DDRGK1 is required for ER homoeostasis

Om de cellulaire functie van DDRGK1 te begrijpen, onderzochten we de effecten van DDRGK1 knockdown met behulp van een mengsel van twee siRNAs zoals eerder beschreven21. We vonden dat knockdown van DDRGK1 apoptotische celdood induceerde in zowel MCF7 als HepG2 cellen, gekenmerkt door Annexine V/PI kleuring (Fig. 1a), caspase-3 activering en PARP splitsing (Fig. 1b). Opgemerkt moet worden dat we de caspase-3 splitsing kunnen detecteren in HepG2 cellen geïnduceerd door knockdown van DDRGK1 maar niet in MCF7 cellen, omdat MCF7 cellen caspase-3 deficiënt zijn22. Kwantitatieve real-time PCR (Q-PCR) analyse toonde aan dat knockdown van DDRGK1 de expressie van de pro-apoptotische genen BAX, BAK, NOXA, DR5 en Bid verhoogde, terwijl de expressie van het anti-apoptotische gen Bcl-2 daalde (Fig. 1c,d). Belangrijk is dat we ontdekten dat knockdown van DDRGK1 in MCF7- en HepG2-cellen ER-stressreacties induceerde, met verhoogde ER-stress-specifieke genexpressie van BiP, HSPA8 en CHOP (Fig. 1e,f).

(a) MCF7- en HepG2-cellen werden gedurende 72 uur getransfecteerd met controle-siRNA of siRNA gericht tegen DDRGK1. De cellen werden vervolgens gekleurd met Annexine V en PI en onderworpen aan flowcytometrische analyse, gevolgd door de kwantificering van apoptotische cellen (Annexine V+). (b) Western blot analyse van PARP en gekloofde caspase-3 in controle- en DDRGK1-knockdown MCF7- en HepG2-cellen als beschreven in a. (c,d) Q-PCR analyse van de relatieve mRNA expressieniveaus van BAX, BAK, NOXA, Bid, DR-5 en Bcl-2 in controle- en DDRGK1-knockdown MCF7- en HepG2-cellen. (e,f) Q-PCR analyse van de relatieve mRNA expressie niveaus van BiP, HSPA8 en CHOP in controle en DDRGK1-knockdown MCF7 en HepG2 cellen. Alle gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde±s.d. van drie experimenten. *P<0,05, **P<0,01 en ***P<0,001 door Student’s t-test.

Om verder te bevestigen dat DDRGK1 betrokken is bij de ER stress respons, bepaalden we het effect van DDRGK1 op celoverleving na behandeling met de ER stress inducers thapsigargin (Tg) en tunicamycine (Tm). Het afbreken van DDRGK1 versterkte ER stress-geïnduceerde apoptose door Tg behandeling in zowel HepG2 als MCF7 cellen, zoals beoordeeld door Annexine V/PI kleuring en splitsing van caspase-3 en PARP (Fig. 2a-c en supplementaire Fig. 1A-C). Daarentegen verminderde over-expressie van DDRGK1 de ER stress-geïnduceerde celdood in HepG2 cellen (Fig. 2d-f). Bovendien werd de levensvatbaarheid van MCF7 cellen beoordeeld door MTT assay, en de resultaten toonden aan dat knockdown van DDRGK1 de cellen gevoeliger maakte voor Tg of Tm behandeling, met verminderde levensvatbaarheid van de cellen (Supplementaire Fig. 1D), terwijl over-expressie van DDRGK1 de overleving van de cellen na Tg of Tm behandeling bevorderde (Supplementaire Fig. 1E). Alles bij elkaar suggereren onze resultaten dat DDRGK1 een vitale rol speelt in de regulering van ER-homoeostase.

