Giardia lambliaへの感染は、世界中で最も多い下痢性疾患の原因の一つである(22)。 この原虫病原体は小腸に定着し、上皮に付着することはあるが、粘膜に侵入することはない。 この過程には、CD4 T細胞や分泌型免疫グロブリンA（IgA）、その他、十分に解明されていないエフェクターの生成が関与している（6, 8, 9, 18）。 下痢、腹痛、吸収不良、体重減少といった重篤な臨床症状がしばしば見られるにもかかわらず、感染は顕著な粘膜炎を伴わない(12)。 これらのことから、寄生虫による下痢には炎症性メディエーターが重要ではないことが示唆されるが、ジアルジア症の下痢を支配するメカニズムは十分に解明されていない。 ジアルジアは腸管液の吸収や分泌を阻害するようなエンテロトキシンを放出することは知られていない。 マウスにジアルジアを感染させると、上皮微絨毛の消失による吸収面の減少が起こり(16)、これが浸透圧による吸収不良を伴う下痢につながる可能性があるが、小腸の解剖学的予備能に比べれば、吸収面の絶対的減少量はわずかなものである。 G. lambliaに感染したヒトは、X線検査で腸の過動性の兆候を示すが(15)、この現象は実験的に感染したスナネズミでも観察される(5)。 これらの所見の基礎的なメカニズムや機能的な意義は、現在のところ不明である。 そこで、本研究の目的は、腸管運動過多がジアルジアに対する宿主防御機構であるという仮説を、ジアルジア症モデルマウスを用いて検証することである。
成体C57BL/6、SCID、neuronal nitric oxide synthase (nNOS) -deficient miceはThe Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) から入手した。 ジアルジア・ムリスの感染については、シストをショ糖浮遊で精製し、位相差顕微鏡下で血球計数し、0.2ml中104シスト/マウスで水中経口投与した(9)。 G. lamblia感染症については、GS/M株（ATCC 50580）（11）の栄養体をTYIS-33培地で培養し、同培地0.2ml中に107個/マウスで経口投与した（9）。 小腸運動は修正テストミール法により測定した。 マウスを一晩絶食させ、106個の蛍光性ポリスチレンビーズ（直径10-μmのフルオレスブライトYGカルボキシレートミクロスフィア；ポリサイエンス社、ワリントン、ペンシルバニア）（19）およびリン酸緩衝食塩水（PBS）中の5％アラビアゴム中の6％カルミン色素の懸濁液を0.2ml投与した。 20分後、小腸を急速に取り出し、カルミン色素の前面の位置と小腸の全長を記録した。 次に腸を8等分し、それぞれを縦に開き、2 mlのPBSに入れ、氷上で10分間冷却した。 この混合物を激しく振って栄養体およびビーズを剥離し、位相差顕微鏡および蛍光顕微鏡を用いてそれぞれ別々に計数した。 カルミン染料フロントの移動距離は、小腸の全長に対するパーセンテージで表した。 セグメントごとのビーズ数は、小腸内のビーズ総数に対するパーセンテージで表した。 小腸運動阻害が腸管クリアランスに及ぼす影響を評価するため、まずマウスをG. murisまたはG. lamblia GS/Mに経口感染させ、それぞれ7日目または4日目から隔日に、30 mg/kgのロペラミドまたはコントロールとしてのPBSを経口投与した。 G. murisは21日目に，G. lambliaは9日目に小腸栄養体数を測定した。
ジアルジア感染制御における腸管運動の役割を調べるのに，正常成体マウスが適切なモデルであるかどうかを調べるため，8～10週齢のC57BL/6マウスに自然発生のマウス病原菌G. murisの嚢子を感染させた． 小腸の運動性は、液相マーカーとしてカルミン色素を用い（14）、ジアルジア栄養体に匹敵する大きさの微粒子マーカーとして10-μmポリスチレンビーズを用いて試験食法で測定した（19）。 G. murisの感染により小腸通過が促進され、カルミン色素（Fig. (Fig.1A)1A） とポリスチレンビーズ（Fig. (Fig.1B)1B） の両フロントが非感染マウスに比べ有意に遠くまで移動していた。 この現象を時間経過で解析すると、感染後1週間以内に運動過多が起こるが、2〜3週間でピークに達し、1週間の最大感染時の数に比べて栄養体数が減少していた（図（Fig.1A）.1A）。 このように、小腸運動性の最大変化は栄養体量のピークに対して遅れており、これらの変化は直接的な腸管刺激以外の機序で生じる可能性が示唆された。
