In het afgelopen decennium hebben chemogenetische en optogenetische technieken een revolutie teweeggebracht in de integratieve neurowetenschap door nieuwe hulpmiddelen te bieden om de activiteit van specifieke populaties of neurotransmittersystemen omkeerbaar te manipuleren met een grotere selectiviteit (Sternson en Roth, 2014; Roth, 2016; Wiegert et al., 2017). Vergeleken met optogenetica, die snelle en fasische neuronale modulatie met een hoge temporele resolutie mogelijk maken, maken chemogenetica een meer uitgebreide modulatie van systemen mogelijk, wat vooral nuttig is voor studies die zich richten op tonische verschijnselen (bijv. onderzoek naar de implicatie van dopamine in motivationele processen; Whissell et al., 2016). Onder de chemogenetische hulpmiddelen worden designer receptoren exclusief geactiveerd door designer drugs (DREADDs) veel gebruikt en worden aangeduid als een biologisch “lock-and-key” systeem voor selectieve manipulatie van celactiviteit via G-eiwit signaleringswegen. Voor het eerst op zeer elegante wijze ontwikkeld door de groep van Roth (Armbruster et al., 2007), is deze G-eiwitgekoppelde receptor (GPCR) een muscarine-receptor: het slot, dat werd gemuteerd om alleen te reageren op clozapine-N-oxide (CNO), de sleutel, een afgeleide metaboliet van het atypische antipsychoticum clozapine, anders met, potentieel, geen farmacologische activiteit.

Sinds 2016 hebben sommige publicaties echter verontrustende kwesties opgeworpen met betrekking tot het gebruik van CNO. Ten eerste kunnen relatief hoge doses CNO (10 mg/kg) die systemisch worden toegediend farmacologische off-target-activiteit hebben, zoals blijkt uit de inductie van gedragseffecten bij ratten en muizen die niet worden gemedieerd door DREADD’s (MacLaren et al., 2016; Gomez et al., 2017; Baerentzen et al., 2019). Bovendien toonden Gomez et al. (2017) aan dat CNO niet gemakkelijk de bloed-hersenbarrière passeert, mogelijk een lage DREADD-bindingsaffiniteit vertoont, en werd teruggemetaboliseerd tot clozapine, waardoor het de echte effector van de DREADD’s werd. Gebaseerd op deze opvallende observaties, stelden zij het directe gebruik voor van lage doses clozapine (0.1 mg/kg) om DREADDs te activeren in plaats van CNO. Het gebruik van lage doses clozapine in plaats van grote doses CNO die geleidelijk worden omgezet in clozapine leidt echter tot twee belangrijke beperkingen. Ten eerste is het niet duidelijk dat clozapine, bij acute injectie of langdurige diffusie, op dezelfde manier op DREADDs inwerkt (Mahler en Aston-Jones, 2018). Ten tweede, aangezien clozapine een atypisch antipsychoticum is, heeft het tal van endogene doelwitten, zoals serotoninerge, muscarine- of dopaminerge receptoren, met relatief sterke affiniteiten (Meltzer, 1989; Schotte et al., 1993; Brunello et al., 1995; Ashby en Wang, 1996; Armbruster et al., 2007) en zijn er waarschijnlijk off-target effecten te induceren, zelfs met lage doses. Inderdaad, de 0,1 mg / kg dosis clozapine aanbevolen voor DREADD experimenten is gevonden om angst-gerelateerd gedrag aanzienlijk te verhogen bij muizen (Manzaneque et al., 2002), evenals bij ratten (een effect dat we ook waargenomen hebben; R. Goutaudier en S. Carnicella, ongepubliceerde waarnemingen), waar clozapine ook de voortbeweging beïnvloedt door mogelijke sedatie en cognitieve flexibiliteit aantast (Ilg et al, 2018).

Hoewel het optreden van deze effecten kan afhangen van de gebruikte soort, stam of geslacht, en zeer discreet kan zijn (omdat niet alle gedragsdimensies worden beïnvloed); ze hebben het potentieel om de prestaties van dieren in een verscheidenheid van gedragstaken aanzienlijk te verstoren. Hoge stress en angst kunnen bijvoorbeeld verstorende factoren zijn in geheugen- of pijnstudies (Sousa et al., 2006; Sorge et al., 2014). Bovendien kan gedrag gerelateerd aan drugsgebruik of psychiatrische stoornissen zoals schizofrenie, angst of cognitieve flexibiliteit het hele fenotype wijzigen (Floresco et al., 2009; Koob en Schulkin, 2018). Op basis van deze waarnemingen zijn belangrijke voorzorgsmaatregelen nodig met clozapine om vertekende gedragsstudies te voorkomen.