(a). HepG2-cellen werden getransfecteerd met controle-siRNA of met siRNA tegen DDRGK1 gedurende 72 uur, en vervolgens werden de cellen behandeld met DMSO (voertuigcontrole) of Tg (2,5 μM) gedurende 24 uur voor het oogsten. De cellen werden gekleurd met Annexine V en PI, gevolgd door flowcytometrische analyse. (b). Kwantificering van de apoptotische cellen (Annexine V +) in a. (c) Western blot analyse van PARP en gekloofde caspase-3 in de HepG2 cellen beschreven in a. (d) HepG2 cellen werden getransfecteerd met controle vector of DDRGK1 gedurende 36 uur, en de cellen werden behandeld met DMSO of Tg (2,5 uM) gedurende 24 uur voor de oogst. De cellen werden gekleurd met Annexine V en PI, gevolgd door flowcytometrische analyse. (e) Kwantificering van de apoptotische cellen (Annexine V+) in d. (f) Western blot analyse van PARP en gekloofde caspase-3 in de HepG2-cellen beschreven in d. Alle gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde±s.d. van drie experimenten. **P<0,01 en ***P<0,001 door Student’s t-test.

DDRGK1 moduleert de UPR

Om te begrijpen hoe DDRGK1 de ER-homoeostase reguleert, analyseerden we eerst veranderingen in de eiwitniveaus van drie UPR-sensoren en hun downstream targets in DDRGK1-verwijderde cellen. De resultaten toonden aan dat knockdown van DDRGK1 in MCF7 en HepG2 cellen de niveaus van totaal IRE1α significant verminderde, maar de gefosforyleerde IRE1α (p-IRE1α) zwak verminderde, wat mogelijk het gevolg is van de verminderde niveaus van totaal IRE1α (Fig. 3a). De niveaus van ATF6 en gekloofde ATF6 werden niet beïnvloed (Fig. 3a). Interessant is dat het uitschakelen van DDRGK1 geen effect had op het totaal PERK gehalte, maar het gehalte gefosforyleerde PERK (p-PERK) en BiP waren significant verhoogd (Fig. 3a). Vervolgens onderzochten we de effecten van DDRGK1 depletie op het IRE1α substraat XBP1. De resultaten toonden aan dat XBP1s, een gesplicte vorm van XBP1, significant was afgenomen in DDRGK1-knockdown MCF7 cellen op een tijdsafhankelijke manier (Fig. 3b), wat gecorreleerd was met veranderingen in de IRE1α eiwitniveaus (Supplementary Fig. 2A). Bovendien verhoogde depletie van DDRGK1 de eIF2α fosforylering (p-eIF2α) en CHOP expressie in zowel MCF7 als HepG2 cellen (Supplementary Fig. 2B). Deze resultaten geven aan dat depletie van DDRGK1 de UPR-IRE1α signalering onderdrukt en de UPR-PERK apoptotische route activeert, die bijgevolg apoptose in gang zet, zoals waargenomen in Fig. 1 en 2. Het niveau van IRE1α was echter verhoogd in DDRGK1 over-expresserende cellen op een dosis-afhankelijke wijze (Fig. 3c), terwijl de niveaus van p-PERK, PERK, ATF6, p-IRE1α, BiP en de gesplicte vorm van XBP1 niet significant veranderd waren (Fig. 3c; Supplementary Fig. 2C en D). Om de functionele relatie tussen DDRGK1 en de UPR te onderzoeken, beoordeelden we de dynamische veranderingen van IRE1α en PERK in DDRGK1-knockdown MCF7 cellen en in controle cellen na Tg behandeling op verschillende tijdstippen. Behandeling met Tg verhoogde de niveaus van IRE1α en p-IRE1α, p-PERK en BiP in controle cellen, zoals verwacht. De totale IRE1α niveaus waren echter significant verlaagd (0-24 uur), terwijl de p-IRE1α niveaus bescheiden verlaagd waren (4-24 uur) in DDRGK1-verwijderde cellen vergeleken met controle cellen (Fig. 3d). Tegelijkertijd was het niveau van XBP1s verlaagd in DDRGK1-verwijderde cellen in vergelijking met controle cellen (4-12 uur) (Fig. 3e). De niveaus van totaal PERK waren niet veranderd, maar p-PERK was significant verhoogd in DDRGK1-verwijderde cellen (0-12 uur) (Fig. 3d). Vergelijkbare resultaten werden verkregen in HepG2 cellen (Supplementary Fig. 2E en F). Alles bij elkaar suggereren onze resultaten dat depletie van DDRGK1 afbraak van IRE1α en activering van PERK veroorzaakt.

