Plasmid construction

Elke chimere anti-HA scFv getest in deze studie werd geconstrueerd door enting van zes CDR lussen van een anti-HA antilichaam 12CA5 op elke geselecteerde scFv scaffold. Het plasmide werd in twee stappen gemaakt: (1) een CDR-loop geënte scFv gblock en een H4K20me1 mintbody 15F11 vector38 gelineariseerd door EcoRI restrictieplaatsen werden geligeerd via Gibson assemblage (Huis bereidde master mix); (2) de linker die de scFv en EGFP verbindt, evenals EGFP, werd vervangen door een gblock coderend voor een flexibele (G4S) × 5 linker en de mEGFP door Gibson assemblage via NotI restrictieplaatsen. Voor de andere vier chimere scFv plasmiden, werd elke CDR-loop geënte scFv gblock geligeerd in de 15{\mathrm{{F}}11}^{\mathrm{HA}}}}}} vector gelineariseerd door EcoRI restrictie plaatsen via Gibson montage.

De doelplasmide 1 × HA-mCh-H2B werd geconstrueerd door het vervangen van de sfGFP van een Addgene plasmide sfGFP-H2B (Plasmid # 56367) met een 1 × HA epitoop gemerkt mCherry gblock waarin een NotI restrictie site werd ingevoegd tussen de 1 × HA epitoop en de mCherry voor de volgende klonering. De 4 × HA-mCh-H2B werd geconstrueerd door het vervangen van de 1 × HA-tag van de 1 × HA-mCh-H2B construct met een 4 × HA-epitoop gblock door AgeI en NotI restrictieplaatsen. De 10 × HA-mCh-H2B (smHA-mCh-H2B) werd geconstrueerd door vervanging van de 1 × HA-tag van de 1 × HA-mCh-H2B constructie met de smHA geamplificeerd uit een Addgene plasmide smHA-KDM5B-MS2 (Plasmide # 81085) met behulp van primers NZ-098 en 099 (Alle primer sequenties zijn opgenomen in de aanvullende tabel 1). De smHA-H2B werd gebouwd door het vervangen van de 1 × HA-mCh van de 1 × HA-mCh-H2B construct met smHA geamplificeerd uit het plasmide smHA-KDM5B-MS2 met behulp van primers NZ-098 en 100.

Another doel plasmide 4 × HA-mCh-β-actine werd gebouwd door het vervangen van de H2B van de 4 × HA-mCh-H2B met een β-actine amplicon via BglII en BamHI restrictie plaatsen. Het β-actine-amplicon werd geamplificeerd uit een Addgene-plasmide smFlag-ActinB-MS2 (Plasmid # 81083) met behulp van de primers NZ-073 en NZ-074.

De 4 × HA-mRuby-Kv2.1 plasmide werd gegenereerd door eerst amplificatie van de 4 × HA-tag van 4 × HA-mCh-H2B met behulp van de primers NZ-105 en 106. Vervolgens werd het 4 × HA-amplicon geïntroduceerd in een gepubliceerd plasmide pCMV-mRuby2-Kv2.161 (een gift van Dr. Michael Tamkun), dat was gelineariseerd door een restrictie digestie met AgeI, met behulp van Gibson montage. De smHA-Kv2.1 plasmide werd gegenereerd door PCR amplificatie van de rat Kv2.1 coderende sequentie van pBK-Kv2.140 en daaropvolgende ligatie in AsiSI en PmeI restrictie sites op het plasmide smHA-KDM5B-MS2 met primers Kv2.1-1 en 2.

De H2B-mCh-1 × HA werd gebouwd door twee stappen: (1) Vervang de 1 × HA-tag van de 1 × HA-mCh-H2B met H2B door AgeI en NotI sites, waarin de H2B werd geamplificeerd uit 1 × HA-mCh-H2B met behulp van de primers NZ-092 en 093; (2) Vervang de H2B op de C-terminus van mCherry met een 1 × HA-tag door BglII en BamHI sites, waarin de 1 × HA-tag werd gesynthetiseerd door overlappende PCR met primers NZ-094 en 095. De Mito-mCh-1 × HA werd geconstrueerd door vervanging van de H2B in H2B-mCh-1 × HA met Mito gblock23 door AgeI en NotI sites. De Mito-mCh-smHA werd geconstrueerd door vervanging van de 1 × HA-tag van Mito-mCh-1 × HA met smHA geamplificeerd uit de smHA-KDM5B-MS2 met behulp van de primers NZ-096 en 097. De mCh-H2B werd gegenereerd door het vervangen van de sfGFP van het plasmide sfGFP-H2B met een mCherry gblock met behulp van Gibson montage.

