Bacterial isolation and RdFucI identification
Laminaria Japonica (Carbosynth, Compton, Berkshire, UK) から得たl-フコイダンを唯一の炭素源として含む培地で増殖したコロニーが韓国から採取されました（追加ファイル1：Fig.S1). 16S ribosomal RNAに基づく配列の同一性をNCBIデータベースと比較した結果、本菌はRaoultella属に系統的に近いことが判明した（Additional file 1: Fig.S1）。 このことから、本菌はRaoultella sp.KDH14と同定された。 7749>
RdFucI は595 個のアミノ酸からなり、分子量は65.5 kDa、等電点5.5であった。 基本局所アラインメント検索ツール（BLAST）の結果、RdFucIはRaoultella, Klebsiella, Citrobacterファミリーに属する他のl-FucIと高い配列同一性（> 90％）を示した。
同定したRdFucIをN末端にヘキサヒドロヒスタグをつけて大腸菌BL21（DE3）で過剰生産し、ヒスタグアフィニティクロマトグラフィーで精製したところ、その配列同一性は確認された。 7749>
RdFucI触媒反応はl-フコースの生成を促進する
RdFucIのアイソメラーゼ活性を調べるために、l-フコースまたはl-フクロースを基質として酵素反応を行った（図2）。 順反応（l-フコース→l-フキュロース）、逆反応（l-フキュロース→l-フコース）の酵素活性を測定した。 l-フコースからl-フクロースの生成は、薄層クロマトグラフィー（TLC）およびガスクロマトグラフィー/質量分析計（GC/MS）により確認した（Additional file 2: Fig.S2）。 l-フコースとl-フクロースの相互変換では、副生成物は観察されず、1つの基質から1つの生成物が得られることが確認された（Additional file 2: 図S2）。 したがって、実験的にl-フコースの量を測定して計算したl-フクロース濃度を用いることが妥当であると考える。
RdFucI による a l-fucose to l-fuculose (forward reaction) および b l-fuculose to l-fucose (reverse reaction)の酵素変換を示す。 酵素反応は、3μgのRdFucIと10mMのa l-フコースまたはb l-フクロースを出発基質として、1mMのMn2+存在下、20mMリン酸ナトリウム（pH7.0）中で30℃、10分間行った。l-フコース濃度は実験で測定し、全糖濃度（10mM）から実験で求めたl-フコース濃度を差し引くことにより、l-フクロース濃度を算出した。 実験データは3反復の平均±標準偏差を表す
逆反応は順反応より6.6倍速く、l-フコースに対する比活性（63.9 U/mg）はl-フコースに対する比活性（9.6 U/mg）より高い。 両反応とも、実験的に決定したl-フコースとl-フクロースの平衡比は約9:1であり、平衡定数(Keq)は0.11であった。 また、Keqの値は、平衡時の標準Gibbs反応自由エネルギー変化とKeqの熱力学的関係式、 \(mathop \Delta G^{ \circ } = – RTln K_{text{eq}}), ここでRとTはそれぞれガス定数（8.314 J/mol K）、温度（K）より理論上0.23と決定されていた。 \また、”Gibbs free energy change for the reaction of l-fucose to l-fuculose” (0.859993 kcal/mol) はデータベース BioCyc (https://biocyc.org) に記載されている標準的なGibbs自由エネルギー変化を示している。 Keqの実験値と理論値には若干の食い違いがあった。 Keq < 1は逆反応が有利であることを示している。 7749>
RdFucIの活性と平衡に対する温度とpHの影響
l-フクロースを基質として、温度10〜80℃、pH4〜11の範囲で酵素反応を行った（図3）。 RdFucIによるl-フクロースからl-フコースへの異性化反応は温度依存性が高く、30〜50℃で最大または最大に近い活性（最大値の80%以下）を示した（Fig. 3a）。 l-フコースからl-フキュロースへの異性化の平衡に及ぼす温度の影響を調べるため、最大または最大に近い活性（> 最大値の80%）を示した30、40、50℃での平衡比を調べた。 その結果、3つの温度間で平衡比に有意な差は見られなかった（l-fucose/l-fuculose = 9:1; p > 0.05）。 すなわち、試験したすべての温度において、約90％の収率でl-フクロースからl-フコースが合成された（Additional file 3: 図S3a）。