Zou een nieuwe molecule die specifiek is ontworpen voor DREADDs selectiever zijn? Compound 21 (C21) is een synthetisch DREADD-ligand, ontwikkeld in 2015 (Chen et al., 2015) en gedeeltelijk gekarakteriseerd in zowel vitro als in vivo in 2018 (Thompson et al., 2018). Opnieuw werd beschreven dat het bij lage doses (<3 mg/kg) verstoken was van gedragsmatige off-target effecten en in staat was om het gedrag van DREADD-expressieve dieren te veranderen. Deze studie werd versterkt door Jendryka et al. (2019), die farmacokinetische en farmacodynamische experimenten uitvoerden met muizen en C21 (3 mg/kg). Zij toonden aan dat 30 min na toediening van C21 de concentratie van het molecuul in de CSF >10 keer hoger was dan de geschatte EC50 voor DREADD-activering (CSF = 40 nm en EC50DREADDs = 3 nm), en zonder back-metabolisatie tot clozapine. De resultaten van een recente BioRxiv preprint studie bij ratten, muizen en makaken (Bonaventura et al., 2018) suggereren echter dat, hoewel C21 een lage penetrantie in de hersenen vertoont, een dosis van 1 mg/kg de hersenfunctie al kan wijzigen in wild-type muizen. Bovendien werd een zwakke affiniteit en bezetting voor DREADD’s waargenomen in vitro in rattenhersenschijfjes, evenals in vivo bij muizen en makaken in een positronemissietomografiestudie. Op basis van hetzelfde experimentele onderzoek als voor C21 stelden zij als alternatief twee andere liganden voor, JHU37152 en JHU37160, die een hogere in vivo potentie bezitten voor DREADD’s en mogelijk minder off-target effecten (Bonaventura et al., 2018). Hoewel deze nieuwe generatie DREADD-liganden veelbelovend lijkt, zijn ze vanwege hun nieuwheid nog steeds slecht gekarakteriseerd en blijven ze structureel homoloog aan clozapine en CNO. Uitputtende karakterisering in cellulair tot gedragsonderzoek zal daarom van cruciaal belang zijn om de potentiële valkuilen die voor CNO zijn gevonden uit te sluiten.

Een alternatieve oplossing voor het verbeteren van de selectiviteit van chemogenetische benaderingen zou zijn om een andere slot-sleutel combinatie te gebruiken. Als zodanig is de κ-opioïde receptor-DREADD (KORD) een gemuteerde remmende GPCR afgeleid van de menselijke κ-opioïde receptor (Vardy et al., 2015). In vergelijking met klassieke DREADD’s die clozapine, CNO, C21, of JHU verbindingen binden, wordt KORD ingeschakeld door salvinorine B, een drug-achtige metaboliet van de KOR-selectieve agonist salvinorine A. Hoewel deze chemogenetische benadering elegant werd gebruikt in combinatie met een activerende DREADD om een “AAN en UIT” systeem te creëren binnen dezelfde neuronale populatie (Vardy et al, 2015, Aldrin-Kirk et al., 2016), blijft het marginaal gebruikt omdat het de neuronale activiteit slechts over een korte periode vermindert (Aldrin-Kirk en Björklund, 2019). Daarnaast vertoont salvinorine B enige affiniteit voor endogene KOR bij hoge concentraties en heeft het nog niet geprofiteerd van diepgaande karakterisering zoals die momenteel wordt uitgevoerd voor DREADD-gerelateerde verbindingen (Roth, 2016). Het vervangen van de GPCR door een gemuteerd ionkanaal, een andere alternatief ontworpen receptor genaamd ligand-gated ion channels (LGICs) is een optie ontwikkeld door het Stenson laboratorium (Magnus et al., 2011). Vergeleken met DREADD’s combineren LGIC’s het ligandbindende domein van een gemuteerde nicotinereceptor met het ionenporie-domein van een andere gekozen receptor om een chimeer ionkanaal te creëren. Net als bij DREADDs wordt dit hybride kanaal geactiveerd door een kleine agonist die is afgeleid van quinuclidinylbenzamide, een agonist van de α7 nicotine-acetylcholinereceptor, en maakt het ionenuitwisseling over het neuronale membraan mogelijk. Naast andere beperkingen die specifiek zijn voor deze benadering (Aldrin-Kirk en Björklund, 2019), deelt zij met DREADD’s ook het gebruik van een farmacologisch ligand dat mogelijk kan interageren met endogene receptoren, afhankelijk van de experimentele omstandigheden. Ten slotte zijn al deze sloten afkomstig van endogene receptoren en ontdoen ze zich als zodanig niet van de beperkingen die intrinsiek verbonden zijn aan de farmacologie.