De plasmiden FB-mCh, FB-Halo, FB-SNAP werden gebouwd door de mEGFP van het plasmide sfGFP te vervangen door respectievelijk mCherry, HaloTag, en SNAP-tag gblocks.

pET23b-FB-GFP, de plasmide voor recombinant frankenbody expressie en zuivering, was Gibson geassembleerd met een FB-GFP amplicon en een gepubliceerde plasmide pET23b-Sso7d62,63 gelineariseerd door NdeI en NotI restrictie plaatsen. Het FB-GFP-amplicon werd geamplificeerd uit ^{15{{F}}11}^{HA}}}}}} door PCR met primers NZ-075 en 077.

Voor de translatieproef werden het reporterconstruct smHA-KDM5B-MS2 en SunTag-kif18b verkregen van Addgene (Plasmid # 81085 en # 74928), en het SunTag scFv plasmide (Plasmid # 60907) werd gewijzigd door het HA-epitoop dat in de linker gecodeerd is, te verwijderen. De HA-epitoop werd verwijderd door gerichte mutagenese met QuikChange Lightning (Agilent Technologies) volgens de instructies van de fabrikant met gebruikmaking van de primers HAout-1 en 2.

De g-blokken werden gesynthetiseerd door Integrated DNA Technologies en de recombinante plasmiden werden op volgorde geverifieerd door Quintara Biosciences. De sequenties van primers zijn weergegeven in aanvullende tabel 1. Alle plasmiden gebruikt voor de beeldvorming vertaling werden bereid door NucleoBond Xtra Midi EF kit (Macherey-Nagel) met een eindconcentratie ongeveer 1 mg mL-1.

U2OS celkweek

U2OS cellen (ATCC HTB-96) werden gekweekt in een incubator bij 37 ° C, bevochtigd, met 5% CO2 in DMEM medium (Thermo Scientific), aangevuld met 10% (v / v) foetaal runderserum (Altas Biologicals), 1 mM l-glutamine (Gibco) en 1% (v / v) penicilline-streptomycine (Gibco of Invitrogen).

Transfectie en kraal laden

Voor het bijhouden van eiwit lokalisatie, werden cellen uitgezet in een 35 mm MatTek kamer (MatTek) 2 dagen voor de beeldvorming en werden getransfecteerd met LipofectamineTM LTX reagens met PLUS reagens (Invitrogen) volgens de instructie van de fabrikant 18-24 uur voor de beeldvorming.

Voor beeldvorming vertaling met mRNA gelabeld door MCP-Halo eiwit, werden cellen uitgezet in een 35 mm MatTek kamer (MatTek) de dag voor de beeldvorming. Op de dag van beeldvorming, voor kraal laden, werd het medium in de MatTek kamer veranderd in Opti-MEM (Thermo Scientific) met 10% foetaal runderserum. Een mengsel van plasmiden (smHA-KDM5B-MS2/FB) en gezuiverd MCP-HaloTag eiwit17 werden kraal geladen zoals eerder beschreven 6,17,26. Kort gezegd, na het verwijderen van de Opti-medium uit de MatTek kamer, 4 µL van een mengsel van plasmiden (1 µg elk) en MCP-HaloTag (130 ng) in PBS werd gepipetteerd op de top van de cellen en ~ 106 µm glazen kralen (Sigma Aldrich) werden gelijkmatig verdelen over de top. De kamer werd vervolgens zeven keer stevig aangetikt, en Opti-medium werd weer toegevoegd aan de cellen. 3 h na kraal laden, werden de cellen gekleurd in 1 mL van 0,2 nM van JF646-HaloTag ligand48 verdund in fenol-rood-vrij complete DMEM. Na een 20 min incubatie werden de cellen driemaal gewassen in fenol-rood-vrij compleet DMEM om glasparels en unliganded kleurstoffen te verwijderen. De cellen waren vervolgens klaar voor imaging.

Voor imaging vertaling zonder mRNA labeling, werden de cellen uitgezet op MatTek kamer transient getransfecteerd met de plasmiden nodig, smHA-KDM5B-MS2/FB met of zonder SunTag-kif18b/Sun (met de HA epitoop verwijderd), met behulp van LipofectamineTM LTX reagens met de PLUS-reagens (Invitrogen) volgens de instructies van de fabrikant op de dag van beeldvorming. 3 uur na transfectie, werd het medium veranderd in fenol-rood-vrije volledige DMEM. De cellen waren vervolgens klaar voor imaging.

