Abstract

虚血性高血圧患者にHCIを投与すると心不整脈が促進される可能性がある． 本研究では，緑茶単体の利尿能とhydrochlorothiazideとの相互作用について検討した。 ラットに緑茶抽出物の高用量（500 mg/kg、p.o.）と低用量（100 mg/kg、p.o.）を単独群および相互作用群で30日間投与した。 標準、高用量、低用量相互投与群には、実験当日にヒドロクロロチアジド（10 mg/kg、p.o.）を投与した。 異なる処置の効果は、利尿作用、利尿活性、排泄された生理食塩水負荷の割合、尿中のナトリウムとカリウムの濃度を評価することによって、評価された。 緑茶は高用量でも低用量でも有意な利尿作用を示し、ヒドロクロロチアジドと併用すると、ヒドロクロロチアジド単独投与群と比較して有意な活性の向上が見られた。 緑茶抽出物とヒドロクロロチアジドを併用した場合、利尿活性が有意に上昇したと結論できる。 本研究の最も重要な観察は、併用により利尿作用が増加しても、尿中カリウム損失の減少に関与することである。 はじめに

水の排泄を促す利尿化合物は、うっ血性心不全、腎炎、妊娠中毒症、月経前緊張症、高血圧など、水腫を示す疾患を含むほとんどの疾患で潜在的に有用である。 現在使用されているチアジド系やループ利尿剤などの利尿剤は、電解質の不均衡や代謝の変化など様々な副作用を示す。 利尿剤の中には薬用植物に由来するものもあり、アーユルヴェーダ医学の体系に記載されている膨大な数の薬用植物、例えばAbelmoschus esculentus, Bacopa monnieri, Barbara vulgaris, Cissampelos pareira .

Diuretics, 特にHCTZ (Hydrochlorothiazide) が虚血性心疾患を持つ患者の高血圧管理に密着している。 チアジド系薬剤は尿中カリウムの喪失を増加させ、低カリウム血症の発生に関与する。 軽度あるいは中等度の低カリウム血症であっても、心血管疾患患者の罹患率および死亡率のリスクを高めることが報告されている 。 いくつかの研究では、利尿剤による低カリウム血症に伴う心室性異所性活動の著しい発生率が、突然死の原因であることが証明されています . サイアザイド系薬剤による血漿カリウム値とは別に、レニン-アンジオテンシン-アルドステロン系の活性化、特に、ミネラルコルチコイド受容体の刺激は、炎症プロセスや心血管疾患の進行における重要な決定要因である

緑茶は世界で最も飲まれている飲料の1つである。 テニア科に属するカメリアシネンシスの非発酵の葉から得られ、紅茶やウーロン茶よりも多くのカテキンを含んでいます。 カテキンを多く含むため、特定のミネラルやビタミンがこのタイプのお茶の抗酸化力を高める。 古来より、緑茶は中国伝統医学において健康に良い飲み物とされてきました。 最近の研究では、緑茶は心血管系疾患やある種のがんのリスク低減、口腔内の健康増進に寄与する可能性があると報告されています。 緑茶には、抗菌作用、抗ウイルス作用、神経保護作用、抗繊維化作用があります。 緑茶は太陽紫外線から保護し、骨密度を増加させることが報告されている

現在までに、緑茶の利尿効果を実証する研究は行われていない。 スリランカ紅茶の湯煎は潜在的な利尿作用があると報告され、カフェインの存在がその主な主要成分であると述べられています。

そこで本研究では、緑茶単独およびヒドロクロロチアジドとの併用による利尿作用の効果を評価するために設計しました。 化学物質

使用したすべての化学物質は分析グレードで、標準的な会社から購入したものである。 ヒドロクロロチアジドの純粋なサンプルはBangalore Test House (Bangalore, India)から提供されたものである。 生化学キットはCrest Biosystems (Goa, India)から購入した。 実験動物