(a) MCF7- en HepG2-cellen werden gedurende 72 uur getransfecteerd met controle-siRNA of met siRNA gericht tegen DDRGK1. De eiwitniveaus van p-IRE1α, IRE1α, p-PERK, PERK, ATF6 en BiP werden bepaald met behulp van Western blot. (b) MCF7-cellen werden getransfecteerd met controle-siRNA of siRNA tegen DDRGK1, en de cellen werden op de aangegeven tijdstippen geoogst voor RT-PCR-analyse van XBP-1 splicing. (c) MCF7- en HepG2-cellen werden getransfecteerd met controle- of DDRGK1-vectoren in verschillende doses gedurende 36 uur. De eiwitniveaus van p-IRE1α, IRE1α, p-PERK, PERK en ATF6 werden bepaald met behulp van Western blot. (d) MCF7-cellen werden getransfecteerd met siRNA controle of siRNA gericht tegen DDRGK1 gedurende 72 uur. De cellen werden verzameld voor Western blot na behandeling met 2,5 pM Tg op de aangegeven tijdstippen. (e) RT-PCR analyse van XBP-1 splicing in d. *Representeert niet-specifieke band.

DDRGK1 reguleert de UPR door zich te richten op IRE1α

De UPR wordt geactiveerd door ER stresssensoren bij ER stress om de ER homoeostase te reguleren8. Er is gerapporteerd dat hepatocyt-specifieke deletie van IRE1α in muizen resulteerde in activering van de UPR-PERK pathway23. Om te onderzoeken of de inductie van p-PERK, waargenomen in DDRGK1-verwijderde cellen, gemedieerd werd door verlaagde niveaus van IRE1α, onderzochten we de niveaus van p-PERK, PERK en zijn downstream targets in IRE1α-verwijderde cellen. De resultaten toonden aan dat knockdown van IRE1α de eiwitniveaus van p-PERK en p-eIF2α significant verhoogde in zowel MCF7 als HepG2 cellen (Fig. 4a), vergelijkbaar met die waargenomen in DDRGK1-verwijderde cellen (Fig. 3a; Supplementary Fig. 2B). Deze resultaten geven aan dat DDRGK1 de UPR reguleert door zich te richten op IRE1α. Vervolgens onderzochten we hoe DDRGK1 IRE1α reguleert. Onze resultaten toonden aan dat IRE1α eiwit niveaus, maar niet mRNA niveaus (Supplementary Fig. 3A), dramatisch verlaagd waren in DDRGK1-knockdown cellen (Fig. 3a). Behandeling van de cellen met de proteasoomremmer MG132 blokkeerde de DDRGK1-gemedieerde reductie van IRE1α eiwit (Fig. 4b; Supplementaire Fig. 3B). Bovendien zagen we dat depletie van DDRGK1 de halfwaardetijd van IRE1α drastisch verminderde in een cycloheximide chase assay (Fig. 4c). In overeenstemming met deze observaties, vonden we dat ectopische expressie van IRE1α de celoverleving verbeterde in zowel DDRGK1 uitgeputte MCF7 als HepG2 cellen in vergelijking met controle cellen, gekenmerkt door Annexine V/PI kleuring en caspase-3 activering (Fig. 4d,e; Supplementary Fig. 3C en D). Al met al suggereren deze resultaten dat DDRGK1 de stabiliteit van IRE1α reguleert en daarmee de UPR.