Purificatie van FB-GFP

E. coli BL21 (DE3) pLysS cellen getransformeerd met pET23b-FB-GFP werden gekweekt bij 37 ° C tot een dichtheid van OD600 0,6 in 2xYT medium dat Ampicilline (100 mg L-1) en Chlooramfenicol (25 mg L-1) onder schudden. Isopropyl-β-d-thiogalactoside (IPTG) werd toegevoegd om eiwitexpressie te induceren in een eindconcentratie van 0,4 mM, en de temperatuur werd verlaagd tot 18 °C. De cellen werden na 16 uur geoogst door centrifugatie en geresuspendeerd in PBS-buffer, aangevuld met 300 mM NaCl, proteaseremmers (ThermoFisher), 0,2 mM AEBSF (20 mL L-1 cultuur) en gelyseerd door sonicatie. Het lysaat werd geklaard door centrifugering. Het supernatant werd in twee gekoppelde HisTrap HP-kolommen van 5 ml (GE Healthcare) geladen, gewassen en geëlueerd met een lineaire gradiënt van 0-500 mM imidazool. De fracties die de POI werden samengevoegd, geconcentreerd met Amicon Ultra-15 30 kDa MWCO centrifugale filtereenheid (EMD Millipore) en geladen op een grootte-exclusie HiLoad Superdex 200 PG kolom (GE healthcare) in HEPES-gebaseerde buffer (25 mM HEPES pH 7,9, 12,5 mM MgCl2, 100 mM KCl, 0,1 mM EDTA, 0,01% NP40, 10% glycerol, en 1 mM DTT). De fracties die FB-GFP eiwit werden verzameld, geconcentreerd en opgeslagen bij -80 ° C na flash bevriezing door vloeibare stikstof.

Immunostaining

U2OS-cellen werden transient getransfecteerd met 4 × HA-mCh-H2B of 4 × HA-mCh-β-actine met LipofectamineTM LTX reagens met de PLUS-reagens (Invitrogen). 26 h na transfectie, werden de cellen gefixeerd met 4% paraformaldehyde (Electron Microscopy Sciences) gedurende 10 min bij kamertemperatuur, permeabilized in 1% Triton 100 in PBS, pH 7,4 gedurende 20 min, geblokkeerd in Blocking One-P (Nacalai Tesque) gedurende 20 min, en gekleurd bij 4 ° C gedurende de nacht met gezuiverd FB-GFP eiwit (0,5 µg mL-1 in 10% blokkerende buffer). De volgende ochtend werden de cellen gewassen met PBS, en de POI werd afgebeeld door een Olympus IX81 spinnen schijf confocale (CSU22 hoofd) microscoop met een × 100 olie-immersie objectief (NA 1,40) onder de volgende omstandigheden: 488 nm (0,77 mW; gemeten aan de achterkant brandpuntsvlak van het objectief; hierin alle laservermogen metingen komen overeen met de achterkant brandpuntsvlak van het objectief) en 561 nm (0,42 mW) sequentiële beeldvorming voor 50-time punten zonder vertraging, 2 × 2 spin tarief, 100 ms belichtingstijd. Beelden werden verkregen met een Photometrics Cascade II CCD camera met behulp van SlideBook software (Intelligent Imaging Innovations). De immunokleuring beelden werden gegenereerd door het gemiddelde van 50-tijd-punt beelden voor elk kanaal door Fiji64.

Western blots

U2OS cellen werden getransfecteerd met 4 × HA-mCh-H2B of 4 × HA-mCh-β-actine met LipofectamineTM LTX reagens met de PLUS reagens. 10 uur na de transfectie werden de cellen geoogst en gelyseerd in 120 µL RIPA-buffer met cOmplete Protease Inhibitor (Roche). 6,5 µL van elk cellysaat werd geladen op een NuPAGETM 4-12% Bis-Tris eiwitgel (Invitrogen) en gedurende 60 min. bij 100 V en 25 min. bij 200 V uitgevoerd. Eiwitten werden overgebracht naar een PVDF-membraan (Invitrogen), geblokkeerd in blocking buffer (5% melkpoeder in 0,05% TBS-Tween 20) gedurende 1 uur, en gekleurd ’s nachts met ofwel gezuiverd FB-GFP eiwit (0,5 µg mL-1 in blocking buffer) of anti-HA ouderlijk antilichaam 12CA5 (Sigma-Aldrich Cat # 11583816001; 2000-voudige verdunning met een eindconcentratie 0,5 µg mL-1 in blocking buffer). Voor het primaire antilichaam 12CA5 werd een extra incubatie gedurende 1 uur met anti-muis antilichaam/Alexa488 (Thermo Fisher Cat #A11001; 5000-voudige verdunning in blokkeerbuffer) uitgevoerd. De POI werd gedetecteerd uit de GFP fluorescentie voor FB-GFP of Alexa 488 voor anti-HA antilichaam met behulp van een Typhoon FLA 9500 (GE Healthcare Life Sciences) met de volgende voorwaarden: excitatie golflengte 473 nm, LPB filter (≥510 nm), 300 V fotomultiplicatorbuis en 10 µm pixelgrootte. De uncropped en onbewerkte western blots worden geleverd in aanvullende Fig. 3.

