過去10年間、化学遺伝学および光学遺伝学技術は、より高い選択性で特定の集団または神経伝達系を可逆的に操作する新しいツールを提供し、統合神経科学を変革しました（Sternson and Roth, 2014; Roth, 2016; Wiegert et al.、2017）。 高い時間分解能で高速かつ位相的なニューロン変調を可能にするオプトジェネティクスと比較して、化学遺伝学は、システムをより拡張的に変調することができ、これは特に緊張性現象に焦点を当てた研究（例えば、動機付けプロセスにおけるドーパミンの関与の研究；Whisellら、2016）にとって有用である。 化学遺伝学的ツールの中でも、デザイナードラッグによってのみ活性化されるデザイナー受容体（DREADDs）は広く利用されており、Gタンパク質シグナル伝達経路を通じて細胞活性を選択的に操作するための生物学的「ロックアンドキー」システムと呼ばれている。 最初にRothのグループによって非常にエレガントに開発された（Armbruster et al, 2007）、このGタンパク質共役型受容体（GPCR）はムスカリン受容体であり、クロザピン-N-オキシド（CNO）にのみ反応するように変異した錠、非定型抗精神病薬クロザピンの代謝物である鍵、それ以外は薬理活性がない可能性があります
しかしながら、2016年からいくつかの出版物はCNO使用に関して心配な問題を提起している。 まず、全身投与された比較的高用量のCNO（10mg／kg）は、DREADDsによって媒介されないラットおよびマウスにおける行動効果の誘導によって証明されるように、薬理学的オフターゲット活性を有し得る（MacLarenら、2016；Gomezら、2017；Baerentzenら、2019）。 さらに、Gomezら（2017）は、CNOが血液脳関門を容易に通過せず、低いDREADD結合親和性を示す可能性があり、クロザピンに逆代謝されてDREADDsの真のエフェクターとなることを示しています。 これらの顕著な観察結果に基づいて、彼らはCNOの代わりに低用量のclozapine（0.1 mg/kg）を直接使用してDREADDsを活性化することを提案した。 しかし、大量のCNOが徐々にクロザピンに変換される代わりに低用量のクロザピンを使用することは、2つの大きな制約をもたらす。 第一に、急性注射または長期拡散のクロザピンが、同じようにDREADDに作用することは明らかではありません（Mahler and Aston-Jones, 2018）。 第二に、クロザピンは非定型抗精神病薬であるため、セロトニン作動性、ムスカリン作動性、またはドーパミン作動性受容体など、比較的強い親和性を有する多数の内因性標的があり（Meltzer、1989；Schotteら、1993；Brunelloら、1995；AshbyおよびWang、1996；Armbrusterら、2007）、低い用量でも標的外作用を誘発しそうなことである。 実際、DREADD実験に推奨されるクロザピンの0.1 mg/kg用量は、マウス（Manzaneque et al., 2002）だけでなく、ラット（我々も観察した効果；R. Goutaudier and S. Carnicella, unpublished observations）において不安関連行動を著しく増加することが分かっており、クロザピンも潜在的鎮静を介して運動量に影響を与え、認知柔軟性を損なわせる（Ilg et al, 2018）。
これらの影響の発生は、使用される種、系統、または性別に依存し、非常に個別的である可能性があるが（すべての行動次元が影響を受けるわけではないため）、様々な行動タスクにおける動物のパフォーマンスを著しく妨害する可能性がある。 高いストレスや不安は、例えば、記憶や痛みの研究において交絡因子となり得る（Sousa et al, 2006; Sorge et al, 2014）。 さらに、乱用薬物や統合失調症などの精神疾患に関連する行動、不安、認知の柔軟性は、表現型全体を修飾する可能性があります（Floresco et al., 2009; Koob and Schulkin, 2018）。 これらの観察に基づき、偏った行動研究を避けるために、クロザピンには重要な予防措置が必要である＜9443＞＜536＞DREADDsに特化した新しい分子は、より選択的であろうか？ 化合物21（C21）は、2015年に開発され（Chen et al., 2015）、2018年にin vitroだけでなくin vivoでも部分的に特徴付けられた合成DREADDリガンドである（Thompson et al., 2018）。 