige problemen voor de karakterisering van de Flv4 en Flv2 eiwitten. Eerst werd gespeculeerd dat een dergelijke membraanassociatie plaatsvindt via het Sll0218 eiwit, dat een integraal membraaneiwit is met vier voorspelde transmembraanhelften. Dit bleek echter niet het geval te zijn, aangezien Flv4 grotendeels in de membraanfractie bleef, zelfs in afwezigheid van het Sll0218 eiwit (de D fl v2 , D sll0218-19 , en D sll0218- 19/ fl ag – fl v4 mutanten) (data niet getoond). Bovendien is het Sll0218 eiwit geassocieerd met een groot membraan complex onafhankelijk van de Flv2/Flv4 heterodimer ( figuur 4). Ten slotte, door wijziging van de twee-fasen partitionering methode voor membraan subfractionering, werd het Sll0218 eiwit gelokaliseerd aan de thylakoïd membraan, terwijl Flv4 en Flv2 in dat systeem de neiging om te associëren met het plasmamembraan (figuur 2D). Deze laatste associatie bleek sterk kation afhankelijk te zijn (Figuren 2B en 2C). Een soortgelijk gedrag werd onlangs gerapporteerd voor een ander Synechocystis eiwit, hoewel het mechanisme voor de membraanassociatie onduidelijk is (Carmel et al., 2011). Gebaseerd op het Flv2/Flv4 heterodimeer model en de sequentie uitlijning, werden enkele vermoedelijke metaalbindingsplaatsen met His, Asp, en Glu residuen herkend op het eiwitoppervlak. Oppervlakte-gebonden metalen werden ook gevonden in homologe structuren. Zo heeft het fl avodoxine-achtige domein van Synechococcus sp (PDB ID: 3HLY) een Ca 2+ , en M. thermoacetica FprA (PDB ID: 1YCF, 1YCG, en 1YCH) heeft verschillende Zn 2+ gebonden aan het oppervlak (Silaghi-Dumitrescu et al., 2005). De metaalionen op de structuren zijn afkomstig van de kristallisatie-oplossing, maar sommige van de metaalbindende residuen zijn geconserveerd of gesubstitueerd door vergelijkbare residuen in ons model (zie Supplementele Tabel 2 online). Alles bij elkaar genomen, zouden deze residuen verantwoordelijk kunnen zijn voor de kation-afhankelijke associatie van Flv2 en Flv4 met de membraanfractie. Gebaseerd op analyse van de elektrostatische oppervlaktepotentiaal van het model, heeft het Flv4 monomeer een meer negatief geladen oppervlak (figuur 8B) en bevat het meer vermoedelijke metaalbindingsplaatsen op het oppervlak dan het Flv2 monomeer (zie supplementaire tabel 2 online). Rekening houdend met het feit dat de kation concentratie die in de isolatie buffer is veel hoger dan de echte fysiologische omstandigheden (Figuren 2B tot 2D), kan de binding van Flv2 / Flv4 aan het membraan in vivo van voorbijgaande aard en omkeerbaar zijn. Specifieke binding van Flv2/Flv4 aan plasmamembraan bij celbreuk (figuur 2D) kan ook betrekking hebben op de oppervlaktelading, aangezien het binnenoppervlak van het plasmamembraan negatiever is dan het rechtsdraaiende thylakoïd membraan (Barber, 1982; Körner et al., 1985). De oppervlaktelading van het thylakoïd membraan kan echter drastisch veranderen tijdens de fotosynthese, wat de transit binding van Flv2/Flv4 ook met het thylakoïd membraan kan mediëren. Het Sll0218 eiwit werd ondubbelzinnig gelokaliseerd in een complex met hoge moleculaire massa in het thylakoïd membraan. Het vreemde gedrag van het Sll0218 eiwit in het conventionele twee-fasen partitioneringssysteem van de membraan subfracties suggereerde echter dat het Sll0218 eiwit niet gelijkmatig verdeeld is in het thylakoïde membraan. Het is geassocieerd met een groot complex, dat slechts marginaal kleiner is dan het grote PSII dimeer. De afname van de verhouding