Photobleaching

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FRAP は、膜外のタンパク質をモニターするためにも使用できる。 目的のタンパク質をGFP融合タンパク質として発現させ蛍光性を持たせた後、共焦点顕微鏡を用いて、細胞質、有糸分裂紡錘体、核、あるいは他の細胞構造の領域を光退色させてモニターする。 そして、その領域の平均蛍光を光退行からの時間に対してプロットし、その結果得られた曲線から、タンパク質の結合反応やモニターされている媒体中でのタンパク質の拡散係数などの運動係数を算出することができる。 多くの場合、拡散と結合・脱離の相互作用のみが考慮されるが、原理的にはタンパク質は流動的にも動くことができる。 これは、細胞質または核形質の流動、あるいは分子モーターによる微小管のような細胞内のフィラメントに沿った輸送による可能性がある。

蛍光回復が、白化領域への拡散速度または白化領域内の結合部位から脱着して蛍光タンパク質に置換される速度によって制限される場合、分析は最も簡単である。 生きている細胞で GFP 融合タンパク質を漂白する一般的なケースを例に、この 2 つの限界を見てみましょう。

w

と拡散が支配する回復では、蛍光はSoumpasisによって導かれた方程式（修正Bessel関数I 0 {displaystyle I_{0}} を含む）で説明される。

I_{0}

と I 1 {displaystyle I_{1}} がある。

I_{1}

) f ( t ) = e – 2 τ D / t ( I 0 ( 2 τ D / t ) + I 1 ( 2 τ D / t ) )である。 {displaystyle f(t)=e^{-2tau _{D}/t}left(I_{0}(2tau _{D}/t)+I_{1}(2tau _{D}/t)\right)}

{displaystyle f(t)=e^{-></displaystyle2tau _{D}/t}left(I_{0}(2tau _{D}/t)+I_{1}(2tau _{D}/t)\right)}

with τ D {displaystyle \tau _{D}} {tau_{D}} {2tau _{D}} {tau_{D}}/t}Line

Tau _{D}

は拡散の特性タイムスケール、t {displaystyle t} は

t

は時間。 f ( t ) {displaystyle f(t)} .

f(t)

は規格化蛍光（t {displaystyle t}

t

goes to infinityで1になる）である。 半径wの白化したスポットの拡散タイムスケール{{displaystyle w}} は

w

は τ D = w 2 / ( 4 D ) {displaystyle \tau _{D}=w^{2}/(4D)}} となる。

{displaystyle \tau _{D}=w^{2}/(4D)}

, Dは拡散係数です。

なお、これはステップ関数プロファイルを持つ瞬間的な漂白の場合であり、すなわち、フラクションf b { {displaystyle f_{b}} の場合である。

f_{b}

時間t = 0 {displaystyle t=0} で瞬時に漂白されると仮定したタンパク質の場合

t=0

は f b ( r ) = b , r < w {displaystyle f_{b}(r)=b,~~r<w} となる。

{displaystyle f_{b}(r)=b,~~rw}

, and f b ( r ) = 0 , r > w {displaystyle f_{b}(r)=0,~~r>w} …

{displaystyle f_{b}(r)=0,~~rw}

, for r {displaystyle r}.

r

は白化領域の中心からの距離である。 また、回復は2次元の拡散によってモデル化され、それも均一かつ等方的であると仮定する。 言い換えれば、拡散は均一な媒体中で起こっているので、有効拡散定数Dはどこでも同じであり、拡散は等方性、すなわち平面内のすべての軸に沿って同じ速度で起こるということである。

  1. 漂白は瞬間的なものではありません。 特に、広い面積の強力な漂白が必要な場合、漂白には拡散タイムスケールτ D {displaystyle \tau _{D}}のかなりの部分がかかることがある。
    tau _{D}

    . そうすると、漂白されたタンパク質のかなりの部分が、漂白中に実際に漂白領域から拡散することになる。 これを考慮しないと、Dに大きな誤差が生じます。

  2. 漂白プロファイルは放射状のステップ関数にはなりません。 漂白されたスポットが事実上1ピクセルである場合、位置の関数としての漂白は通常回折限界となり、使用される共焦点レーザースキャン顕微鏡の光学系によって決定されます。 これは半径方向のステップ関数ではなく、平面に垂直な軸に沿って変化します。
  3. もちろん細胞は、漂白されたボリュームと同様に、2次元ではなく3次元です。 平面（ここではxy平面とする）の外への拡散を無視することは、蛍光がこの平面内の拡散によって主に回復する場合にのみ、妥当な近似となる。 例えば、円筒形の体積をz軸に沿って漂白し、この円筒形の体積が細胞の全高を貫く場合、これが当てはまる。 この場合、すべてのタンパク質はz軸に沿って一様に漂白されるため、z軸に沿った拡散は蛍光回復の原因にならず、Soumpasisの式のように無視しても無害である。 しかし、もしz軸に沿った拡散が蛍光回復に寄与するのであれば、それを考慮しなければならない。
  4. 細胞の細胞質または核質が完全に空間的に均一または等方的であると期待する理由はない。