今回も低用量（<3 mg/kg）において、行動オフターゲット効果がなく、DREADD発現動物の行動を変化させることができると記載されている。 この研究は、マウスとC21（3 mg/kg）を用いて薬物動態および薬力学的実験を行ったJendrykaら（2019）によって強化された。 彼らは、C21投与30分後のCSF中の分子濃度が、DREADD活性化の推定EC50（CSF＝40nm、EC50DREADDs＝3nm）の＜4738＞10倍であり、本薬への逆代謝がないことを示した。 しかしながら、ラット、マウス、マカクを用いた最近のBioRxiv preprint研究の結果（Bonaventura et al., 2018）は、C21が低い脳内浸透性を示すものの、1 mg/kgの用量で既に野生型マウスの脳機能を修飾する可能性があることを示唆している。 また、DREADDsに対する弱い親和性と占有率が、in vitroではラット脳切片で、in vivoではマウスとマカクでポジトロン断層法試験で観察されました。 C21と同様の実験的検討に基づいて、彼らは代替案として、DREADDsに対してより高いin vivoでの効力を有し、オフターゲット効果が少ない可能性のある2つの他のリガンド、JHU37152およびJHU37160を提案しました（Bonaventura et al.） この新世代のDREADDリガンドは有望と思われるが、その新規性のため、まだ特性評価が不十分であり、クロザピンおよびCNOと構造的に相同であることに変わりはない。
化学的遺伝学的アプローチの選択性を向上させるための別の解決策は、別のロックとキーの組み合わせを使用することである。 そのようなものとして、κ-オピオイド受容体-DREADD（KORD）は、ヒトκ-オピオイド受容体に由来する変異した抑制性GPCRである（Vardyら、2015年）。 クロザピン、CNO、C21、JHU化合物を結合する古典的なDREADDと比較して、KORDはKOR選択的アゴニストサルビノリンAの薬剤様代謝物であるサルビノリンBによって関与する。 この化学原理のアプローチは、活性化DREADDと組み合わせて同じニューロン集団内に「ONとOFF」システムを作り出すために優雅に使用されていたが (Vardy et al…, 2015, Aldrin-Kirk et al., 2016）、短時間でニューロン活性を低下させるだけであるため、依然としてわずかながら使用されている（Aldrin-Kirk and Björklund, 2019）。 さらに、サルビノリンBは、高濃度で内因性KORに対してある程度の親和性を示し、現在DREADD関連化合物に対して行われているような詳細な特性評価の恩恵を受けていない（Roth, 2016）。 GPCRを変異したイオンチャネルで置き換える、リガンドゲートイオンチャネル（LGICs）と呼ばれる別の代替設計された受容体は、Stenson研究室によって開発された選択肢である（Magnus et al.、2011）。 DREADDsと比較して、LGICsは、変異したニコチン受容体のリガンド結合ドメインと、別の選択された受容体のイオン孔ドメインを組み合わせて、キメライオンチャンネルを作成するものである。 DREADDsと同様に、このハイブリッドチャネルは、α7ニコチン性アセチルコリン受容体のアゴニストであるキヌクリジニルベンズアミド由来の小さなアゴニストによって活性化され、ニューロン膜を介したイオン交換を可能にします。 このアプローチに特有の他の制限の中で（Aldrin-Kirk and Björklund, 2019）、実験条件によっては内因性受容体と相互作用する可能性のある薬理リガンドの使用もDREADDsと共通である。 最後に、これらのロックはすべて内因性受容体に由来し、そのため、薬理学に本質的に関連する制限を取り除くことができません
これらの最近の進展と残っている疑問を超えて、重要な質問がなされるべきです：完全に選択的で不活性のキーが発見されることはあるのでしょうか？ おそらく無理であろう。 DREADDsは遺伝学と薬理学を組み合わせた化学遺伝学的ツールであることを念頭に置くことが重要である。 遺伝学的アプローチは、特定の細胞集団、あるいは条件付きアプローチによる部分集団におけるロック（すなわちDREADDs）の発現を強力に制御しますが、それらは内因性GPCRに由来するため、キーに対する古典的薬理学と同じ限界にさらされることになります。 したがって、脳にすでに存在し、DREADDと密接に関連する多数の受容体のいくつかに対して親和性を持たずに、DREADDに対して高い結合親和性を示すような分子が見出されることはまずない。 