tussen PSII dimeer en PSII monomeer complexen gebeurt enkel in de mutanten die het Sll0218 eiwit missen ( D sll0218-19 en D fl v4 ), maar niet in D fl v2 (Figuur 5, Tabel 1). Daarom postuleren wij dat Sll0218 kan fungeren als chaperon in de stabilisatie van het PSII dimeer dat geassembleerd wordt onder omstandigheden van lucht CO 2 gehalte. Hoewel het PSII-complex zowel in monomere als in dimere vorm werd geïsoleerd (Rögner et al., 1987; Hankamer et al., 1997; Adachi et al., 2009), wordt algemeen aangenomen dat het PSII-complex in vivo zowel in cyanobacteriën als in hogere planten als een dimeer functioneert (Hankamer et al, 1999; Kuhl et al., 2000), terwijl het monomere PSII een tussenproduct kan zijn van de normale assemblage en reparatie van PSII (Aro et al., 2005; Nixon et al., 2010). Hoewel de in vivo dimerisatie van PSII in cyanobacteriën in twijfel is getrokken door het gebruik van detergenten voor solubilisatie en in vitro analyse van de thylakoïde complexen (Takahashi et al., 2009; Watanabe et al., 2009), is er overtuigend bewijs voor dimeervorming door mutante benaderingen. Inderdaad, kleine PSII sub-eenheden PsbM en PsbT, gelegen in monomeer-monomeer interface, zijn cruciaal gebleken voor de juiste assemblage en reparatie van PSII (Ohnishi en Takahashi, 2001; Iwai et al., 2004; Bentley et al., 2008). Aangezien het Sll0218 eiwit enkel tot expressie komt onder lage (d.w.z. luchtniveau) CO 2 condities, stellen we dat de assemblage van PSII dimers verschilt naargelang de aan- of afwezigheid van de Sll0218 eiwitten (zie verder). Optimalisatie van de fotosynthese vereist een strikte regeling tussen absorptie en omzetting van zonne-energie in chemische energie en het gebruik ervan door de metabole routes stroomafwaarts. Voor aquatische foto-autotrofen, zoals cyanobacteriën, is CO 2 een essentieel maar vaak arm substraat. In natuurlijke omgevingen leidt een onvoldoende beschikbaarheid van CO 2 , vooral in combinatie met een hoge instraling, tot een hoge excitatiedruk op de fotosystemen (Huner, 1998) en een beperking van de fotosynthesesnelheid. Om hieraan het hoofd te bieden, worden in cyanobacteriën bij lage Ci verschillende CO 2 -concentratiemechanismen sterk geïnduceerd om de CO 2 -concentratie rond ribulose-1,5-bis-fosfaat carboxylase/oxygenase te verhogen en tegelijk de cyclische elektronengolf te induceren om meer ATP te genereren (besproken in Kaplan en Reinhold, 1999; Giordano et al., 2005; Badger et al., 2006; Price et al., 2008). Microarray en proteomische studies hebben een laag-CO 2 stimulon aangetoond (Wang et al., 2004; Eisenhut et al., 2007; Battchikova et al., 2010), dat ook het operon sll0217-19 ( fl v4- fl v2 ) omvat, dat even sterk gereguleerd wordt als de induceerbare CO 2 concentrerende mechanisme genen. De fl v2- en fl v4-genen hebben ook een hoge lichtrespons (Hihara et al., 2001; Zhang et al., 2009). De fl v4 en fl v2 inactiveringsmutanten vertoonden een hoge gevoeligheid voor fotoinhibitie van PSII onder luchtniveau CO 2 omstandigheden (Zhang et al., 2009). Bovendien toonden onze recente studies naar de expressie van het operon een strakke regulatie van dit operon fl v4- fl v2 door kleine regulerende RNA’s aan (M. Eisenhut, J. Georg, S. Klähn, I. Sakurai, H. Silén, P. Zhang, W.R. Hess, en E.-M. Aro, ongepubliceerde gegevens). Dergelijke sterke inductie en regulatie door antisense RNA’s van het fl v4- fl v2 operon samen met de waargenomen bescherming van PSII onder luchtniveau van CO en hoge …