高速タンパク質液体クロマトグラフィー（FPLC）と高速液体クロマトグラフィー（HPLC）：二つの液体クロマトグラフィー法を直接比較したものです。 この記事では、特にそれぞれの分析対象物の要件に重点を置いて、2つの手法の違いについて説明します。

高速タンパク質液体クロマトグラフィー（FPLC）と高速液体クロマトグラフィー（HPLC）という名前は、これらのクロマトグラフィー法の違いを示すヒントを与えています。 HPLCが高圧で小さな化学物質を分析するのに対し、FPLCはタンパク質やDNAのような大きな生体分子を精製します。 生体分子は、高温、高圧、HPLCで通常使用される溶媒に耐えられないため、クロマトグラフィーは非常に難しく、繊細である。 これらの理由から、生体分子の分離にはHPLCに代わるアプローチが必要です。

高速タンパク質液体クロマトグラフィーには、バイオクロマトグラフィー、バイオセパレーション、バイオ精製など、いくつかの用語が一般に使用されています。 この特殊なクロマトグラフィーは、タンパク質、ヌクレオチド、ペプチドなど、数キロダルトン（kDa）の大きな生体分子を精製するために適用されます（図1）。 FPLCを使用するユーザーの目的は、できるだけ純粋でネイティブな生成物を得ることである。 一方、従来のHPLCの目的は、分析対象物、通常は数原子から約3000 Daまでのサイズの小さな化合物を同定し定性することです。

細胞抽出物から純粋なタンパク質を得るための課題

一般に、生体分子はタンパク質、DNA、RNAおよび細胞膜で満たされた細菌または真核細胞から精製されます。 したがって、細胞抽出液から目的のタンパク質を精製することは、非常に困難なことです。 生化学者はいくつかのトリックを用いる。一つは、細胞で過剰発現させたリコンビナントタンパク質を使用することである。 目的のタンパク質を過剰に発現させることで、より大量に精製することができる。 もうひとつは、目的のタンパク質にタグを付け、それを樹脂（カラム材）に特異的に認識させることである。 タグのないタンパク質はカラムに結合せずすぐに溶出するが、目的のタンパク質は濃縮され、容易に分離できる。

生体分子は細胞の溶解液から精製されるので、分析用HPLCよりもはるかに大きなサンプル量となる。 したがって、より大きなサンプルループ、あるいはより高い流速のポンプがサンプルの注入に使用される。 また、FPLCとHPLCではカラムの材質が全く異なります。 HPLCでは、粒子径が非常に小さく、高圧に対する抵抗力が大きいシリカビーズが適用されるが、FPLCでは、ほとんどのメソッドで粒子径の大きなアガロースやポリマー材料が必要とされる。 FPLCに使用される樹脂はシリカビーズほど圧力に安定ではなく、気泡に非常に敏感であるため、FPLCに使用される樹脂は、シリカビーズと同じように気泡の発生を抑えることができます。 さらに、カラムの材質だけでなく、カラムのハードウェアも異なる。 古典的なHPLCでは、耐圧性のあるステンレス製カラムが使用されます。 すでに述べたように、FPLCでは圧力安定性は重要ではないので、透明で生体適合性の高いガラス製カラムで作業することが可能である。