したがって、Soumpasisの式は、上記の仮定が真の状況に対する良い近似であり、蛍光の回復が拡散の時間スケールτ D {displaystyle \tau _{D}}によって実際に制限されている場合に使用できる、有用な近似値に過ぎない。

Tau _{D}

. Soumpasisがデータに十分適合できたからといって、必ずしもその仮定が正しく、拡散が回復を支配しているとは限らないことに注意されたい。

Reaction-limited recoveryEdit

時間の関数としての蛍光を記述する方程式は、別の限界において特に単純である。 多数のタンパク質が小さな体積の部位に結合して、そこで蛍光シグナルが結合したタンパク質からのシグナルによって支配され、この結合がすべてオフ率koffの単一状態であれば、時間の関数としての蛍光は

f ( t ) = 1 – e – k off t {displaystyle f(t)=1-e^{-k_{text{off}}t}} によって与えられる。

{displaystyle f(t)=1-e^{-K_{Text{off}}}

Note that the recovery depends on rate constant for unbinding, koff, only. それは結合のためのオン率に依存しない。 これは多くの仮定に依存するが、

  1. 結合したタンパク質の局所濃度が遊離タンパク質の局所濃度を大きく上回るためには、オンレートは十分に大きくなければならず、したがって、遊離タンパク質のfへの寄与を無視することができるようになる。
  2. 反応は単純な二分子反応であり、タンパク質は局所的な部位に結合し、回復時には大きく移動しない
  3. 交換は拡散（または移動性の原因となる輸送メカニズム）よりはるかに遅く、そのときだけ拡散する画分が急速に回復し、結合して漂白したタンパク質と置き換わり、蛍光を増大させる蛍光タンパク質の源として作用するからである。 rを漂白スポットの半径とすると、この式は結合寿命1 / k off > r 2 / D {displaystyle 1/k_{text{off}}>r^{2}/D} のときだけ有効であることを意味する。
    {displaystyle 1/k_{text{off}}r^{2}/D}

    .

これらの仮定がすべて満たされれば、回復曲線に指数を当てはめるとオフ率定数koffが求まることになります。 しかし、他の力学では指数関数に似た回復曲線を与えることがあるので、指数関数に当てはめたからといって、必ずしも回復が単純な二分子反応に支配されているとは限らない。 結合解除によって速度が決まる回復と拡散によって制限される回復を区別する一つの方法は、結合解除によって制限される回復の回復速度は白化領域の大きさrに依存せず、r – 2 {displaystyle r^{-2}} としてスケールすることに注目することである。

r^{-2}

, 拡散限界回復の場合である。 したがって、小さい面積と大きい面積を漂白した場合、もし回復が結合解除によって制限されるなら、回復速度は2つの大きさの漂白面積で同じになり、拡散によって制限されるなら、大きい漂白面積ではるかに遅くなる。

Diffusion and reactionEdit

一般に、蛍光の回復は単純な等方拡散や単一の単純な結合解除速度に支配されることはないでしょう。 拡散と結合の両方があり、実際、拡散定数は空間的に一様ではなく、複数のタイプの結合部位が存在し、これらの部位も空間的に一様でない分布を持つ可能性があります。 また、流動過程も重要かもしれない。 このような複雑な挙動は、データを記述するためにいくつかのパラメータを持つモデルが必要であることを意味する。単一の拡散定数Dまたは単一のオフ速度定数koffのどちらかのみを持つモデルは不適当である

拡散と反応の両方を持つモデルも存在する。 残念ながら、単一のFRAP曲線は、（おそらくノイズの多い）実験データに確実かつ一意に適合させるのに十分な証拠を提供しない場合がある。 Sadegh Zadehらは、FRAP曲線が拡散定数とオンレート定数の異なる値の組によって適合されうること、言い換えれば、FRAPへの適合が一意でないことを示した。 これは、3パラメータ（オンレート定数、オフレート定数、拡散定数）のフィットにおけるものである。

このように、多くのパラメータを持つモデルでは、1回のFRAP実験では、すべてのモデルパラメータを推定するには不十分な場合がある。 その場合、例えば異なるサイズの領域を漂白したり、いくつかのモデルパラメータを独立して決定するなどして、より多くのデータが必要となる

。

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