a温度とb pHがl-フキュロースに対するRdFucIの相対活性に与える効果。 酵素反応は、aは10〜80℃の範囲で様々な温度で、bは4〜11の範囲で様々なpHで行った。 使用したバッファーは、50 mM酢酸ナトリウム（pH 4, 5, 6）、50 mMリン酸ナトリウム（pH 6, 7, 8）、50 mM Tris-HCl（pH 7, 8, 9）、50 mM glycine-NaOH（9, 10, 11）である。 実験データは3反復の平均±標準偏差を表す
pH の影響を調べた。 RdFucIの活性はアルカリ性および中性に近いpH（pH9、10、11およびpH6、7、8）で高い活性（最大値の>70％）が観察された。 pH6以下では酵素活性は急激に低下し、pH4ではほとんど活性が観察されなかった。 アルカリ性条件下で高い比活性を示したにもかかわらず、平衡状態（60分インキュベーション）でのl-フコース収率はpH7（88％）よりもpH10（54％）ではるかに低かった（追加ファイル3：図 S3b）。 pH7、8、9での相対活性は、酢酸ナトリウムやグリシン-NaOHバッファーの活性よりもTris-HClバッファーの方がはるかに低く、TrisがRdFucIの酵素活性を強く阻害していることが示唆された。 本研究の先行する酵素実験は、酵素精製後の緩衝液交換段階から、1mMのTrisを含む反応混合液で行われてきた。 反応混合物中のTrisがRdFucIを阻害するかどうかを調べるために、1 mM Tris非存在下と存在下で行われた反応からの異性化活性を比較した（追加ファイル4：図S4）。 7749>
RdFucI活性に対する金属イオンの影響
l-フコースイソメラーゼを含む糖異性化酵素は、その異性化活性にMn2+やCo2+などの二価の陽イオンが補因子として必要である． そこで、RdFucIのl-フクロースに対する触媒活性に及ぼす二価カチオンの影響を調べるために、1 mMの各種金属イオンまたはエチレンジアミン四酢酸（EDTA）の非存在下および存在下で酵素活性を測定した（表1）。 金属イオンやEDTAに暴露していないネイティブなRdFucI酵素は低い活性を示し、EDTAによる金属キレートは酵素活性を低下させた。 試験した金属イオンのうち、Mn2+、Mg2+、Co2+、Cd2+、Zn2+は酵素活性を顕著に上昇させることが確認された。 特に、Mn2+の添加により、RdFucIの活性は最大で約7.4倍向上した。 一方、Ca2+、Cu2+、Fe3+はむしろRdFucIの活性を阻害した。
RdFucI
糖および糖リン酸アイソメラーゼは一般に種々の基質に広い特異性を有しており、その特異的な基質特異性は、糖および糖リン酸アイソメラーゼが、RdFucIの活性を向上させるのに重要な役割を果たす。 そこで、RdFucIがl-フクロースで示したケトース好塩基性活性が他の基質でも認められるかどうか、種々のアルドース糖（l-フコース、d-アラビノース、d-アルトロース、d-ガラクトース、d-マンノース、d-グルコース）およびそれに対応するケトース糖（l-フクロース、d-リブロース、d-プシコース、d-タガトース、d-フラクトース）について基質特異性の調査を行った(Fig. 4)． アルドースとケトース糖を含むこれらの基質の中で、ケトース糖であるl-フクロー ス（115.3 U/mg）とd-リブロース（127.3 U/mg）で最も高い活性が観察された。 また、RdFucIのl-フキュロースとd-リブロースに対する活性は、他の基質に対する活性と比較して非常に高かった。 アルドース糖では、l-フコースに対する活性が最も高く（21.0 U/mg）、他の基質の比活性は 4.7 から 7.9 U/mg の範囲であった。 l-フコースとd-リブロースを除くケトース糖は、0.0から10.8 U/mgの比活性を示した。 このように、RdFucIにとってl-フクロースとd-リブロースは好ましい基質であり、RdFucIのケトース好塩基活性はl-フクロースとd-リブロースでのみ示された。