Fluorescentie herstel na fotobleaching

Om de bindingsaffiniteit van FB aan HA epitopen in levende cellen te bestuderen, werden FRAP experimenten uitgevoerd op cellen transiently getransfecteerd met 4 × HA-mCh-H2B (1,25 µg) en FB-GFP (1,25 µg) 24 h voor FRAP. De beelden werden verkregen met behulp van een Olympus IX81 spinnen schijf confocale (CSU22 hoofd) microscoop gekoppeld aan een Phasor fotomanipulatie-eenheid (Intelligent Imaging Innovations) met een × 100 olie-immersie objectief (NA 1,40). Vóór het fotobleken werden 20 of 10 frames verkregen met 1 of 5 s tijdsinterval. De beelden werden vastgelegd met een 488 nm laser (0,77 mW) laser met 100 ms belichtingstijd gevolgd door 561 nm (0,42 mW) laser met 15 ms belichtingstijd. De draaiende schijf werd ingesteld op 1 × 1 rotatiesnelheid. Na het verwerven van pre-FRAP-beelden, de p488 nm laser (van de Phasor-eenheid voor photobleaching) op 17 mW met 100 ms belichtingstijd, of 4 mW met 500 ms belichting, werd gebruikt om photobleach een cirkelvormig gebied in de kern. Na photobleaching, werden 30 beelden vastgelegd zonder vertraging of met 500 ms vertraging, en vervolgens 100 beelden met een vertraging van 1 s en 100 beelden met een vertraging van 5 s werden verkregen met dezelfde beeldvormende instellingen als de pre-FRAP beelden. De fluorescentie-intensiteit door de tijd van de gefobleerde vlek werden geëxporteerd met behulp van de Slidebook-software. De fluorescentie-intensiteit van de kern en de achtergrond werden verkregen door Fiji64 na correctie voor celbeweging met behulp van de StackReg Fiji plugin65. De FRAP curve en de helft werden verkregen met behulp van easyFRAP-web66, volgens de instructies van de website. Figuur 4b, d werden gegenereerd door Mathematica (Wolfram Research).

MCP zuivering

MCP-HaloTag werd gezuiverd door geïmmobiliseerd metaal affiniteitschromatografie17. Kort gezegd werd de His-getagde MCP-HaloTag gezuiverd door een Ni-NTA-agarose (Qiagen) gepakte kolom volgens de instructies van de fabrikant, met kleine wijzigingen. E. coli die het belanghebbende eiwit tot expressie brengt, werd gelyseerd in een PBS-buffer met een volledige reeks proteaseremmers (Roche) en 10 mM imidazol. De hars werd gewassen met PBS-buffer die 20 en 50 mM imidazool bevatte. Het eiwit werd vervolgens geëlueerd in een PBS-buffer met 300 mM imidazool. De geëlueerde His-getagd MCP werd gedialyseerd in een HEPES-buffer (10% glycerol, 25 mM HEPES pH 7,9, 12,5 mM MgCl2, 100 mM KCl, 0,1 mM EDTA, 0,01% NP-40 detergens, en 1 mM DTT), snap-frozen in vloeibare stikstof, en vervolgens opgeslagen bij -80 ° C.

Cel voorbereiding voor nascent chain tracking

De reporter plasmide smHA-KDM5B-MS2 (Addgene plasmide #81085) en de FB construct werden ofwel transiënte getransfecteerd zonder de MCP-HaloTag eiwit of kraal geladen met MCP-HaloTag eiwit in U2OS cellen uitgezet op een 35 mm MatTek kamers 4-6 uur voor de beeldvorming. 3 h later, als MCP-HaloTag eiwit werd kraal geladen, werden de cellen gekleurd met de JF646-HaloTag ligand, dan gewassen met fenol-rood-vrij compleet DMEM medium. Als er geen MCP-HaloTag eiwit nodig was, werd het medium van de cellen veranderd in fenol-rood-vrij complete DMEM medium 3 uur na transfectie. De cellen waren vervolgens klaar voor imaging.

Voor multiplexed beeldvorming, twee reporter plasmiden, smHA-KDM5B-MS2 en SunTag-kif18b, evenals twee probes, FB-mCh en Sun-GFP (met de HA epitoop verwijderd), werden transiently getransfecteerd in U2OS cellen uitgezet op een MatTek kamer 4-6 h voor beeldvorming. 3 h later, werd het medium van de cellen veranderd in fenol-rood-vrij complete DMEM medium. De cellen waren dan klaar voor imaging.