(a). MCF7- en HepG2-cellen werden gedurende 72 uur getransfecteerd met controle-siRNA of siRNA gericht tegen IRE1α. De eiwitniveaus van p-PERK, PERK, p-eIF2α en eIF2α werden bepaald met behulp van Western blot. (b). Western blot analyse van IRE1α in controle- en DDRGK1-knockdown MCF7-cellen, behandeld met of zonder MG132 (20 μM, 8 uur). (c). Western blot analyse van IRE1α verval in controle en DDRGK1-knockdown MCF7 cellen na behandeling met 100 ug ml-1 cycloheximide voor de aangegeven tijden. De grafiek geeft de kwantificering van de IRE1α-eiwitniveaus weer. (d) MCF7-cellen werden getransfecteerd met controle-siRNA of siRNA gericht tegen DDRGK1 gedurende 72 uur. Vóór de oogst werden de DDRGK1-knockdown-cellen getransfecteerd met controle- of IRE1α-vectoren gedurende 36 uur. De cellen werden vervolgens gekleurd met Annexine V en PI en onderworpen aan flowcytometrische analyse, gevolgd door kwantificering van apoptotische cellen (Annexine V+). Alle gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde±s.d. van drie experimenten. *P<0.05 door Student’s t-test. (e) Western blot analyse van IRE1α in MCF7 cellen in d.

DDRGK1 interageert met IRE1α

Om te begrijpen hoe DDRGK1 de stabiliteit van IRE1α reguleert, hebben we getest of DDRGK1 interageert met IRE1α via een wederkerige immunoprecipitatie (IP) assay in HEK293T cellen. De resultaten toonden aan dat exogeen uitgedrukte Flag-IRE1α specifiek interageerde met endogeen DDRGK1 en BiP (Fig. 5a). Dienovereenkomstig interageerde exogeen tot expressie gebrachte Flag-DDRGK1 specifiek met endogeen IRE1α en het bekende DDRGK1-geassocieerde eiwit C53 (ref. 14). We konden echter geen BiP detecteren in de Flag-DDRGK1 immunoprecipitaten (Fig. 5b), wat suggereert dat DDRGK1 mogelijk niet direct interageert met BiP. IRE1α, als een endogeen ER-geassocieerd degradatie (ERAD) substraat, wordt afgebroken door de associatie tussen IRE1α en het Sel1L-Hrd1 ERAD complex op een BiP afhankelijke manier24. Daarom hebben wij onderzocht of BiP betrokken is bij de interactie tussen DDRGK1 en IRE1α. De resultaten toonden aan dat de interactie tussen DDRGK1 en IRE1α niet werd beïnvloed door knockdown van BiP (supplementaire Fig. 4). Om de interactie van DDRGK1 met IRE1α verder te bevestigen, voerden we immunofluorescentie kleuringsexperimenten uit. De resultaten toonden aan dat deze twee eiwitten co-lokaliseerden in het ER (Fig. 5c). Om het gebied in kaart te brengen dat betrokken is bij de interactie van IRE1α met DDRGK1, co-transfecteerden we Flag-IRE1α wild-type en truncatie mutanten samen met DDRGK1 in HEK293T cellen, en de IP resultaten toonden aan dat het cytoplasmatische kinase domein van IRE1α noodzakelijk was voor zijn interactie met DDRGK1 (Fig. 5d). Om de dynamische veranderingen in de interactie tussen DDRGK1 en IRE1α onder ER stress condities te begrijpen, werden HEK293T cellen getransfecteerd met Flag-DDRGK1 en behandeld met Tg voor verschillende tijdstippen. Zoals verwacht, zagen we dat totaal IRE1α, p-IRE1α en BiP significant verhoogd waren onder ER stress. Interessant was dat DDRGK1 specifiek interageerde met niet-gefosforyleerd IRE1α, maar niet met p-IRE1α, in de immunoprecipitaten (Fig. 5e). Deze resultaten suggereren dat DDRGK1 een wisselwerking heeft met niet-gefosforyleerd IRE1α en de stabiliteit daarvan in stand houdt.

