Genome assembly and annotation

H. medicinalisゲノム構築のために、成体ヒルからDNA抽出を実施した。 その際、ヒルは少なくとも2ヶ月間、無給餌で維持された。 3種類のショットガンライブラリを作成し、3種類のプラットフォームを用いてシークエンシングを行った（補表1）。 すべてのリードデータセットを結合し、SPAdesによって単一のアセンブリを作成した。 4057>

予備解析（contigs BlastN）により、得られたアセンブリにバクテリアの配列が存在することが判明した。 そこで、リーチコンティグを判別するためのビニングを行った（リーチビン）。 コンティグのGCアバンダンス、テトラヌクレオチド頻度、リードカバレッジに応じた分布を構築した。 ビニングの精度を上げるため、DNAリードとH. medicinalisの複合トランスクリプトーム（後述）に対応するリードを組み合わせて、リードカバレッジを決定した。 真核生物と原核生物のコンティグの判別は、図1a/b、補足表3、補足データ2に示している。 さらに、ミトコンドリアコンティグを選択して、ヒルのミトコンドリアゲノムを組み立てた .

真核生物のコンティグはペアリードを用いたスキャフォールディングの手順を経ました。 足場は、イルミナのペアエンドおよびマテペアリードのデータセットを用いて、SSPACEで作成されました。 scaffold後のアセンブリは14,042配列からなり、N50 scaffold長は98 kbであった（補足表4および5）。 ヒルのゲノムの長さは220-225 Mbと推定される。 組み立てられたゲノムドラフトの全長は187.5 Mbpであり、これはヒルのゲノムの理論サイズの85%に相当する（補足表6参照）。 また、既知の抗凝固剤や血粉関連タンパク質をコードする遺伝子の新たなホモログを同定した。 これらの各タンパク質ファミリーの多重アミノ酸アラインメント（補足図1、2） ゲノム配列データに基づき、既知のタンパク質配列を用いて、これらの遺伝子の構成を決定した（補足表7、図1b）。 エクソンとイントロンの位置と長さは、それぞれのcDNAとタンパク質の配列を参考に予測した。 4057>

mRNA-seq, transcriptome assembly and annotation

H. medicinalis, H. verbаna, H. orientalisの3種の薬用ヒルから組織特異的mRNAサンプルを得るために、前身部の低温切片から唾液腺細胞と筋肉をレーザー微分離法により分離した（図2A）。 次に、オリゴdTプライマーを用いて、各mRNAサンプルについて正規化あり・なしの2種類のcDNAライブラリを構築し、Ion Torrent PGMで塩基配列を決定した（Supplementary Table 8）。 構築したcDNAライブラリに対応する4つのリードデータセットを用いて、Trinity RNAアセンブラを用いた各薬用ヒル種の複合トランスクリプトームのde novoアセンブルを行った（補足表9）。 この統合トランスクリプトームを用いて、組織特異的な非正規化リードのマッピングを行った。 リードマッピングは連続した差分発現解析を行うために必要であった。

検出された転写物のGene Ontology (GO) 分析はBlast2GOとBlastXを用いて実施されました。 nr’データベースを参照データベースとして使用した。 GO解析の結果、3種の薬用ヒルとも、GOカテゴリーにわたって同様の転写物分布を示した（補足図3）。 また、最も近いBlastXヒットの分類学的分布も類似していた（補足図4）。 同定された転写産物の大部分は、2種のAnnelidaに一致することが分かった。 H. robustaに59.8%、C. teletaに10.7%であった。 4057>

コーディング領域（またはオープンリードフレーム、ORF）の予測およびトランスクリプトームデータのアノテーションは、TransdecoderおよびTrinotateを用いて実施された。 ORFはBlastPアルゴリズムで翻訳し、タンパク質配列はeggNOGデータベースを用いてEuKaryotic Orthologous Groups（KOG）分類でアノテーションを行った（補足図5）。 KOG分類の結果、3種の薬用ヒルはKOGカテゴリー間で類似した転写物分布を持つことが明らかになった。 4057>

差次的発現解析

唾液細胞と筋肉で同定された転写産物の相対発現量を推定し、唾液細胞に特有の転写産物を特定するために、組織特異的cDNAリードを各薬用ヒル種の統合トランスクリプトームに対して正規化せずにマッピングした。 また、H. medicinalisの組織特異的cDNAリードを、そのゲノムアセンブリに対してマップした。 また、H. medicinalis の組織特異的 cDNA リードは、そのゲノムアセンブリに対してマッピングした。差次的発現遺伝子は、最近のプロトコルに従って検出した。 唾液細胞および筋肉で差次的に発現している遺伝子を同定するために、各薬用ヒル種について、その複合トランスクリプトームを用いて個別のMAプロットを構築した（図2b、補足図7）。 さらに、H. medicinalisについては、そのゲノムアセンブリを用いてMAプロットを構築した（図2c）。 4057>