Imaging voorwaarde voor de vertaling en colokalisatie assays

Om beeld enkele mRNA’s en hun vertaling status met FB, een op maat gebouwde widefield fluorescentiemicroscoop gebaseerd op een schuine verlichting (HILO) regeling werd gebruikt 17,67. Kort gezegd, de excitatie bundels, 488, 561, 637 nm solid-state lasers (Vortran), werden gekoppeld en off-axis gericht op het achterste brandvlak van de objectieflens (APON 60XOTIRF, Olympus). Alle vermelde laservermogens werden gemeten in het back-focale vlak van het objectief. De emissiesignalen werden gesplitst door een beeldvormende kwaliteit, ultra-platte dichroïde spiegel (T660lpxr, Chroma). De langere emissiesignalen (ver-rood) werden na splitsing door een bandpassfilter (FF01-731/137-25, Semrock) geleid. De kortere emissiesignalen (rood en groen) na splitsing werden door een bandpassfilter voor rood (FF01-593/46-25, Semrock) of een bandpassfilter voor groen (FF01-510/42-25, Semrock) geleid, ingebouwd in een filterwiel (HS-625 HSFW TTL, Finger Lakes Instrumentation). De langere (ver-rood) en de kortere (rood en groen) emissiesignalen werden gedetecteerd door afzonderlijke twee EM-CCD-camera’s (iXon Ultra 888, Andor) door scherpstelling met een 300 mm achromatisch doublet objectief (AC254-300-A-ML, Thorlabs). De combinatie van ×60 objectieflens van Olympus, 300 mm buislens en iXon Ultra 888 levert ×100 beelden op met 130 nm pixel-1. Een podium top incubator voor temperatuur (37 ° C), vochtigheid en 5% CO2 (Okolab) is uitgerust op een piëzo-elektrische fase (PZU-2150, Applied Scientific Instrumentation) voor levende cel beeldvorming. De lasers, de camera’s, de piëzo-elektrische fase, en het filterwiel werden gesynchroniseerd door een open source microcontroller, Arduino Mega board (Arduino). Beeldvorming acquisitie werd uitgevoerd met behulp van open source Micro-Manager software (1.4.22)68.

De beeldvorming grootte werd ingesteld op het centrum 512 × 512 pixels 2 (66,6 × 66,6 µm2), en de camera-integratietijd werd ingesteld op 53,64 ms. De uitleestijd van de camera’s van de combinatie van onze beeldvorming grootte, uitleesmodus (30 MHz), en verticale verschuiving snelheid (1,13 µs) was 23,36 ms, wat resulteert in onze beeldvorming snelheid van 13 Hz (70 ms per beeld). Rode en groene signalen werden afwisselend belicht. De emissiefilter positie werd veranderd tijdens de camera uitleestijd. Om de bleed-through te minimaliseren, werd de ver-rood signaal gelijktijdig afgebeeld met het groene signaal. Om de hele dikte van cellen vast te leggen, werden 13 z-stacks met een stapgrootte van 500 nm (6 µm in totaal) belicht met behulp van de piëzo-elektrische fase. Dit resulteerde in onze totale cellulaire beeldvorming snelheid van 1 Hz voor de beeldvorming van een van beide rode of groene signalen, en 0,5 Hz voor de beeldvorming van zowel rode en groene signalen, ongeacht de far-red imaging.

Voor Figs. 1c, d, 2a, e, werd een enkel vlak van de cellen continu afgebeeld op 6,5 Hz voor 100 tijdstippen en gemiddeld gedurende de tijd (lasers: 488 nm, 130 µW; 561 nm, 4 µW (Fig. 1c), 90 µW (Fig. 1d), 19 µW (Fig. 2a), 155 µW (Fig. 2e); 637 nm, 220 µW). Voor Fig. 2b (links), werd de cel continu belicht bij 0,5 Hz, 488 nm (100 µW) en 561 nm (10 µW) lasers met 13 z-stacks elk tijdstip en gemiddeld gedurende de tijd. De verworven gemiddelde 13 z-stacks werden gedeconvolueerd met behulp van Fiji. Voor Fig. 6b, c, e en f, werden cellen afgebeeld om de 10 s met 13 z-stacks per tijdstip (lasers: 488 nm, 13 µW (fig. 6b), 18 µW (fig. 6c); 561 nm, 172 µW (fig. 6f); 637 nm, 150 µW (fig. 6b, c), 35 µW (fig. 6e)). Voor Fig. 7b, werd de cel continu belicht bij 0,5 Hz met 13 z-stacks elk tijdstip (lasers: 488 nm, 130 µW; 561 nm, 172 µW). Voor Fig. 8b, de cellen werden belicht om de 14 s met 13 z-stacks elk tijdstip (laser: 488 nm, 70 µW). Voor Fig. 8c, cellen werden belicht om de 40 s met 13 z-stacks elk tijdstip (laser: 488 nm, 130 µW). Voor gemotoriseerde translatie vlekken snelheid bepaling (Fig. 8e), werden de neuronen continu afgebeeld bij 1 Hz met 13 z-stacks elk tijdstip.