4週齢の175-250gのいずれかの性別の健康なWistarアルビノラットをマンガロールのShree Devi College of PharmacyのAnimal Houseから入手した。 ラットはポリプロピレンケージに入れ、マンガロールのShree Devi College of Pharmacyの中央動物舎で、籾殻床を用いた標準的な条件（12時間L：Dサイクル、25°±5℃）で維持された。 動物には標準的なペレットフードを与え、精製した飲料水を自由に摂取させた。 インド政府社会正義・権力強化省動物実験管理監督委員会（CPCSEA）のガイドラインを遵守し、研究実施のために機関動物倫理委員会から事前の許可を得た（SDCP/IAEC-19/2012-13）

2.3. 植物材料

緑茶（Camellia sinensis）の葉は、2013年6月にマンガロールの地元市場からGREEN TEA（ケーララ州のVandiperiyarのNew hilltop tradersによって製造）というブランド名で購入された。 認証は、Dr. Neoline J. Pinto, H.O.D., Department of Botany, St. Agnes College, Mangalore (SAC/MNG/SMP/Drug/2013-06/52) によって行われた。 葉をハンマーミルで粉砕し、1mmメッシュのスクリーンを通過させた。 100グラムの葉を1リットルの蒸留水とともに70℃で10分間煮沸した。 加熱した溶液を濾過し、真空下で蒸発させ、凍結乾燥して、厚いグミの塊を得た。 収量は24.76%(W/W)であることがわかった。 抽出物の植物化学的評価

緑茶の水性抽出物を定性分析し、次の有機植物成分について調べた：アルカロイド、タンパク質アミノ酸、アントラキノン、フラボノイド、糖質、サポニン、タンニン、ステロイド、トリテルペノイドおよび心臓グリコシド（表1）。

＜1021＞ Table 1

2.5. 急性毒性試験

急性毒性試験はOPPTS（Office of Prevention, Pesticide and Toxic Substance）ガイドラインに従い、限界試験手順で実施した。

試験前にマウスを一晩絶食させ、3頭ずつ2群に分けた。 2g/kg体重および5g/kg体重の試験用量をいずれかのグループのマウスに経口投与し、72時間観察して死亡率を求めました。 最大安全量の10分の1の500 mg/kgおよび50分の1の100 mg/kgを高用量および低用量として設定した。 実験プロトコール

ラットを8匹ずつからなる以下の6群に分けた。 グループI：ビヒクル（1mL／kg、30日間p.o.）、グループII：ヒドロクロロチアジド（HCTZ）10mg／kg、実験当日にp.o.、グループIII：緑茶エキス（GTE）100mg／kg、30日間p.o.、グループIV：緑茶エキス（GTE）500mg／kg、30日間p.o.。 V群：緑茶抽出物（GTE）100 mg/kg、30日間＋HCTZ、VI群：緑茶抽出物（GTE）500 mg/kg、30日間＋HCTZ＜4461＞＜6226＞予防投与動物は、水を自由に与えて一晩絶食させた。 翌朝、生理食塩水25mL/kgを経口投与し、生理食塩水投与直後に、金網を有し目盛り付き試験管を装着した改造漏斗にラットを個別に入れた。 HCTZ投与群では，HCTZを25 mL/kgの生理食塩水で細かくホモジナイズした懸濁液として経口投与した。 その後5時間の間に排泄された尿を採取し，各ラットの総尿量を生理食塩水投与後の尿量と比較した． グループ内の各動物について5時間の間に排泄された尿の量を、投与した液体（通常生理食塩水）に対するパーセントで表す。 このパーセントは、動物の体重に依存しない尿の排泄量の指標を与える。 試験群における尿中排泄量と対照群における尿中排泄量の比は、与えられた薬物の投与量に対する利尿作用の指標として使用される。 利尿作用は変動しやすいため、代わりに利尿活性と呼ばれるパラメータを算出した。 利尿活性を得るために、試験群（緑茶抽出物）の利尿作用を標準群（HCTZ）と比較した。

生理食塩水の排泄率＝尿量／生理食塩水量×100.

