背景情報

エレクトロポレーションによるDNAトランスフェクションは、おそらくすべての細胞型に適用できる確立した技術である。 高い頻度で安定した形質転換体が得られ、一過性の遺伝子発現の効率も高い。 エレクトロポレーションは、現在、様々な種類の組織にプラスミドDNAを生体内で送達するのに有効であることが示されている。 エレクトロポレーションは、細胞膜が電流を通さないコンデンサーとして機能することを利用している（イオンチャネルを除く）。 膜に高電圧の電場をかけると、膜が一時的に破壊され、高分子（およびATPなどの低分子）の出入りを可能にするのに十分な大きさの孔が形成される。 膜孔の再閉鎖は自然な崩壊過程であり、0℃では遅れる。

孔が開いている間、核酸が細胞内に入り込み、最終的には核に入ることができる。 末端が自由な線状DNAは組換え性が高く、宿主の染色体に組み込まれて安定した形質転換体が得られる可能性が高い。

高電圧電気ショックを用いてDNAを細胞に導入することは、WongとNeumannが線維芽細胞を用いて最初に行った(Wong and Neumann, 1982; Neumann et al., 1982)。 その後、この技術はすべての細胞型に一般化された（Potterら、1984）が、リンパ球のような、線維芽細胞とは異なり、他の手順（例えば。

Oliver Smithies たちは、エレクトロポレーション法を使用して胚性幹 (ES) 細胞に DNA を導入し、導入した DNA がゲノムの相同領域と再結合して、改変遺伝子または破壊配列を導入して特定の遺伝子を「ノックイン」「ノックアウト」した ES 細胞を生成できる標的ベクターを設計しました。 このES細胞を使って、ノックインマウスやノックアウトマウスを作製した。 エレクトロポレーション法は、相同組換えに関与しやすい裸の状態でDNAを細胞に導入するため、こうした遺伝子導入の応用に必要だったのである。 このエレクトロポレーションの拡張により、スミシーズ博士は2007年のノーベル医学・生理学賞を受賞することになった。 ES細胞のエレクトロポレーション法は、基本的に他の哺乳類細胞の場合と同じである。 相同遺伝子置換が望まれる場合、「ポジティブ・ネガティヴ」スクリーニングを可能にするベクターを設計しなければなりません。（Bronson and Smithies, 1994; Joyner 2000）1回目の選択では、エレクトロプレートDNAがゲノムに挿入された細胞をすべて回収し、2回目の選択では、DNAがランダムに挿入されたESクローンに対して行うようにします。 ノックイン／アウトマウスは、選択されたクローン化ES細胞を胚と融合させ、発育させるために再移植し、得られたキメラを繁殖させて、すべての細胞が改変遺伝子を保有するマウスを作製することによって作製される。 哺乳類細胞と同様に、植物プロトプラストは、様々な電気的条件下でエレクトロポレーションされ得る（critical parameters）。 低容量で高電圧（短いパルス時間）または高容量で低電圧（長いパルス時間）の両方が、遺伝子導入を成功させるために使用されてきた（Chuら、1991）。 In vivo EP は、もともと固形腫瘍に化学療法剤を送達するために利用され、前臨床研究から臨床試験へと進展した (Gothelf, et al., 2003)。 エレクトロポレーションを用いたプラスミドDNAのin vivo送達は、1990年代初期から中期に初めて報告され（Titomarov, et al., 1991; Heller, et al., 1996; Nishi, et al., 1996）、エレクトロポレーションによるin vitroトランスフェクションの成功および化学療法剤のような低分子の送達においてこの手順をin vivoでも安全に実行できるという実証に基づいて行われた、論理的進展であった。 プラスミドDNAの送達のためのin vivoエレクトロポレーションの使用は、実施される前臨床研究の数において驚異的な成長を遂げ、最近臨床に移された(Heller, et al., 2006a and Bodles-Brakhop, et al., 2009).