Voor Fig. 2b (rechts) en 2c, werd de co-lokalisatie afgebeeld door de Olympus IX81 spinnen schijf confocale (CSU22 hoofd) microscoop eerder beschreven met behulp van een × 100 olie-immersie objectief (NA 1,40) onder de volgende omstandigheden: 488 nm (0,77 mW) en 561 nm (0,42 mW) sequentiële beeldvorming voor vijf tijdstippen zonder vertraging met meerdere z plakjes om het hele cellichaam te dekken voor elk tijdstip, 1 × 1 spin tarief, belichtingstijd aangepast door cel helderheid. Beelden werden verkregen met een Photometrics Cascade II CCD-camera met behulp van SlideBook software (Intelligent Imaging Innovations). De getoonde beelden in figuren werden gegenereerd door het gemiddelde van vijf tijdstippen en vervolgens een max-projectie van alle z-plakken werd uitgevoerd door Fiji64.

Particle tracking van de vertaling sites

Single vertaling site detectie en tracking werd uitgevoerd op maximale intensiteit projectie beelden met aangepaste Mathematica (Wolfram Research) code17. Kort gezegd werden de beelden verwerkt met een bandpass filter om deeltjes te markeren, en vervolgens binarized om hun intensiteit-centroids detecteren als posities met behulp van de ingebouwde Mathematica routine ComponentMeasurements. Gedetecteerde deeltjes werden getraceerd en door de tijd verbonden via een “nearest neighbor search”. De precieze coördinaten (super-opgeloste locaties) van mRNA’s en vertaling sites werden bepaald door aanpassing (met behulp van de ingebouwde Mathematica routine NonlinearModelFit) de originele beelden naar 2D Gaussians van de volgende vorm:

waar IBG de achtergrondfluorescentie is, I de deeltjesintensiteit, (x0, y0) de deeltjesplaats, en (σx, σy) de spreidingen van het deeltje. De offset tussen de twee camera’s werd geregistreerd met behulp van de ingebouwde Mathematica routine FindGeometricTransform om de transformatiefunctie die het best uitgelijnd de aangebrachte posities van 100 nm diameter Tetraspeck kralen gelijkmatig verspreid over het beeld field-of-view.

Voor Figs. 6c, e, f, 7c, 8b, d, deeltjes werden gevolgd door aangepaste Mathematica code en verder uitgezet met Mathematica. Voor Fig. 7c, gemiddelde gemiddelde gekwadrateerde verplaatsingen werden berekend uit de Gaussian-fitted coördinaten (van 2D maximale intensiteit projectie beelden). De diffusie constante werd verkregen door het aanbrengen van de eerste vijf tijdstippen op een lijn met helling m = 4D, waarbij D is de diffusiecoëfficiënt. De enkele gemotoriseerde vertaling vlekken (Fig. 8e) werden gevolgd door de Fiji plugin TrackMate 69 na max-projectie en verder uitgezet met Mathematica. Alle Mathematica code is beschikbaar op request.

Single molecuul volgen van 1 × HA-getagd eiwitten in cellen

De dag voor beeldvorming, werden cellen uitgezet op MatTek kamer en transiently getransfecteerd met de 1 × HA-mCh-H2B en FB-Halo met behulp van LipofectamineTM LTX reagens met de PLUS-reagens (Invitrogen) volgens de instructies van de fabrikant. 3 uur na de transfectie, werd het medium veranderd in complete DMEM. Vóór beeldvorming, werden de cellen gekleurd met natriumborohydride (NaBH4) behandeld Halo ligand TMR (Promega) 45. Kortom, 1 µL van 1 mM Halo ligand TMR kleurstof werd gereduceerd gedurende 10 min in 200 µL van 50 mM NaBH4 oplossing (vooraf opgelost in PBS gedurende 10 min, pH 7,4). Vervolgens werd 200 µL van de gereduceerde TMR verdund met 800 µL fenol-rood-vrije DMEM om 1 mL gereduceerde-TMR-media te produceren. Media van getransfecteerde cellen werd vervangen door de gereduceerde-TMR media en cellen werden vervolgens geplaatst in een incubator (5% CO2, 37 ° C) gedurende 30 min voor kleuring. De cellen werden vervolgens driemaal gewassen met fenol-rood-vrije DMEM. Tussen de wasbeurten, werden de cellen geïncubeerd gedurende 5 min in een incubator (5% CO2, 37 ° C).