我々は、H. medicinalis、H. orientalis、H. verbanaの唾液細胞において、それぞれ102、174、72の異なる発現を持つ転写産物を同定した。 この3種は近縁の薬用ヒルであるため、その後の機能解析を容易にするために、差次的に発現する転写産物のタンパク質配列をオーソログクラスターに分類した。 その結果、3種のヒルに共通する25の相同発現クラスターと、少なくとも2種のヒルに共通する44の相同クラスターを同定した（図3、補足表10-11）。 同定されたオーソログクラスター内の配列の大部分は、H. robustaのゲノムで注釈された仮説的タンパク質に相当する。 図3

また、H. medicinalisのゲノムアセンブリを用いて、差次的発現遺伝子を分析した。 唾液細胞、筋肉、神経組織のcDNAリード（リードはSequence Read Archive (SRA)から取得）をゲノムアセンブリ上にマップした。 神経組織については、神経節2が前口径に局在していることから、そのリードデータセットを使用した。 4057>

唾液細胞分泌のプロテオミクス

プロテオミクス解析には、少なくとも2ヶ月間無給餌で維持した3種の薬用ヒル、H. medicinalis, H. orientalis, H. verbanaからSCSを採取した。 4057>

SCSは低分子と高分子の両方の成分からなり、プロテイナーゼ阻害剤、糖タンパク質複合体、脂質を含むため、試料調製法は結果として得られるタンパク質のレパートリーにとって重要である。 後者はタンパク質と複合体を形成する可能性がある。 そこで、SCS のタンパク質の幅広いレパートリーを網羅するために、複数の試料調製法と複数の質量分析技術を組み合わせた。 4057>

H. medicinalis, H. orientalis, H. verbanaのSCSにはそれぞれ189, 86, 344個のタンパク質が同定され、上記のようにオルソログクラスターにグループ分けされた。 その結果、3種の薬用ヒルとも39のオーソログクラスターを共有し、50のオーソログクラスターは少なくとも2種で共有していることがわかった（図3、補足表13）。 トランスクリプトームとプロテオームデータを組み合わせると、唾液細胞で特異的に発現する遺伝子が25個のオーソログクラスターとして見つかった（Supplementary Table 11）。 ヒルのSCSの個々の構成要素のリストを図3に示す。 意外なことに、既知のSCS抗凝固剤や血粉関連タンパク質をコードする遺伝子は、唾液細胞と筋肉との間で発現の差を示さなかった。 この知見を検証するために、サラチン、エグリンC、ブデリン、ヒルスタシン、デスタビラーゼ、メタロカルボキシペプチダーゼ阻害剤、アピラーゼ、アンジオテンシン変換酵素（ACE）の発現を、唾液細胞と筋肉について構築した追加の独立組織特異的cDNAライブラリーのリアルタイムPCRによって検討した。 ヒルジンとデスタビラーゼのリアルタイムPCRの結果（補足図8）からも、この発見が確認された。 4057>

以下、SCSの構成要素を機能群に分類し、その止血における役割の可能性を述べる。 4057>

Enzymes

Proteases

本研究の結果、М12、M13、M28ファミリーのメタロプロテアーゼがSCSの主要な酵素成分であることが判明した。 M12B (ADAM/reprolysin) ペプチダーゼは、幅広い機能を持ち、多くの生理的プロセスに関与するdisintegrin-like metalloproteinasesの大家族である 。 これらの酵素は蛇毒に多く含まれ、その転写産物は様々な食血動物のシアロトランスクリプトームで観察される。 止血においては、М12ファミリーの分泌型プロテアーゼは、血小板の接着の抑制やフィブリノーゲンの分解による血栓の軟化に関与していることが知られている。 これらのタンパク質は、細胞外マトリックスタンパク質（ゼラチン、フィブリノーゲン、フィブロネクチン）に対して金属依存性のタンパク質分解活性を示し、それによって炎症や免疫反応の制御に影響を与える。