尿中排泄量＝総尿量／総輸液量×100.

排尿率＝尿中排泄量／投与した生理食塩水量×100…

排泄率＝尿量／投与した生理食塩水の排泄量×100.

利尿作用＝投与群の尿中排泄量／対照群の尿中排泄量

利尿活性＝試験薬の利尿作用／標準薬の利尿作用

尿中のNa+及びK+量は自動分析装置で分析した

2.7. 統計解析

結果は平均値+/- SEMで表した。 統計的な有意性は、一元配置分散分析（ANOVA）とTukey-Kramer多重比較検定を用いて評価した。 結果

3.1. 植物化学的予備調査

緑茶水抽出物の植物化学的予備調査では、アルカロイド、フラボノイド、ステロイド、タンニン、タンパク質、アミノ酸、糖質、還元糖、脱酸糖が存在し、テルペノイド、サポニン、配糖体、アントラキノンが存在しないことが示された。 GTEの収率は24.76%であった。

3.2. 尿中電解質排泄に及ぼす影響＜5704＞＜2237＞3.2.1. 尿中ナトリウムイオン濃度に対する影響＜7945＞＜6226＞尿中ナトリウムイオン排泄量の正常コントロールに対する有意な増加がすべての投与群で認められ、HCTZ単独（、）またはGTEとの併用（GTE100＋HCTZ及びGTE-500＋HCTZではそれぞれ、、、）で最大排泄量となった。4461>