De cellen werden afgebeeld met behulp van een op maat gebouwde breedveld fluorescentiemicroscoop op basis van een schuine verlichting (HILO) schema 17,67. De beeldvorming field-of-view werd ingesteld op 256 × 256 pixels 2 (33,3 × 33,3 µm2), en de camera integratie tijd werd ingesteld op 30 ms. De cellen werden belicht met een 7,7 mW 561 nm laser met een beeldsnelheid van 43,8 ms per beeld voor een totaal van 10.000 tijdstippen (7,3 min). Tijdens de beeldvorming, werd een 6,2 mW 405 nm laser gepulseerd op voor 50 ms eenmaal per 10 s tot foto-activeren van de Halo-TMR gereduceerde ligand. Single moleculen werden gevolgd met behulp van de Fiji plugin TrackMate 69. Om ervoor te zorgen tracks vertegenwoordigen FB-Halo gebonden aan 1 × HA-mCh-H2B, werden tracks verder gefilterd in Mathematica. Het filter geëlimineerd tracks met een lengte van minder dan 16 frames. Verder moesten alle sprongen tussen frames zijn minder dan 220 nm. Dit criterium is gebruikt door anderen om transcriptiefactoren die chromatine-gebonden zijn te onderscheiden van die welke ongebonden46. Ten slotte werden in Mathematica, sporen kleurgecodeerd, hetzij volgens het tijdstip waarop ze werden verworven (zoals in Supplementary Fig. 5) of de gemiddelde sprong grootte tussen frames (zoals in Fig. 5).

Puromycine behandeling

U2OS-cellen transiently getransfecteerd met smHA-KDM5B-MS2 en FB of kraal geladen met smHA-KDM5B-MS2, FB en MCP-HaloTag werden afgebeeld zoals hierboven met 10 s intervallen tussen de frames. Na het verwerven van 5 of 10 tijdstippen als voorbehandeling beelden, werden cellen behandeld met een eindconcentratie van 0,1 mg ml-1 puromycine vlak voor het verwerven van de 6e of 11e tijdpunt. Na puromycine werd toegevoegd, werden de cellen afgebeeld onder dezelfde omstandigheden gebruikt voor de voorbehandeling beeldvorming tot de vertaling vlekken verdwenen.

Neuron cultuur en transfectie

Rat corticale neuronen werden verkregen uit de weggegooide cortices van embryonale dag (E) 18 foetussen die eerder werden ontleed aan de hippocampus te verkrijgen, en bevroren in Neurobasal medium (ThermoFisher Scientific) met 10% foetaal runderserum (FBS, Atlas Biologicals) en 10% DimethylSulfoxide (Sigma-Aldrich, D8418) in vloeibare stikstof. Cryobewaarde rat corticale neuronen werden uitgezet bij een dichtheid van ∼15,000-30,000 cellen per cm 2 op MatTek gerechten (MatTek) en gekweekt in Neurobasal medium met 2% B27 supplement (ThermoFisher Scientific), 2 mM l-alanine / l-glutamine en 1% FBS (Atlas Biologicals). Transfecties werden uitgevoerd na 5-7 dagen in cultuur met behulp van Lipofectamine 2000 (ThermoFisher Scientific) volgens de instructies van de fabrikant. Neuronen co-expressie 4 × HA-mRuby-Kv2.1 en FB-GFP werden belicht 1-2 dagen na de transfectie (Fig. 2b). Neuronen co-expressie smHA-Kv2.1 en FB-GFP werden afgebeeld 1-7 dagen post-transfectie (Supplementary Fig. 2 links). Voor vertaling assays, werden neuronen afgebeeld 4-12 uur na transfectie. Alle neuron beeldvorming experimenten werden uitgevoerd in een temperatuur-gecontroleerde (37 ° C), bevochtigd, 5% CO2-omgeving in Neurobasal medium zonder fenol rood (ThermoFisher Scientific). Neuronale identiteit werd bevestigd door het volgen van processen die uitgaan van het cellichaam te worden afgebeeld voor honderden microns om ervoor te zorgen dat ze waren echte neurites.