Substrate Specificity of RdFucI.Fig.4.1,2,3,4に示したように、RdFucIはケトース好塩基性である。 酵素反応は10mMの様々なアルドースとケトース基質に対して、40℃、pH10で行った。 アルドース基質としては、l-フコース、d-アラビノース、d-アルトロース、d-ガラクトース、d-マンノース、d-グルコースが使用された。 ケトース基質には、l-フキュロース、d-リブロース、d-プシコース、d-タガトース、d-フルクトースを使用した。 実験データは3反復の平均値±標準偏差を表す
L-fuculose と d-ribulose を基質として運動パラメータを求めた（追加ファイル 5: Table S1）。 l-フキュロースのKm（ミカエリス定数）とkcat（基質の回転数）はd-リブロースのそれよりもそれぞれ1.9倍、1.2倍低い値であった。 RdFucIの触媒効率（kcat/Km）はd-リブロースの1.5倍であり、RdFucIはl-フクロースが基質として好ましいことが示された。 RdFucIの電子密度マップは、非対称ユニットの6つのサブユニットについて、Ser5-Arg591残基からよく定義されていた。 単量体のRdFucIは19個のα-ヘリックスと23個のβ-ストランドからなり、N1、N2、Cドメインを構成している（図5a）。 N1ドメイン（Ser5-Met172）はα/β-フォールドをとり、RdFucIの6量体形成の基質認識に関与している。 N2 (Lys173-Leu352) とC (Thr353-Arg591) ドメインには、触媒活性に関わる金属結合残基が存在する (Fig. 5a)。 非対称ユニットでは、RdFucIサブユニットはD3h擬似対称性を持つ三量体の二量体として配置された六量体を形成する（Fig.5b）。 これは、RdFucIが溶液中でホモ6量体として存在することを明らかにした分析サイズ排除クロマトグラフィーの結果（追加ファイル7：図S5）と一致する。
RdFucI 全体構造 a RdFucIモノマーの漫画表現． RdFucI単量体はN1-(黄色)、N2-(ピンク)、C-(緑)ドメインから構成されている。 b RdFucI6量体の表面図。 サブユニットA, B, C, D, E, Fはそれぞれ、黄色、ピンク、シアン、紫、緑、オレンジで色分けされている。 基質結合ポケット部位上の金属結合部位は赤い点で示した
6量体形成において、サブユニットA（総表面積：23011.7 Å2）が4種類のサブユニットB（界面残基：47/埋没表面積：1909.6 Å2）、C（58/1837.6 Å2）、D（42/1482.9 Å2）、E（34/1086.2Å2）と相互作用していることがわかった。 サブユニットAは残りのサブユニットFと相互作用しない(Fig. 5b)。 RdFucIのサブユニットAの埋もれた表面積は2569.1Å2であり、全表面積の27.45%に相当する。 この埋もれた界面は、59個の水素結合と26個の他のサブユニットからの塩橋を含む相互作用によって安定化されている（Additional file 8: Table S3, Additional file 9: Table S4, Additional file 10: Table S5, Additional file 11: Table S6）。
RdFucIの基質結合部位と活性部位
基質結合ポケットはサブユニットAのN2、CドメインとサブユニットBのN1ドメインで形成され（図6a-c）、ホモ六量体のRdFucIでは合計6個の基質結合部位を持っていた。 基質が接近する基質結合ポケットの入り口は約11×12.5Åである（Fig.6a）。 金属結合部位が形成される基質結合ポケットは、約4×5Åの負電荷面を持つ（図6b）。 金属結合部位と基質結合ポケットの表面との距離は約16.7Å（図6d）であり、活性中心がポケットの奥深くに位置していることがわかる。 このことは、基質の開鎖型と環状型の両方が活性部位の中心にアクセス可能であり、逆にバルクの糖質は基質結合ポケットの内部に存在する活性部位にアクセスできないであろうことを示している。
RdFucIの基質結合ポケットと活性部位。 a サブユニットA、Cによる集合で基質結合ポケットが形成されている。 b 基質結合ポケットの静電気的表面。 c 基質結合面のBファクター表示。 d 基質結合ポケットの断面図。 e 10 mM Mn2+を含む溶液に浸したRdFucIの金属結合部位の2Fo-F電子密度マップ（グレーメッシュ、1.0 σでコンター）。 f RdFucI