例えば、クロザピンは、DREADDsに対して非常に高い親和性を有するが、セロトニン作動性受容体5-HT2に対しても（両方に対してKi＝10-8；Armbrusterら、2007；Gomezら、2017）、他の幅広いGPCRに対して高い親和性を有している（Ki＝10-7〜10-6；Armbrusterら、2007）。 この化学遺伝学的手法のために特別に設計された合成リガンドでさえ、内因性受容体に対してかなりの親和性を示す。 例えば、JHU37152およびJHU37160は、5-HT受容体に対する親和性がクロザピンよりも低いものの、この薬剤と全体的に類似した標的プロファイルを有し、ムスカリン受容体に対する親和性がさらに高く（Bonaventuraら、2018）、標的外効果がより強い可能性が示唆されている。 C21はまた、DREADDsよりもヒスタミン性H1受容体に対して高い親和性を示し（Ki > 10-8およびKi = 10-7.2、それぞれ；Thompsonら、2018）、クロザピンよりもオピオイド受容体に大きな結合能がある（Bonaventuraら、2018年）。 この強力なアプローチの落とし穴を最小限に抑えるためには、重要な選択にかかわらず、重大な予防措置を講じる必要がある（図1）
DREADDの選択性と効率のための実験条件を検証するために提案された3つのステップ。 (1)神経生物学的なレベルでは、行動調査の前に細胞実験、電気生理学的実験、神経化学的実験で最適な実験条件、リガンド、濃度を見つける。 (2) 2種類のリガンドを用い、ビヒクルと比較してDREADDを介した効果であることを確認する。 (3) 選択した用量での効果が受容体-リガンド相互作用に特異的であることを確認するために、実験中にDREADDを欠く動物（レポーター遺伝子のみを発現）を含めることを忘れてはならない。
まず、行動実験の前に、実験条件をテストして、実験アプローチに応じて、最適なリガンドと1回分または複数回分の最適量を見出さなければなりません。 DREADDsをターンキーツールとして考えてはならず、細胞実験、神経化学実験または電気生理学実験を行動研究の前に行い（Mahlerら、2014；Beloateら、2016；Boekhoudtら、2016）、対象のシステムで選択された用量でのリガンドの有効性を確認する必要があります。 さらに、リガンドの非特異的な神経生物学的効果または神経伝達物質によって活性化されるか構成的な活性を有する可能性がある受容体自体がないことを確認するために、DREADDを欠く対照動物も含まれなければならない（Salomanら、2016）＜9443＞＜536＞次に、可能な場合、2種類のDREADDリガンドが試験され、観察される行動作用がDREADDを介して特異的に生じることを確認する必要がある。 DREADDに対する特異的な薬理作用は類似しているだろうが、標的外作用は異なるかもしれない。
第三に、そして最も重要な点は、従来の薬理学的対照が使用されなければならないことである。 薬理学と同じ哲学を適用すべきであり、神経生物学的実験と同様に、DREADDsを発現しないトランスジェニック動物（例えば、DREADDs空のウイルスベクター）のグループを統合して、リガンドと選択した用量の選択効果を検証しなければならない（スミスら、2016、キャンベルとマーチャント、2018、マーラーとアストン-ジョーンズ、2018；この設計に従う実験研究の例として、シャら、2017、コペら、2019も参照されたい）。 このステートメントは些細に見えるかもしれませんが、絶対的な選択的リガンドの追求とこのアプローチの魅力により、すでにいくつかの過信的な行動研究、時にはこの制御が完全にない状態で実施されました。
結論として、DREADDは神経回路と行動を操作する正確な方法を提供し、特定の細胞サブポピュレーションを調性操作する光遺伝学の素晴らしい代替法を提供し、したがって研究の興奮する新しい道を開くことができます。 しかし、オプトジェネティクスにおける光の熱特性が非特異的な効果をもたらすことがあるように（Owen et al., 2019も参照）、化学遺伝学ではより大きな予防措置が必要であり、標準制御が必須でなければなりません。 DREADDの限界を認識し、起こりうるオフターゲット効果を回避または制御し、このアプローチ自体が偏りを誘発しないことを検証するために、時間をかけなければならない。 薬理学の弱点に注意を払いながら遺伝学の長所を利用することが、このアプローチの可能性を最大限に引き出すことになるであろう
。