G. murisの野生型マウス感染による小腸運動性亢進の誘導． (A）成体C57BL/6マウスにG. murisシストを104個経口感染させた（1〜4週目）、または感染させないままコントロールとした（0週目）。 感染後，指定の時期に小腸の運動量（-）と栄養体量（○）を調べた． 運動性データは、20分間の小腸全体の長さに対するカルミン色素を含む試験食の移動距離で示した。 数値は4〜7匹の結果の平均値±標準誤差（SEM）である。 アスタリスクは、非感染対照に対する運動性の有意な（P < 0.05、t検定）増加を表す。 (B) G. murisに2週間感染したマウス（空の棒）および非感染対照（塗りつぶした棒）に10-μm蛍光ポリスチレンビーズを含む試験食を与え、20分後にビーズの通過性を評価した。 等しい大きさの8つの小腸区分（近位十二指腸から遠位回腸の順に番号が付けられている）それぞれにおけるビーズ数は、小腸内のビーズ総数に対するパーセンテージで示されている。 非感染マウスと感染マウスの胃内の残留ビーズ数の間に有意差は認められなかった（それぞれ14.2%±5.7%対18.5%±3.4%）。 数値は6～7匹の平均値±SEM。 アスタリスクは非感染マウスに対する有意な（P < 0.05, t test）増加を表す。
この所見は、宿主適応免疫応答が原因と判明したジアルジアによる腸管上皮微絨毛の喪失の報告を想起させる（16, 17）。 小腸の運動機能亢進に同様の機構が関与しているかどうかを調べるため、重症複合免疫不全マウス(SCIDマウス)を評価した。 これらのマウスは、正常なV(D)J組み換えに必要なDNA依存性プロテインキナーゼの触媒サブユニットPRKDCの欠損により、機能的なT細胞とB細胞を欠き、ジアルジアを撲滅できない（9, 18）。 G. murisのSCIDマウスへの感染は小腸通過性を変化させず、免疫不全のコントロールでの観察結果と大きく対照的であった（図（Fig.2）.2）。 これらの結果は、ジアルジア症に関連した小腸運動過多が、病原体に対する正常な適応免疫応答の誘導に依存していることを示している。
Dependence of intestinal hypermotility on intact T- and B-cell functions.Induced in the SCID mice. 成熟C57BL/6（野生型）およびSCIDマウスにG. murisシストを経口感染させるか、または感染させないままコントロールとし、感染2週間後に小腸運動（A）および栄養体数（B）を評価した。 数値は4〜6匹の平均値±SEMである。 アスタリスクは、非感染対照と比較して有意な増加（P < 0.05, t検定）を示す。
観察された小腸運動過多がジアルジアのクリアランスに寄与するかどうかを調べるために、消化管のμ-オピオイド受容体を活性化して腸の通過を阻害する薬剤であるロペラミドでマウスを処理した（2, 13, 21）。 薬理学的に誘導された運動量の変化が感染の初期確立を妨げないように、G. muris感染のピーク時（7日目）に薬物治療を開始した。 ロペラミドによる小腸運動の阻害は、鞭毛虫のクリアランスを著しく損ない、21日目にロペラミド投与マウスではPBS投与対照に比べ25倍高い栄養体数が認められた（図（3）3）。 腸管粘膜分泌物中の抗ジアルジアールIgAの力価に影響がなかったことから、ロペラミド投与は適応免疫の発達に影響を及ぼさなかった（データ未掲載）。 さらに、この実験戦略は、正常成体マウスに感染可能なヒトのジアルジア病原体であるG. lamblia GS/Mのマウス感染に対しても同様の抑制効果を示した（3, 9）。 PBSで処理したマウスは9日目までに感染がほぼ治まったが、4日目以降にロペラミドで処理したマウスは小腸内に相当数のG. lamblia栄養体を保有し続けた（図（3）.3）。 このように、小腸の運動阻害は、ジアルジアの種類に関係なく、マウス宿主におけるジアルジアのクリアランスを損なうものであった。 抗ジアルジア宿主防御における腸管運動の重要性を明らかにするための追加的アプローチとして、nNOSの遺伝子を破壊することでマウスの腸の有効推進力を阻害する遺伝学的アプローチを用いた（20）。 運動解析の結果、nNOS欠損マウスは野生型同腹子に比べ、構成的に消化管通過が遅れることが確認された（図(4A).4A）。 並行して、ノックアウトマウスはG. lamblia感染を正常に除去することができなかった（Fig. (Fig.4B).4B). このように、薬理学的および遺伝学的アプローチを用いて、腸管運動の低下がジアルジアに対する宿主防御の障害と関連していることを見出した。