(a). Western blot analyse van immunoprecipitaten van Flag M2 affiniteitsgel in HEK293T-cellen, getransfecteerd met Flag-Vector of Flag-IRE1α-vectoren gedurende 36 uur. (b). Western blot analyse van immunoprecipitaten van Flag M2 affiniteitsgel in HEK293T-cellen getransfecteerd met Flag-Vector of Flag-DDRGK1 gedurende 36 uur. (c). MCF7-cellen werden dubbel geïmmunostaineerd met anti-DDRGK1-antilichaam (groen) en anti-IRE1α-antilichaam (rood). De celkernen werden tegengekleurd met DAPI (blauw). De co-lokalisatie tussen de twee endogene eiwitten DDRGK1 en IRE1α wordt getoond in het samenvoegingspaneel. Schaal bar, 20 pm. (d) Schema’s van IRE1α wild-type en afgeknotte constructen en western blot analyse van de Flag M2 affiniteit gel immunoprecipitaten in HEK293T cellen getransfecteerd met Flag-Vector of Flag-IRE1α wild-type en afgeknotte constructen. (e) Western blot analyse van Flag M2 affiniteit gel immunoprecipitaten in mock-of Tg-behandelde (2,5 uM) HEK293T cellen die Flag-Vector of Flag-DDRGK1 uitdrukken.

Ufm1 is nodig voor de interactie van DDRGK1 en IRE1α

Een recente studie toonde aan dat DDRGK1 een ufmyleringssubstraat is en vereist is voor ASC1 ufmylering15,20. Om te onderzoeken of ufmylering betrokken is bij de regulatie van IRE1α stabiliteit door DDRGK1, hebben we onderzocht of uitputting van Ufm1 de expressie van IRE1α eiwit beïnvloedt. Vergelijkbaar met de depletie van DDRGK1, zagen we dat knockdown van Ufm1 expressie de niveaus van IRE1α eiwit drastisch verminderde (Fig. 6a), wat aangeeft dat DDRGK1 IRE1α reguleert door ufmylering. Dienovereenkomstig vonden we dat over-expressie van DDRGK1 er niet in slaagde het IRE1α eiwit te stabiliseren in Ufm1-knockdown MCF7 cellen vergeleken met controle cellen (Fig. 6b). Bovendien waren de IRE1α eiwitniveaus dramatisch verlaagd in Ufm1-knockdown MCF7 cellen in zowel de afwezigheid als de aanwezigheid van Tg (Fig. 6c), wat suggereert dat ufmylering nodig is voor de regulatie van IRE1α eiwitstabiliteit door DDRGK1. We vroegen ons vervolgens af of IRE1α onderhevig is aan ufmyleringsmodificatie. Om deze vraag te beantwoorden, hebben we de ufmylering van IRE1α gedetecteerd in cellen die DDRGK1 en Ufm1 alsook UBA5 (E1), UFC1 (E2) en UFL1 (E3) tot expressie brengen, zoals eerder beschreven20. We konden echter geen ufmylering van het IRE1α eiwit detecteren, hoewel ufmylering van het DDRGK1 eiwit gemakkelijk detecteerbaar was, zoals eerder beschreven (data niet getoond)15,20,25, wat suggereert dat IRE1α mogelijk geen doelwit van ufmylering is. Interessant genoeg vonden we dat de associatie tussen DDRGK1 en IRE1α significant was afgenomen in Ufm1-knockdown HEK293T cellen vergeleken met controle cellen (Fig. 6d). In overeenstemming met deze observatie vonden we dat de interactie van DDRGK1 K267R (een DDRGK1 mutant deficiënt in ufmylering, waarin het lysine residu 267 werd gesubstitueerd door een arginine residu)15 met IRE1α dramatisch was verminderd in vergelijking met het wild-type DDRGK1 (Fig. 6e), wat aangeeft dat ufmylering van DDRGK1 nodig is voor de associatie tussen DDRGK1 en IRE1α. Bovendien slaagde DDRGK1 K267R er niet in om het IRE1α eiwit te stabiliseren in vergelijking met wild-type DDRGK1 (Fig. 6f). Al met al suggereren deze resultaten dat ufmylering van DDRGK1 op K267 noodzakelijk is voor de interactie met IRE1α en de regulatie van de stabiliteit van het IRE1α eiwit.

