Holometabolan insect relationshipの統合および単純化されたクラドグラム。 この研究で扱ったクレードのために選択された自己同形異義性を持つ。 トポロジーはデータセット1（すなわち完全なデータマトリクス）から推定されたMLツリーから取られたものである。 (1) ブートストラップサポート（BS）（下、黒）は、データセット1の72ブートストラップ複製（MREベースのブートストッピング基準）から得られたものである。 (2) 特定の系統関係のBS値（下、赤）は、7つの特定の決定的なデータセット1〜7からML樹の推論から導き出される。 (3)特定の系統関係の相対的支持値（上）は、7つの特定の決定的なデータセットとの4クラスタ尤度マッピング（FcLM）から導かれたものである。 また，同形異物は再構築された地上絵文字の全リスト（追加ファイル4，第5章参照）から選択した。

データセット1の解析により，ML樹形とFcLMの両方で，ヒメアブラムが残りのすべてのホロメタボラン目の姉妹グループとなった（表3，図1）。 この関係はすでに複数の遺伝子研究(e.g., )や全ゲノムデータに基づいて回復されていたが、限られた分類群しかサンプリングされていなかった。 また，形態学的データによる解析では，Beutel and GorbのHymenoptera + MecopteridaとBeutelらのHymenoptera + 残りのholometabolan ordersのような矛盾した結果も得られている． これらの分析において，多くの形態学的特徴系が収斂的に減少することによって生じるトポロジカル・アーチファクトの潜在的な問題については，Friedrich and BeutelおよびBeutel et al.が詳細に論じている。 また，ハチ目（Hymenoptera）が残りの全ホロメタボリック目の姉妹群であることから，ハチ目とネコ目（Mecopterida）の推定上の同型性（例えば，幼虫の単爪，成虫の硬い座板など）は実際には同型性であると考えられる。 その結果，ML樹形では最大支持，FcLMでは強い支持を受け，Neuropterida, Coleoptera, Strepsipteraからなる単系統が得られた（表3，図1）． NeuropteroideaはBeutelらではクレードとして支持されなかったが，多くの先行研究において単系統であることがわかった。 Neuropteridaの中では、我々のML解析はRaphidiopteraとNeuroptera + Megalopteraの姉妹グループ関係を最大限に支持し、これはFcLMの全四分位の2/3以上からも支持された（データセット4、表3、図1）。 神経翅目間の系統関係については、2つの代替仮説があり、論争が続いている。 ラフィディプテラ＋メガロプテラ単系統（例）、またはニューロプテラ＋メガロプテラ単系統（例）です。

データセット5の解析では、ColeopteraとStrepsiptera（Coleopterida）からなる可能性のあるクレードに関して、曖昧な結果が得られた（表3、図1）。 この長年の問題の解決は、内寄生虫であるストレプトピペラの極めて変化した形態（例えば、）および明確に派生したゲノムの特徴のために困難である（「ストレプトピペラの問題」、；「宇宙からの昆虫」、）。 また，最近の研究では，鞘翅目（Coleopterida）の単系統化を示す証拠が見つかっている（e.g., )。 しかし，分子データに基づく研究は，その結果が曖昧なままであった。 ColeopteridaはMcKennaとFarrellによって分析されたすべてのデータセットで支持されなかった . Wiegmannらの結果は比較的少数の遺伝子セットに基づくもので，このクレードに対する支持は弱いものであった。 Niehuisらはホロメタボロムシの全ゲノム塩基配列を解析し，Coleopteridaの支持を得たが，分類群のサンプリングに神経翅目は含まれなかった。 本研究では，ColeopteridaはMLツリーでは支持されるが，FcLM解析では支持されない（表3，図1）。 MLツリーでは，Strepsipteraは（McKennaとFarrellのツリーのように）Coleopteraの中に配置されているが，その関係はあまり支持されていない（Additional file 2: Figure S12）。 さらに、ML樹形図とFcLM解析の間の不整合がなくなるかどうか、異なるパーティションで異なるモデルを用いたパーティションML解析とFcLM解析を考慮して分析した。 分割された解析は、モデルのミススペックを減らし、一致したトポロジーを得ることができるかもしれない。 しかし、ML解析とFcLM解析の間の不一致は解消されなかった（表3、追加ファイル2、3）。 このことは、未分割の解析によるモデルのミススペックは、不一致の原因ではないことを示唆している（その中の議論も参照）。 このように，本研究のデータと解析手順では，Coleopteridaが単系統であるかどうかという疑問に対する明確な解答を得ることはできなかった。 しかし，形態学的な証拠から，Coleopteridaの単系統が最も妥当な結果であることは明らかである（関連記事）。

両翅目（鱗翅目＋三翅目）と反翅目（双翅目＋双翅目＋迷蝶目）からなるMecopteridaの単系統性を検証するために、2つの可能な仮説を考慮してデータセット6を2バージョン解析した（データセット6a、b；表2、3）。 どちらの解析でも、Mecopteridaの単系統が強い支持を得て回復した（表3、図1）。 HintonがPanorpoidea（またはpanorpoid complex）という名称で提案した単系統Mecopteridaは，KjerらとWiegmannらではあまり支持されず，Beutelらでは形態的特徴のベイズ解析で支持されただけであった（表3，図1）。 Niehuis らは全ゲノムデータに基づいてこのクレードを暫定的に支持したが，Neuropterida，Trichoptera，Siphonaptera，Mecoptera のゲノムはまだ解読されていないため，このデータセットでは Mecoptera 単系統に関する決定的な証拠が乏しい。 しかし，この仮説はこれまで真剣に議論されたことがないため，特別にデザインしたデータセットでは検証しなかった。