Naast deze recente ontwikkelingen en de vragen die blijven, moet een cruciale vraag worden gesteld: zal er ooit een volledig selectieve en inerte sleutel worden gevonden? Waarschijnlijk niet. Het is van essentieel belang voor ogen te houden dat DREADDs chemogenetische hulpmiddelen zijn die genetica en farmacologie combineren. Hoewel genetische benaderingen een krachtige controle bieden op de expressie van de “locks” (d.w.z. DREADD’s) in specifieke celpopulaties, of subpopulaties met voorwaardelijke benaderingen, zijn zij afkomstig van endogene GPCR’s en als zodanig onderworpen aan dezelfde beperkingen als de klassieke farmacologie voor de “key”. Het is derhalve onwaarschijnlijk dat moleculen zullen worden gevonden die een hoge bindingsaffiniteit voor DREADDs vertonen zonder affiniteit voor sommige van de talrijke receptoren die reeds in de hersenen aanwezig zijn en nauw verwant zijn met DREADDs. Zo heeft clozapine een zeer hoge affiniteit voor DREADDs, maar ook voor de serotoninerge receptor 5-HT2 (Ki = 10-8 voor beide; Armbruster et al., 2007; Gomez et al., 2017), en een hoge affiniteit voor een breed scala van andere GPCRs (Ki = 10-7 tot 10-6; Armbruster et al., 2007). Zelfs synthetische liganden die specifiek voor deze chemogenetische techniek zijn ontworpen, vertonen aanzienlijke affiniteiten voor endogene receptoren. Bijvoorbeeld, hoewel JHU37152 en JHU37160 een lagere affiniteit hebben voor 5-HT-receptoren dan clozapine, hebben ze een algemeen vergelijkbaar doelprofiel als dit geneesmiddel, met een nog hogere affiniteit voor de muscarine-receptoren (Bonaventura et al., 2018), wat mogelijk sterkere off-target-effecten suggereert. C21 vertoont ook een hogere affiniteit voor de histaminerge H1-receptor dan voor DREADD’s (Ki > 10-8 en Ki = 10-7,2, respectievelijk; Thompson et al., 2018) en een groter bindingspotentieel voor opioïde receptoren dan clozapine (Bonaventura et al., 2018). Om de valkuilen van deze krachtige aanpak te minimaliseren, ongeacht de sleutelkeuze, moeten kritische voorzorgsmaatregelen worden genomen (Fig. 1).

Vóór elk gedragsexperiment moeten eerst de experimentele omstandigheden worden getest om het beste ligand en de optimale dosis of doses te vinden, afhankelijk van de experimentele aanpak. DREADD’s moeten niet worden beschouwd als een kant-en-klaar hulpmiddel; cellulaire, neurochemische of elektrofysiologische experimenten moeten worden uitgevoerd vóór de gedragsstudie (Mahler et al., 2014; Beloate et al., 2016; Boekhoudt et al., 2016) om de werkzaamheid van het ligand bij de gekozen dosis in het systeem van belang te bevestigen. Bovendien moeten ook DREADD-loze controledieren worden opgenomen om de afwezigheid van aspecifieke neurobiologische effecten van het ligand of de receptor per se te verifiëren die mogelijk door een neurotransmitter worden geactiveerd of een constitutieve activiteit hebben (Saloman et al., 2016).

Tweede moeten, indien mogelijk, twee verschillende DREADD-liganden worden getest om te bevestigen dat de waargenomen gedragseffecten specifiek DREADD-gemedieerd zijn. De specifieke farmacologische acties op DREADDs zouden vergelijkbaar zijn, maar off-target effecten kunnen verschillen.

Ten derde, en het meest kritische punt, moeten conventionele farmacologische controles worden gebruikt. Dezelfde filosofie als in de farmacologie moet worden toegepast, en net als bij neurobiologische experimenten moeten groepen transgene dieren zonder expressie van DREADD’s (bijvoorbeeld DREADD’s lege virale vectoren) worden geïntegreerd om de selectieve effecten van het ligand en de gekozen dosis te verifiëren (Smith et al., 2016, Campbell en Marchant, 2018; Mahler en Aston-Jones, 2018; voor een voorbeeld van experimentele studies volgens dit ontwerp, zie ook Xia et al., 2017; Cope et al., 2019). Deze verklaring lijkt misschien triviaal, maar het streven naar een absoluut selectief ligand en de aantrekkelijkheid van deze aanpak hebben al geleid tot enkele overmoedige gedragsstudies, soms uitgevoerd in de volledige afwezigheid van deze controle.

In conclusie, DREADDs bieden een nauwkeurige manier om neurale circuits en gedrag te manipuleren, en veroorloven een geweldig alternatief voor optogenetica om tonisch een specifieke cellulaire subpopulatie te manipuleren, waardoor spannende nieuwe wegen van onderzoek worden geopend. Echter, net zoals thermische eigenschappen van licht in optogenetica kunnen leiden tot aspecifieke effecten (zie ook Owen et al., 2019), is meer voorzichtigheid nodig met chemogenetica, en standaard controles moeten verplicht zijn. De beperkingen van DREADD moeten worden erkend en er moet tijd worden genomen om mogelijke off-target effecten te vermijden of te controleren en om na te gaan of deze aanpak niet per se bias induceert. Door gebruik te maken van de sterke punten van de genetica en tegelijkertijd aandacht te schenken aan de zwakke punten van de farmacologie kan het potentieel van deze aanpak worden gemaximaliseerd.