Monitoring zebravis ontwikkeling

Alle zebravis experimenten zijn goedgekeurd door de Tokyo Tech Genetic Experiment Safety Committee (I2018001) en de behandeling van dieren wordt uitgevoerd volgens de richtlijnen. Om FB-GFP visualiseren in zebravis embryo, werden mRNA’s voor FB-GFP en N × HA-mCh-H2B bereid. DNA-fragmenten coderen FB-GFP en N × HA-mCh-H2B werden ingevoegd in een plasmide met de T7 promotor en poly A70. De daaropvolgende plasmiden (T7-FB-GFP en T7-N × HA-mCh-H2B) werden gelineariseerd met de XbaI restrictie site voor in vitro transcriptie met behulp van mMESSAGE mMACHINE kit (ThermoFisher Scientific). RNA werd gezuiverd met behulp van RNeasy Mini Elute Cleanup Kit (QIAGEN) en geresuspendeerd in water. Vóór micro-injectie, werden zebravis (AB) eieren dechorionated door onderdompeling in 2 mg ml-1 pronase (Sigma Aldrich; P5147) in 0,03% zeezout gedurende 10 min. Een mengsel (~ 0,5 nL) met mRNA (200 pg elk voor FB-GFP en N × HA-mCh-H2B) werd geïnjecteerd in de dooier (in de buurt van de cel deel) van 1-cel stadium embryo’s. Voor een negatieve controle, werd HA-mCh-H2B mRNA weggelaten. 5-10 min na mRNA injectie, werd Cy5-gelabelde Fab specifiek voor endogene histon H3 Lys9 acetylatie (CMA310) 25 geïnjecteerd (100 pg in ~ 0,5 nL). Geïnjecteerde embryo’s werden geïncubeerd bij 28 ° C tot de vier-cel stadium en ingebed in 0,5% agarose (Sigma Aldrich, A0701) in 0,03% zeezout met het dier paal naar beneden op een 35-mm glazen bodem schotel (MatTek). De fluorescentie beelden werden verzameld met behulp van een confocale microscoop (Olympus; FV1000) uitgerust met een verwarmde podium (Tokai Hit) ingesteld op 28 ° C en een UPLSAPO × 30 siliconen olie-immersie lens (NA 1,05), bediend door de ingebouwde FV1000 software FLUOVIEW ver.4.2. Drie beelden werden achtereenvolgens verworven om de 5 min met 488, 543 en 633 nm lasers (640 × 640 pixels, 0,662 µm pixel-1, pinhole 800 urn, 2,0 urn pixel-1) zonder middeling. Maximale intensiteit projecties werden gemaakt van 20 z-stacks met 5 μm.

Nuclei binnen zebravis embryo’s werden gevolgd in 4D met behulp van de Fiji plugin TrackMate69. Resultaten werden post-processed en uitgezet met Mathematica. Om het aantal en het gebied van kernen en de gemiddelde nucleaire, cytoplasmatische, en nucleaire:cytoplasmatische intensiteit kwantificeren door de tijd heen, werd de intensiteit van alle kernen in maximale intensiteit projecties gemeten met behulp van de ingebouwde Mathematica functie ComponentMeasurements. ComponentMeasurements vereist binaire maskers van de te meten objecten. Binaire maskers van de kernen werden gemaakt met behulp van de ingebouwde Mathematica functie Binarize met een geschikte intensiteit drempel om alleen kernen markeren in beelden van Cy5-gelabelde Fab (specifiek voor endogene histon H3 Lys9 acetylatie). Maskers van het cytoplasma rond elke kern werden gemaakt door het verwijden van de nucleaire maskers door 4 pixels (met behulp van de ingebouwde opdracht Dilation) en vervolgens aftrekken van de verwijde masker de oorspronkelijke nucleaire maskers verwijd met 1 pixel. Dit creëert ringvormige maskers rond elke kern, waaruit de gemiddelde cytoplasmatische intensiteit werd gemeten.

Surface plasmon resonance

Binding kinetiek van gezuiverd FB aan de HA epitoop tag werd gemeten door oppervlakte plasmon resonantie (OpenSPR, Nicoyalife). Na biotine gelabeld HA peptide werd gevangen door een Streptavidin sensor chip (Nicoyalife), verdund gezuiverd FB-GFP in PBS lopende buffer, pH 7,4, werd langzaam gestroomd over de sensor chip gedurende 5 min om interactie mogelijk te maken. De lopende buffer werd vervolgens toegestaan om te stromen gedurende 10 min tot de dissociatie gegevens te verzamelen. De niet-specifieke bindingscurve werd verkregen door dezelfde concentratie FB-GFP in dezelfde loopbuffer over een andere Streptavidinesensorchip (Nicoyalife) te laten stromen. De gegevens van de controle werden verzameld precies zoals in het experiment. Voor 100 en 30 nM FB-GFP was de bindingsreactie significant hoger dan de controle, met verwaarloosbare niet-specifieke bindingsinteractie. Daarom kozen we deze twee concentraties voor binding kinetiek montage. Na aftrek van de controle, de signaalrespons vs tijd curve werd verkregen, zoals weergegeven in aanvullende Fig. 4. Binding kinetische parameters werden verkregen door het monteren van de curve aan een een-op-een bindingsmodel met behulp van TraceDrawer (Nicoyalife) software (Supplementary Fig. 4).

Rapportage samenvatting

Verder informatie over de onderzoeksopzet is beschikbaar in de Nature Research Reporting Summary gekoppeld aan dit artikel.