ML樹で最大のブートストラップサポートを示したAntliophoraの中で，MecopteraとSiphonapteraの姉妹グループ関係を発見し，同じく最大ブートストラップサポートとFcLMで最大サポートを得た（データセット7，表2，図1）。 この結果は，Beutel and Gorb, McKenna and Farrell, Wiegmannらの見解を裏付けるものであるが，後者の研究ではMecoptera + Siphonapteraのクレードはあまり支持されていない。 Beutel et al. (, see discussion therein)で検索されたDipteraとSiphonapteraの姉妹群関係は、我々の分析からは非常に低い。

本研究では、Nannochorista philpottiという1種のみがサンプリング対象であり、Mecopteraが単系統かどうかについては、貢献できていない。 しかし，形態学的データと9つの核遺伝子の解析から，メコプテラが確かに単系統群を形成していることが強く示唆された。

以上のことから，我々はHolometabolaの系統的バックボーンを確立し，最大支持の3つのメガ多様なクレードHymenoptera， Neuropteroidea， Mecopteridaがそれぞれ約13万5000，37万，30万種の記載種となったと推察された． このうち、NeuropteroideaとMecopteridaからなる明確な単位に対して、我々はAparaglossataという名称を提案する（図1）。 この名称は，このグループの最も顕著な形態的特徴の一つである傍脚類の消失に由来する（下記および表4参照）。

私たちがまとめた分子配列データセットと系統分析のデザインは、Holometabolaの系統に関する以前の研究に対して大きな相違点をいくつか示しています。 具体的には、i）イルミナ次世代シーケンサーで作成した膨大なデータを使用した（表1）。 ii）7つの研究課題ごとにデータセットを具体的に設計し、データセットの決定性を確保した（表2）（参照）。 Decisivenessとは、データセットに含まれるすべての遺伝子が、研究中の特定の系統関係に関連するすべての分類群の少なくとも1つの代表者によってカバーされていることを意味します。 従って、各データセットは、関連する分類群に関して、遺伝子の存在という点で100%のカバー率を持つ。 このように決定性を確保することで、欠損データによる誤解を招く可能性のある影響を軽減しています。 データ欠損は、支持率は高いが誤ったトポロジーを推論してしまう可能性がある（参照）。 これらの大規模データ行列に対応するため、RAxMLでFcLMを再実装し、それぞれの結果を2次元シンプレックス・グラフにマッピングするスクリプトを新たに書き、この手法を補完した。 系統樹のブートストラップサポートだけでは、非常に大規模なデータセットの解析では結論に限界がある。 FcLMは、データセット中の代替トポロジーをサポートする可能性を識別する方法、すなわち、系統樹では観察できないような不調和なシグナルを表示する方法である。 本研究は、FcLMを大規模な系統樹のスーパーマトリックスに適用した最初の研究である。 最後に、④すべてのデータセットで不正なタクサをチェックした。 不正な分類群とは、ブートストラップ樹のセットで複数の系統樹の位置を占める分類群のことである。 このような分類群は、例えばブートストラップコンセンサス樹を構築する際に、分解能や支持力を低下させます。 不正な分類群を取り除くことで、より情報量の多いブートストラップコンセンサスツリーが得られる可能性があります（Additional file 4, Chapter 4参照）。 今回紹介したようなデータセットのコンパイルでは（つまり、問題の系統関係の解決に貢献できる最大数の遺伝子を抽出することで）、推定されるトポロジーが、固有の系統シグナルに関して遺伝子を任意に選択したものに基づいていないことも確認された。 Dell’Ampioらは、データセットの決定的な要因によらない遺伝子の選択により、トポロジー的に異なる樹木が生成される可能性があることを示した。 さらに、Simonらは、異なる生物学的経路に関与する遺伝子が、特定の系統関係に対して異なるトポロジーを支持する可能性があることを示した。 したがって、数個から数個の遺伝子のセットだけを研究して推測される系統樹は偏りやすく、正しい種樹を反映していない可能性があると結論づけられる。 この問題に対処するための現時点での最良のアプローチは、潜在的に有益なデータを可能な限り含めることであるが、データセットにおける位相的不整合の要因をさらに解明する必要がある（参照）。

形態のみに基づく系統樹研究（例えば、）でも、問題のあるグループが得られる場合があった。 著者らは、主に特性複合体（例えば、飛行装置）の平行減少によって引き起こされる明らかなアーチファクトを取り上げ、議論した。 しかし、この問題は、手持ちのデータと分析手順では解決不可能であることが判明した。 私たちの分子データセットを用いて、ホロメタボラのほとんどの系統関係について、信頼できる解を提供することができた（図1、以上）。 表現型レベルでの進化を追跡するために、我々は現在利用可能な最も広範な形態学的データセットを用いた。このデータセットには、すべてのホロメタボラン目および慎重に選択したアウトグループ分類群の代表的な356文字が含まれている。 これらの形質データは、トランスクリプトームベースの系統樹にマッピングされた（詳細は「方法」のセクションを参照）。 この結果、多くの文字の進化的変化を追跡・解釈し、樹木のすべてのクレードについてパーシモンベースのグランドプラン再構築を行うことができた（後述の「ホロメタボラの中の進化」参照）。

ホロメタボラの進化

幼虫と発生

系統解析の結果、ホロメタボラの祖先幼虫は陸棲で、直顎で、中程度に単純化しているがはっきりとした複眼とよく発達した胸部脚を備えていたことが示唆されました。 腹部の前脚と頭蓋は存在しない（図2）。 筋系はおおむねよく発達していた。 触角や唇側端葉とそれに付随する筋肉が明瞭に単純化されているのは，ホロメタボラの幼虫の自家形態である。 図2