Immunoblotting Procedures

Deze analysetechniek verloopt in de volgende stappen. Eiwitten worden over het algemeen op grootte gescheiden met behulp van natriumdodecylsulfaat (SDS) polyacrylamidegelelektroforese. Daarna worden zij overgebracht op een synthetisch membraan via droge, halfdroge of natte blottingmethoden. In het door een stroombron opgewekte elektrische veld migreren de met negatief geladen SDS omhulde eiwitten naar de positieve elektrode. Wanneer de eiwitten uit de gel migreren, worden ze gevangen op een membraan. Eiwitbinding aan het membraan is een onomkeerbaar mechanisme. Membranen kunnen van nitrocellulose, polyvinylideendifluoride (PVDF) of nylon zijn. Het membraan kan vervolgens worden geblokkeerd met serumalbumine of melkoplossing om niet-specifieke binding van antilichamen te voorkomen. Dit wordt gevolgd door sonderen met antilichamen die specifiek zijn voor het bestudeerde eiwit op het membraan, een methode die vergelijkbaar is met immunohistochemie, maar zonder de noodzaak van fixatie. Deze techniek maakt gebruik van de specificiteit die inherent is aan de herkenning van antigenen en antilichamen. De detectie wordt meestal uitgevoerd met behulp van chromogene of peroxide-gekoppelde secundaire antilichamen om een chromogene of chemiluminescente reactie te katalyseren.