多様な生体分子、多様な精製方法

カラム材料の違いは、分析法にも反映されます。 分析用HPLCでは、疎水性固定相と極性移動相を用いた逆相クロマトグラフィーが選択されるが、FPLCでは、より多様な方法が適用される（図2）。 FPLCでは、分子の大きさによって分離するサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）がその一つである。 小さな分子はビーズの孔の中に拡散し、大きな分子はほとんど保持されずにカラムを通過する。 小さい分子はカラムから遅れて溶出し、分子のサイズに応じた勾配が形成されます。 もう一つの分離法は、イオン交換クロマトグラフィーです。 生体分子は、緩衝液のpHに依存する特異的な電荷によって分離・精製される。 タンパク質の電荷が高いほど、反対側の電荷を持つ樹脂とよく結合する。 タンパク質をカラムから溶出させるために、溶出中に塩イオンの濃度を上げる。 塩イオンはタンパク質と樹脂への結合を競合する。 もう1つの重要なFPLC法はアフィニティークロマトグラフィーで、目的の分子がカラムに特異的に結合し、他の分子は結合せずに溶出するものである。 ここでは、目的の生体分子を認識する特殊な媒体を持つカラムが使用される。 アフィニティークロマトグラフィーの特殊な形態として、固定化金属イオンアフィニティ（IMAC）があります。 目的のタンパク質は、通常6つのヒスチジンからなるタグをタンパク質に付加することによって、遺伝的に変化させる必要がある。 IMAC樹脂はこの “Hisâtag “を特異的に認識する。 Hisタグを持つタンパク質と競合するイミダゾールの濃度を上げることで溶出が行われる。 また、疎水性相互作用分離法を用いると、タンパク質の疎水性を利用した分離も可能です。 樹脂は最も疎水性の高いタンパク質が最も強くカラムに結合するように構成され、塩勾配を減少させることで溶出される。 最初のステップ、いわゆる「捕獲」ステップでは、粗抽出物からタンパク質が精製される。 この精製には、通常、アフィニティークロマトグラフィーが用いられる。 第2段階の「中間体」では、イオン交換クロマトグラフィーや疎水性相互作用により、さらなるコンタミネーションを除去する。 最後の「研磨」工程では、通常サイズ排除クロマトグラフィーを用いて、残存するすべての不純物を除去し、高純度の製品を得ることを目的としている。 このタンパク質の精製方法は、特定の生体分子に完全に依存する。 場合によっては、2段階の精製で十分なこともあります。 より多くの方法を組み合わせるほど、目的のタンパク質は精製中に失われるが、より高い純度を達成することができる。

精製後、得られたサンプルは、HPLC、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）、酵素活性測定、または質量分析を用いて、純度、濃度、酵素の機能または活性を分析することができる。 この鎖が三次元構造に折り畳まれていることが、各タンパク質の機能や活性の鍵を握っているのです。 したがって、精製工程ではこのタンパク質の構造を維持することが非常に重要である。 高温、高圧、極端なpH、溶媒などの外的要因はタンパク質の構造を乱す可能性があるため、FPLCでは避けています。 タンパク質の作業温度は通常4 °Cです。 そのため、FPLC装置は低温だけでなく結露した湿度にもさらされるコールドチャンバーやコールドルームの中に置かれることが多い。 FPLCシステムの構成部品は、このような条件に合わせて特別に設計されなければならない。 さらに、FPLCのコンポーネントには、溶離液として使用される生理食塩水という新たな課題もあります。 通常、細胞環境に近い等浸透圧のpHと塩濃度が選択される。 クロマトグラフィーシステムは、一般的にステンレス鋼で作られています。 一方、バッファーの塩分は腐食の原因となり、他方、ステンレス鋼からの金属イオンはタンパク質に干渉し、その構造を乱す可能性があります。 そのため、FPLCを行う際にはステンレスを避け、ポリエーテルエーテルケトン（PEEK）セラミックやチタンなどの生体適合性の高い素材を使用することが重要です。 HPLCシステムと同様、FPLCシステムもソフトウェアで制御されます。 FPLCとHPLCのソフトウェアにはかなりの違いがあります。 後者は主に試料を分析するために使用され、多くの分析ツールが含まれています。 しかし、FPLCでは、多くの分析ツールは必要なく、容量、あるいはカラム容量に基づいてメソッドを生成するのが一般的である（図3）。 ほとんどのFPLCアプリケーションでは、カラム容量に基づくメソッドが好まれ、アップスケールも簡単です。 FPLCソフトウェアは、ほとんどの場合、非常に直感的でユーザーフレンドリーであり、実行中にパラメータを調整できるダイレクトコントロールが搭載されています。 そのため、ユーザーはさまざまな状況に自発的に対応できます。

したがって、これら2つのクロマトグラフィー領域には大きな違いがあることは明らかです（表1）。 メソッド、ハードウェア、およびソフトウェアは、分子を分析するか精製するかによって大きく異なります。 FPLCアプリケーションの場合、サンプルの敏感な性質と、可能な限りネイティブな状態を維持しようという意欲が、課題をさらに大きくしている。 全体として、どちらの技術も、この分野で働く誰もが知っておくべき非常に興味深い分野である。

Stephanie Rundeは、ドイツのミュンヘン工科大学を卒業し、生化学のディプロマを取得した。 ベルリン自由大学で博士号を取得し、現在はKnauer Wissenschaftliche Geräte GmbHでFPLCのプロダクトマネージャーとして勤務している

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