のMn2+結合部位の幾何学的解析RdFucIはエンジオール機構による異性化反応の触媒活性に二価の金属イオンを必要とする． RdFucIの金属結合部位は保存されたGlu337, Asp359, His528残基によってMn2+と配位しているはずである（Additional file 12: 図S6）。 しかし、基質結合に必須な金属であるMn2+との結合が疑われるFo-Fc電子密度マップ（> 5σでカウント）は存在しない（Additional file 13: Fig.） B-factor解析の結果、Mn2+の温度因子（70.53Å2）が、タンパク質の平均温度因子（36.22 Å2）から、Mn2+はRdFucI上に低占有率で存在することがわかった。 この結果は、ネイティブな酵素が低い活性を示すという生化学的解析の結果と一致するものであった。 一方、Mn2+の添加により、RdFucIの触媒活性は大幅に上昇した（表1）。 そこで、RdFucI結晶にMn2+を添加することで、Mn2+の結合占有率を高めることができると推測した。 RdFucI結晶を10 mM Mn2+溶液に浸したところ、金属結合部位に確実なFo-Fc電子密度（> 6σ）が観測され、すべてのサブユニットでMn2+の位置が明確になった（図6eおよび追加ファイル13：図S7b）。 しかし、Mn2+の温度B因子（76.56 Å2）はタンパク質全体の温度B因子（60.69 Å2）よりも高く、Mn2+イオンが金属結合部位にまだ完全に占有されていないことが示唆された。 Mn2+はGlu337のOE1原子（平均距離：2.62 Å）とOE2原子（2.65 Å）、Asp361のOD1原子（2.72 Å）とOD2原子、His528のNE2原子（2.52 Å）、および水分子（2.79 Å）によって配位されていた（Fig. 6e）。 Glu337(OE1)-Mn2+-Asp361(OD2), Glu337(OE1)-Mn2+-His528(NE2), Asp361(OD1)-Mn2+-His528(NE2) の平均結合角はそれぞれ 127.32°, 86.25°, 73.96° であった。 7749>
他のl-FucIとの構造比較
DALIサーバーを用いて構造的ホモログを検索したところ、Asp361(OD1)-Mn2+-His528(NE2)は127.32°、Mn2+-Mn2+は86.25°、Mn2+は73.96°であった。 この検索により、RdFucIはE. coli (EcFucI, PDB code 1FUI, Z score: 60.6, rmsd: 0.3 for 587 Cαs atoms), Aeribacillus pallidus (ApFucI, 3A9R, Z score: 56.3, rmsd: 2.4, rmsd: 0.3)のl-FucIsと類似することが判明しました。6, rmsd: 0.7 for 580 Cαs atoms）、Streptococcus pneumonia（SpFucI, 4C20, Z score: 55.9, rmsd: 0.7 for 585 Cαs atoms）であった。 基質結合ポケットを重ね合わせると、金属結合残基であるGlu337, Asp361, His528（RdFucIでは番号）は他のタンパク質と位置的に同じであるが、基質認識残基（Arg16, W88, Gln300, Tyr437, Trp496, Asn524）は側鎖にわずかにコンフォメーションの違いがあった（図7a）。 特に、基質結合ポケットの表面にある各l-FucIのα7-α8ループは、異なるコンフォメーションをとっている。 l-FucIの配列アラインメントは高い類似性を示したが、各l-FucIのα7-α8ループの配列は大きく変動していた（図7b）。 α7-α8ループは基質結合ポケットの構造形成に関与しているため、各l-FucIは固有の基質結合ポケットを形成する（図7c）。l-FucIは金属結合部位の周囲が共通して負に帯電しているが、基質結合ポケットの表面は異なる電荷状態を示している（図7c）。 その結果、α7-α8ループの構造の違いにより、l-FucIの基質特異性に違いが生じる。
RdFucI と他の l-FucI の構造上の比較。 RdFucIとEcFucI (PDB code: 1FUI), ApFucI (3A9R), SpFucI (4C20) のa活性部位とb基質結合面を重ね合わせた図。 c RdFucIとEcFucI、ApFucI、SpFucIとのα8-α9ループ領域の部分配列アラインメント d RdFucI, EcFucI, ApFucI, SpFucIの静電表面表現 深い基質結合ポケットとα8-α9ループ領域はそれぞれオレンジと黒の点線で示されている。 金属結合部位は黄色のアスタリスク
で示した。