(a) MCF7-cellen werden gedurende 72 uur getransfecteerd met controle-siRNA of met siRNA gericht tegen Ufm1. De eiwitniveaus van IRE1α werden bepaald met behulp van Western blot. (b) Western blot analyse van IRE1α in controle en Ufm1-knockdown MCF7-cellen die vector of DDRGK1 tot expressie brengen. (c) Het eiwitniveau van IRE1α werd bepaald door Western blot in controle en Ufm1-knockdown MCF7 cellen na behandeling met 2,5 uM Tg voor de aangegeven tijden. (d) Western blot analyse van Flag M2 affiniteit gel immunoprecipitaten in HEK293T controle en Ufm1-knockdown cellen die Flag-Vector of Flag-DDRGK1 uitdrukken. (e) Western blot analyse van Flag M2 affiniteit gel immunoprecipitaten in HEK293T cellen getransfecteerd met Flag-Vector, Flag-DDRGK1 WT of K267R mutant. (f) Western blot analyse van IRE1α in MCF7-cellen getransfecteerd met Flag-Vector, Flag-DDRGK1 WT of K267R mutant.

DDRGK1 is vereist voor HSC-reconstitutievermogen in muizen

Een recente studie suggereerde dat hematopoietische stamcellen (HSC’s) extreem gevoelig zijn voor ER-stress26. Dit bracht ons ertoe te speculeren dat DDRGK1 cruciaal zou kunnen zijn in de HSC functie. We bepaalden eerst het expressieniveau van DDRGK1 in meerdere hematopoietische lineages van 2-maanden oude wild-type muizen. Q-PCR onthulde een significant hoger niveau van DDRGK1 expressie in HSCs, inclusief lange-termijn HSCs (LT-HSCs), korte-termijn HSCs (ST-HSCs) en multipotente progenitors (MPPs) (Fig. 7a). Bovendien kwam het eiwitniveau van DDRGK1 sterk tot expressie in HSC-verrijkte Lineage-c-Kit+ beenmerg (BM) cellen in vergelijking met Lineage+c-Kit- BM cellen (Fig. 7b). Deze observaties suggereren een belangrijke rol van DDRGK1 in stamcellen. Om de rol van DDRGK1 in HSC functie te onderzoeken, werden competitieve transplantatie experimenten uitgevoerd met HSCs na lentivirale knockdown van DDRGK1 (Fig. 7c). Lineage-Sca1 + c-Kit + (LSK) cellen van CD45.1 donor muizen werden getransduceerd met de controle of DDRGK1-knockdown lentivirus en getransplanteerd in dodelijk bestraalde CD45.2 ontvanger muizen. Flow cytometrische analyse toonde aan dat het percentage van de donor-afgeleide perifeer bloed (PB) cellen was aanzienlijk verminderd in de DDRGK1-knockdown groep in vergelijking met de controle, wat aangeeft dat knockdown van DDRGK1 aanzienlijk verminderd de concurrerende reconstitutie vermogen van HSCs (Fig. 7d). Terwijl in een niet-concurrerend transplantatie experiment, de ontvangende muizen getransplanteerd met DDRGK1-knockdown HSCs nog in leven waren 3 maanden na transplantatie, suggereert dit dat knockdown van DDRGK1 alleen het concurrerende herplaatsingsvermogen van HSCs in gevaar bracht. Om off-target effecten uit te sluiten, ontwierpen we een andere shRNA gericht op DDRGK1 en waargenomen soortgelijke resultaten (Supplementary Fig. 5A). Drie maanden na de transplantatie, werden de ontvangende muizen geëuthanaseerd voor BM-analyse en in vitro kolonie-vorming assays. Flow cytometrische analyse toonde aan dat knockdown van DDRGK1 het onderhoud van getransduceerde HSCs drastisch verminderde zonder hun lineage potentieel te beïnvloeden (dat wil zeggen, myeloïde, B cel en T cel lineages), zoals aangegeven door een verminderde frequentie van donor-afgeleide hematopoietische stam en progenitor cellen, evenals gedifferentieerde hematopoietische cellen in de BM en PB (Fig. 7e). Een soortgelijk resultaat werd waargenomen in een onafhankelijk experiment met een andere shRNA gericht tegen DDRGK1 (Supplementary Fig. 5B). Bovendien isoleerden we donor-afgeleide CD34-Flt3-LSK cellen (LT-HSCs) van de ontvangende muizen en voerden een een-cel kolonie-vorming assay. De resultaten toonden aan dat knockdown van DDRGK1 het vermogen van HSCs om middelgrote en grote kolonies te vormen verminderde (Fig. 7f). Al met al suggereren deze gegevens dat DDRGK1 nodig is voor het behoud van de HSC-functie.