GTE-100+HCTZはHCTZ単独投与群に比べNa+イオン濃度が有意に（ ）増加したが，GTE-500+HCTZは有意に（ ）増加した（表2）（図1）．

Na+ 処置 電解質濃度（mmol/L） K+ Normal control HCTZ 120.82 ± 4.45*** 63.83 ± 2.29** GTE-100 71.39 ± 3.81** 51.29 ± 2.34 GTE-500 95.83 ± 3.56** GTE-100 + HCTZ 138.92 ± 3.83***# 51.92 ± 2.48 ± 3.193# GTE-500 + HCTZ 159.39 ± 4.39***# 46.52 ± 2.32## すべての値は平均±SEM、 , , 正常コントロールと比較した場合； , ヒドロクロロチアジドと比較した場合です。 GTE-100（緑茶抽出物、100mg/kg）、GTE-500（緑茶抽出物、500mg/kg）、HCTZ（ヒドロクロロチアジド、10mg/kg） 表2 尿中の電解質の排泄に対する作用。 図1 尿中の電解質排泄量に及ぼす影響。 値はすべて平均±SEM、 、、正常コントロールと比較した場合； 、ヒドロクロロチアジドと比較した場合。 GTE-100（緑茶抽出物、100mg/kg）、GTE-500（緑茶抽出物、500mg/kg）、HCTZ（ヒドロクロロチアジド、10mg/kg） 3.2.2. 尿中カリウムイオン濃度に対する影響 HCTZ投与群では正常対照群に比べ有意な尿中K+濃度の上昇を認めた。 GTE-100+HCTZではHCTZ群に比べ有意な（ ）が認められたが、GTE-500+HCTZでは（表2）（図1）有意な尿中K+濃度の減少が見られた（4461> 3.2.3. 生理食塩水排泄率及び利尿作用に対する影響＜7945＞＜6226＞全ての治療において、正常コントロールと比較して生理食塩水排泄率の有意な増加が認められた。＜4461＞＜6226＞GTE-500＋HCTZ治療群はHCTZ単独治療群と比較して生理食塩水排泄率及び利尿作用の有意な（）増加が認められた（Table 3）。 処置 排泄された生理食塩水のパーセンテージ利尿作用 正常コントロール 61.65 ± 2.92 1.34 – hctz 136.91 ± 4.39*** 3.10*** – GTE-100 86.28 ± 3.71* 1.89* 0.60 GTE-500 95.9 ± 0.05***、0.05%。34 ± 3.27* 2.35* 0.75 GTE-100 + HCTZ 147.19 ± 5.11*** 3.0 0.75 1.036*** 1.08 GTE-500 + HCTZ 161.64 ± 5.16***# 3.97***# 1.08***# 1.09 1.09 ± 5.09***# 1.09 ± 5.0928 すべての値は平均±SEM、 、正常コントロールと比較した場合；HCTZと比較してです。 GTE-100（緑茶抽出物、100mg/kg）、GTE-500（緑茶抽出物、500mg/kg）、HCTZ（ヒドロクロロチアジド、10mg/kg） 表3 パーセント食塩負荷排泄および利尿作用に対する影響 3.2.4. 利尿作用に対する影響 GTE-100およびGTE-500の利尿作用はそれぞれ0.60および0.75であったが、GTE-100+HCTZおよびGTE-500+HCTZでは1.08および1.0であることが分かった。4.考察 本研究の目的は、緑茶単独およびヒドロクロロチアジド（HCTZ）との併用による利尿作用の効果を検討することであった。 その結果、GTE（100および500 mg/kg、p.o.）は、いずれの用量においても有意な利尿作用を示したことが示唆された。 HCTZの利尿作用は、遠位尿細管に存在するNa+/Cl-シンポーター（コトランスポーター）を阻害し、Cl-結合部位と競合することにより、Na+の再吸収を阻害し、尿量を増加させることに関連している． 間接的には、HCTZの利尿作用は血漿量を減少させ、その結果、尿中カリウム損失、血漿レニン活性、アルドステロン分泌を増加させ、血清カリウムを減少させる。 GTE（100および500 mg/kg、p.o.）も、高用量および低用量の両方で、対照と比較して尿中Na+および利尿作用が有意に増加し、尿中のK+損失は有意ではなかった。 緑茶中の主要フラバノールとプリンアルカロイドがアンジオテンシン変換酵素（ACE）活性を抑制する役割を担っています。 緑茶は混合阻害機構によってACE活性を阻害する． ACEの阻害は、利尿作用と尿中Na+濃度の上昇を示す主な理由の1つである可能性があります。 それとは別に、緑茶は、炭酸脱水酵素の活性を阻害するために責任があります。 緑茶は、腎血流と心拍出量の増加により糸球体濾過量を増加させ、これが利尿作用に寄与している可能性がある。 本研究で得られた知見は、GTEの用量依存的な利尿作用の有意な増加によって、これらの事実を立証するものである。 GTEとHCTZの併用は、HCTZ単独投与群に比べ、利尿作用の増強が認められた。 その結果、GTE投与による有意なカリウムの喪失は認められなかった。 また、GTEを併用した群では、HCTZ単独投与群に比べ、有意にカリウムの喪失を抑制した。 GTEの抗炎症作用も利尿作用を示す一因と考えられる。 HCTZとともに低用量および高用量のGTEを投与した群では、Na+イオン排泄量の増加、生理食塩量の排泄率、利尿作用、利尿活性パラメータなど利尿能の著しい増大が認められた。 また、HCTZ単独投与群に比べ、併用投与群ではK+の損失が有意に減少していることが興味深い。 緑茶はHCTZによる低カリウム血症を抑制することができるため、この観察は非常に重要である。 さらに，緑茶併用群ではHCTZの有効性を用量依存的に増加させた． 結論＜4681＞＜6226＞本研究から、GTEとHCTZの併用により利尿作用が有意に増加することが結論付けられた。 本研究の最も重要な観察は、併用により利尿作用が増加するにもかかわらず、低カリウム血症の可能性を減少させる尿中カリウム損失の減少に関与していることである。 本研究は、虚血性高血圧患者において、HCTZの投与量を減らすことができ、GTE存在下で関連する副作用を最小限に抑えることができるため、有益であることが証明された。