腸管運動の薬理学的阻害はジアルジアのクリアランスを損なう。 成体C57BL/6マウスに104個のG. murisシストまたは107個のG. lamblia GS/Mトロフォゾイトを経口感染させた。 7日後（G. muris）または4日後（G. lamblia），マウスにロペラミド（Lop）またはPBSを1日おきに経口投与し，G. murisまたはG. lambliaが腸管に到達するのを観察した． 小腸内の栄養体数は、感染後、指定された時間に測定した。 数値は8〜10匹の平均値±SEMである。 *1910>
nNOS欠損マウスは、消化管通過性の低下およびジアルジア感染に対する感受性の増大を示す。 (A）nNOSを欠損した成体マウス（nNOS-/-）とその野生型同腹のコントロール（WT）は、カルミン色素試験食を用いて消化管運動について試験された。 数値は少なくとも3匹の動物の平均値±SEMである。 *, P < 0.05 (t test)、野生型マウスの結果に対して。 (B）マウスにG. lamblia GS/Mの107個栄養体を経口感染させ、感染後指定された時間に小腸の栄養体数を測定した。 数値は3〜4匹の平均値±SEMである。 *1910>
我々の研究は、腸の過敏性がジアルジアに対する重要な宿主防御であることを示しており、この結論は最近の別の報告（10）でも得られている。 この防御は、T細胞やB細胞を欠くマウスでは発生しなかったことから、寄生虫に対する正常な適応免疫反応の発達に依存していると思われるが、原理的には、T細胞やB細胞が抗ジアルジア免疫の適応的役割とは無関係に運動低下に寄与している可能性がある。 免疫依存性の運動機能亢進は、他の腸管寄生虫、特に蠕虫に対する宿主防御に作用する。 例えば、ライフサイクルの大部分を小腸で過ごす回虫Trichinella spiralisの駆除は、腸管運動の亢進と高い相関がある(4, 23)。 同様に、ラットにおける鉤虫Nippostrongylus brasiliensisの排出は、小腸運動亢進を伴い、この蠕虫に対する宿主防御の役割を示唆している（7）。 これらの腸管病原体に共通しているのは、排他的ではないにせよ、主に腸管内腔に局在していることである。 解剖学的に見ると、この感染部位は上皮で覆われた体の外側にあり、したがって、体内で有効に働く好中球や補体のような多くの免疫エフェクター細胞や分子が容易にアクセスできる場所ではない。 実際、腸管内腔における効果的な抗菌防御は、この部位での防御のレパートリーが限られている宿主にとって、特別な挑戦となる。 このうち、分泌型IgAは腸管内環境の防御機構としてよく知られているが、その重要性は宿主や寄生虫の要因によって異なるようである(6, 9, 18)。 我々のデータや蠕虫に関する先行研究 (4, 23) は、腸管運動過多が腸管内腔のコロニー形成に対する別の重要な防御機構であることを示している。
免疫依存性の運動過多は、先行報告 (5, 15) で指摘したように、ジアルジア症に伴う下痢の機構的説明になり得る。 原理的には、下痢は体液吸収の低下、分泌の増加、またはこれら2つのメカニズムの組み合わせによって引き起こされる可能性がある。 ジアルジア症においてイオンおよび体液の分泌が促進されることを示す証拠はほとんどなく、体液の吸収障害が有力な原因として残されている。 摂取された、あるいは胃や膵臓の分泌物に由来する内腔液との接触時間が短くなると、上皮を介したイオン輸送の有効性が損なわれると予想され、特に運動性の低下と吸収性の上皮表面の損失が報告されている場合はそうである (16)． しかし、マウスはジアルジアに感染しても素直な下痢を示さないことに注意しなければならない。 それにもかかわらず、腸液の不均衡がヒトと動物の両方の宿主で起こり、それがマウスでは代償されるが、ヒトでは代償されないという可能性がある。 もし、運動機能亢進が本当に下痢の病因に寄与しているとすれば、SCIDマウスがジアルジアによる運動機能亢進を示さないという我々の発見は、ジアルジア感染に対する感受性を高める細胞性免疫不全（例えば、慢性可変免疫不全）の患者は、感染関連下痢を起こしにくいかもしれないということを示唆していることになろう。 さらに、今回の結果から、ジアルジアによる下痢の治療において腸管運動阻害剤の使用を検討する場合、その治療が基礎となる感染を長引かせる可能性があるため、注意が必要であることが示唆された（1）＜1910＞。