(a) Q-PCR analyse van de relatieve mRNA expressieniveaus van DDRGK1 in de aangegeven subpopulaties van de BM van jonge wild-type muizen (2 maanden oud, n=3). De relatieve expressie van DDRGK1 werd genormaliseerd ten opzichte van GAPDH. De gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± s.d. (b) Western blot analyse van DDRGK1 in verrijkte Lineage+ c-Kit- en Lineage- c-Kit+ cellen van jonge wild-type muizen (2 maanden oud). (c) Experimenteel schema voor de reconstitutie assay. (d) Vertegenwoordiger FACS-patroon met het percentage GFP-positieve cellen in donor-afgeleide controle (sh-Vector) of DDRGK1-knockdown (sh-DDRGK1) PB-cellen (linker paneel). De waarden vertegenwoordigen de genormaliseerde percentages van donor-afgeleide GFP + cellen in de totale engraftment (rechter paneel, n = 3). De gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± s.d. **P<0,01 en ***P<0,001 door Student’s t-test. (e) De waarden vertegenwoordigen de percentages van donorafgeleide GFP+ cellen in LT-HSC (CD34+Flt3- LSK), ST-HSC (CD34+Flt3- LSK), MPP (CD34+Flt3+ LSK), CMP (CD34+CD16/32-Sca1-c-Kit+Lin-), GMP (CD34+CD16/32+Sca1-c-Kit+Lin-), MEP (CD34- CD16/32-Sca1-c-Kit+Lin-), B, T en myeloïde lijn celpopulaties in de BM van primaire ontvanger muizen 12 weken na transplantatie (n=3). Gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde±s.d. ***P<0.001 door Student’s t-test. (f) Afzonderlijke donor-afgeleide GFP + LT-HSCs van ontvangende muizen werden gesorteerd in 96-wells platen en gekweekt gedurende 14 dagen in vitro. Het percentage kolonies werd berekend door het aantal kolonies te delen door het oorspronkelijke aantal enkele cellen die werden gezaaid. De gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± s.d. **P<0.01 door Student’s t-test.