エレクトロポレーションの幅広い使用は、安全かつ使用が容易で、極めて再現性の高い結果をもたらす商用装置の入手によって大部分が可能になっている。 これらの装置の設計はかなり異なるが、パルス持続時間と電圧（細孔形成を支配する2つの電気的パラメータ）を制御する異なる手段を使用する2つの基本的なカテゴリーに分類される。 一つは指数関数的に減衰する電流パルスを発生させるコンデンサー放電方式、もう一つは真の矩形波（またはその近似値）を発生させる方式である。 コンデンサー放電装置は、内部のコンデンサーをある電圧に充電し、細胞-DNA懸濁液を通して放電させる。 コンデンサーのサイズと電圧は共に変えることができる。 電流パルスは、（1）初期電圧、（2）装置の容量設定、（3）回路（試料を含む）の抵抗の指数関数的に減少するので、電圧で蓄えられる電荷が多く（または少なく）なるようにコンデンサのサイズを変えると、減衰時間が長く（または短く）なり、その結果、有効パルス時間が異なることになる。 一方、矩形波発生器は、電圧とパルス幅の両方を固体スイッチングデバイスで制御する。 また、高速に繰り返されるパルスを生成することも可能です。 生体内の用途では、方形波発生装置が好まれます。

私たちのin vitroエレクトロポレーション実験のほとんどは、Bio-Rad Gene Pulser、コンデンサー放電装置を使用していますが、他のコンデンサー放電装置にも直接適用でき、矩形波発生装置には多少の調整が必要です。 コンデンサ放電装置は、GIBCO/BRL、BTX、Hoeffer Scientific、International Biotechnologiesからも入手できる（供給者のアドレスはAPPENDIX 4を参照）。 これらの装置は、単体または追加コンポーネントにより、ほとんどの用途に適した様々なエレクトロポレーション条件を提供することができます。 方形波発生器は、BTX、Baekon、CytoPulse Sciences、Sonidel、Bio-Rad、JouanおよびIGEAから入手でき、パルス幅の制御に優れ、複数の高速パルスを可能にし、非常に敏感で、さもなければトランスフェクトが難しい細胞に対してより有効であり得る。 生きている動物やヒトで遺伝子治療を行うためにエレクトロポレーションを使用するには、組織の損傷を最小限に抑えながら効率的にDNAを導入するために、エレクトロポレーションのパラメーターをうまくコントロールする必要があります。 ジェネレーターは、定電圧または定電流でパルスを投与することが可能です。 矩形波発生器の供給に加えて、in vivoエレクトロポレーションに適した電極もこれらのサプライヤーから入手可能です。 これらの機械は一般的に高価です。 100kHzの交流パルスが、エレクトロポレーションや、場合によってはエレクトロフュージョンに最も効果的な波形であることが明らかになってきた（Chang、1989）。 これらの実験では、2本針アレイ、キャリパー電極、鉗子電極などの市販の電極や、カスタムデザインの電極を使用した。 上記のように、エレクトロポレーション装置の主要な供給者は、様々な貫通電極と非貫通電極を用意している。 矩形波発生器は、生体内送達を行う際に特に重要なパルスパラメータの制御をより良くすることができます。 in vivoエレクトロポレーションの使用の増加は、筋肉への効果的な送達に直接関係しています。 エレクトロポレーションを用いた遺伝子の筋肉内導入は、ワクチン接種の目的で特に重要です(Abdulhagg, et al., 2008)。 筋肉はまた、遺伝子ベースのタンパク質補充アプリケーションのための優れたデポであることが実証されている（Trollet、ら、2006）。 筋肉への送達は、抗癌ワクチンの送達にも使用できる（Bodles-Brakhop、他、2009）。 皮膚への送達もまた、多用途の標的として受け入れられている。 皮膚への導入は、皮膚疾患の直接治療、全身治療のための循環へのタンパク質導入、がん治療、およびDNAワクチンの導入に使用できる（Hirao、他、2008年、Roos、他、2006年、Glasspool-Malone、他、2000年）。 しかし、リン酸カルシウムやDEAE-dextranを介したトランスフェクションに比べて、細胞やDNAが5倍近く必要になるのが欠点です(UNITS 9.1, 9.2 & 16.12)。 エレクトロポレーションとリン酸カルシウム共沈法の主な違いは、適切な抗生物質培地で選択した後の統合DNAの状態である。 リン酸カルシウムの場合、各トランスフェクション細胞のゲノムに取り込まれ統合されるDNAの量は3×106 bpの範囲である。 その結果、トランスフェクションされたDNAは、多くのコピーを含む大きなタンデムアレイとして統合されることが多い。 これは、レシピエント細胞にゲノムDNAをトランスフェクションし、悪性形質転換などの何らかの表現型の変化を選択したい場合に有利であり、ここでは、レシピエント細胞あたり大量のDNAが集積することが不可欠である。 一方、エレクトロポレーションは、レシピエント細胞あたり1～数コピーの挿入DNAになるように調整することができる。 これは、遺伝子発現を担う特定のコピーの識別を制御できるため、遺伝子発現研究にとって有利であり、上述のように、トランスジェニックマウスを作製するためにES細胞の遺伝子ターゲティングに不可欠である

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