Om te onderzoeken of de verminderde HSC-functie het gevolg was van een verminderde homing efficiency, labelden we controle of sh-DDRGK1 lentiviraal getransduceerde LSK-cellen gezuiverd van 2-maanden oude muizen met fluorescerende kleurstof (violet), en injecteerden deze in dodelijk bestraalde ontvangers. Het percentage gelabelde LSK-cellen dat 18 uur na de transplantatie in de BM van de ontvanger aanwezig was, werd geanalyseerd met behulp van flowcytometrie. De resultaten toonden aan dat het homing vermogen van DDRGK-knockdown LSK cellen vergelijkbaar was met die van controle cellen (Supplementary Fig. 6A en B). Om te bepalen of knockdown van DDRGK1 een effect had op de celcyclus status van LSK cellen, kleurden we donor-afgeleide controle en DDRGK1-knockdown LSK cellen met de proliferatie marker Ki67 en DAPI en vonden geen significant verschil in de celcyclus profielen tussen DDRGK1-knockdown HSCs en controle HSCs (Supplementary Fig. 7A). We onderzochten vervolgens het effect van DDRGK1-knockdown op HSCs apoptose met behulp van Annexine V kleuring en vond een significant hogere frequentie van apoptose in donor-afgeleide DDRGK1-knockdown LSK cellen in vergelijking met controle LSK cellen; dit fenomeen werd waargenomen met zowel van de shRNAs gericht op DDRGK1 (Fig. 8a; Supplementary Fig. 7B). Vervolgens onderzochten we de niveaus van reactieve zuurstofsoorten (ROS) in de getransduceerde HSCs. De resultaten toonden aan dat het ROS niveau vergelijkbaar was tussen de controle en DDRGK1-knockdown groepen (Supplementary Fig. 7C). Op basis van bovenstaande waarnemingen concludeerden we dat knockdown van DDRGK1 in HSC’s apoptotische celdood induceerde, waardoor de HSC-functie werd aangetast.

(a) Representatieve FACS-patroon met het percentage Annexine V-positieve cellen binnen de donor-afgeleide controle-en DDRGK1-knockdown LSK-cellen na transplantatie (linker paneel). Staafdiagram toont het percentage Annexine V-positieve cellen binnen LSK-cellen (rechter paneel, n = 3). Gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± s.d. *P <0,05 door Student’s t-test. (b) Q-PCR analyse van de relatieve mRNA expressieniveaus van DDRGK1, BiP en CHOP in van donors afkomstige controle- en DDRGK1-knockdown LSK-cellen na transplantatie (n=3). Gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde±s.d. **P<0.01 en ***P<0.001 door Student’s t-test. (c) Western blot analyse van p-IRE1α, IRE1α, p-PERK, PERK en ATF6 in donor-afgeleide GFP+Lineage-c-Kit+ cellen verrijkt uit controle of DDRGK1-knockdown ontvangende muizen. *Representeert niet-specifieke band. (d) RT-PCR analyse van XBP-1 splicing in donor-afgeleide controle en DDRGK1-knockdown LSK cellen na transplantatie. MEF-cellen met Tg behandeling diende als een XBP-1 splicing controle.

Om te onderzoeken of de verminderde HSC functie het gevolg was van activering van de ER stress respons in DDRGK1-knockdown HSCs, analyseerden we de expressie niveaus van BiP en CHOP door Q-PCR in controle en DDRGK-knockdown gegradueerde HSCs, de resultaten toonden aan dat de mRNA niveaus van BiP en CHOP significant verhoogd waren in DDRGK1-knockdown HSCs (Fig. 8b). Bovendien onderzochten we de eiwit niveaus van ER stress sensoren in de controle en DDRGK-knockdown Lineage-c-Kit+ BM cellen. In overeenstemming met de observatie in kanker cellijnen, toonde knockdown van DDRGK1 verminderde eiwit niveaus van IRE1α en p-IRE1α en een verhoogd niveau van p-PERK, terwijl de ATF6 niveaus niet verschilden in de controle en DDRGK1-knockdown groepen (Fig. 8c). Dienovereenkomstig was het niveau van XBP1s verlaagd in donor-afgeleide DDRGK1-knockdown LSK cellen (Fig. 8d). Al met al geven deze resultaten aan dat knockdown van DDRGK1 de IRE1α signalering verminderde, maar de PERK route activeerde en verder ondersteunt dat DDRGK1 kritisch is voor het juiste behoud van ER homoeostase en daardoor essentieel is voor de overleving en het onderhoud van HSCs.