哺乳類では、M13ファミリーのプロテアーゼは、心血管システムの形成と発達、中枢神経系における神経ペプチドの制御に関与する。 その最も重要な機能の一つは、生物学的に活性なペプチド、特に血圧の調節に関与するペプチド（アンジオテンシンやブラジキニン）の活性化である。 哺乳類では、ACEはレニン・アンジオテンシン系（RAS）の重要な構成要素である。 ACEは、ヒル（Theromyzon tessulatum）、コーンカタツムリ（Conidae）、バンパイアカタツムリ（Colubraria reticulata）、双翅目（Diptera）のsialotranscriptomesに発現する。

同定したM28ファミリーexopeptidase配列は、リソゾームジペプチド分解酵素またはプラズマグルタミン酸カルボキシペプチダーゼ（PGCP）として知られるQタイプカルボキシペプチダーゼに属する。 これらのペプチダーゼは、哺乳類の血漿中や中枢神経系における分泌ペプチドの代謝調節に関与していることが示された 。 これらの酵素は、血中のある種のシグナルペプチドを不活性化する役割を果たし、血球食性寄生虫のヘモグロビン分解系の構成要素であり、消化性のエキソペプチダーゼの役割を担っているようです . ヒルの唾液腺分泌液にはカルボキシペプチダーゼ阻害剤が含まれており、おそらく他のタイプのペプチダーゼによる血液ミールの早すぎる消化を防いでいる。

Superoxide dismutase (EC 1.15.1.1)

我々は分泌型スーパーオキシドディスムターゼ（SODC、Cu/Znタイプ）酵素の配列を同定した。 このファミリーは主に真核生物に典型的に見られる金属タンパク質で、酸化過程を遅らせるフリーラジカルの不活性化に関与している。 血液中では、スーパーオキシドジスムターゼがスーパーオキシドの酸素分子と過酸化水素への変換を触媒し、ペルオキシナイトライトとヒドロキシルラジカルの生成を防いでいる。 興味深いことに、ペルオキシナイトライトは主要なプロコアグラントのニトロ化によって止血機能を抑制し、過酸化水素は多くのプロセス（凝固、血栓症、線溶、血管新生、増殖）の制御に関与する重要なシグナル分子である。 マダニでは、SODC は病気の原因物質を含む細菌による腸管のコロニー形成の制御に関与していると推定されている。 SCSでは、SODCは自然免疫系の他のタンパク質とともに抗菌作用を示し、摂食・消化時の不要な血液の酸化を防いでいるようです。

Carbonic anhydrase (EC 4.2.1.1)

この酵素は重炭酸緩衝系の重要なコンポーネントで、血液、消化管、その他の組織におけるpH値の調節に関与している …。 食血動物では、この酵素は血液の食事の消化に最適な状態を維持することができる。

Hyaluronidase (EC 3.2.1.35)

これらの酵素は、血食動物や毒性動物のプロテオームデータおよびトランスクリプトームデータに共通して含まれている。 異なるヒルの種の唾液分泌物にはヒアルロニダーゼ（ヘパリナーゼ、オルゲナーゼ）が含まれていることが知られている。 プロテオームとトランスクリプトームにおいて、我々はグリコシルヒドロラーゼファミリー79（O-グリコシルヒドロラーゼ）のドメインを含む3つのクラスターを見いだした。 このファミリーには、結合組織で重要な役割を果たすヘパリナーゼが含まれている。 毒や唾液腺分泌物では、これらの酵素はヒアルロン酸の加水分解を触媒し、その結果、細胞外マトリックスの構造的完全性が失われ、それによって抗凝固剤や他の活性分子が組織の深部に浸透するのを容易にする . さらに、ヘパリナーゼによって切断された低分子ヘパリンは、血液凝固を抑制し阻害する。

アピラーゼ (EC 3.6.1.5)

アピラーゼは、ATPとADPをAMPに酵素的に分解するヌクレオチド酵素である。 分泌されたアピラーゼと5′-ヌクレアーゼは、ヒルを含む毒動物や吸血動物の唾液腺分泌物の成分としてよく知られており、その性質もよく知られている。 アピラーゼは、組織損傷部位での血小板凝集の重要な誘因である ADP を除去するため、抗凝固剤となります。

Adenosine/AMP deaminase (EC:3.5.4.4)

は、アデノシンを加水分解してイノシンを形成する触媒となるものです。 アデノシンデアミナーゼはよく研究されており、様々な吸血昆虫の唾液から発見されている。 また、Spiralaliaに属する吸血カタツムリC. reticulataやヒルの唾液腺分泌物にもADAが見出されている 。 ADAは痛みの知覚過程に関与するため、アデノシンの除去に重要な役割を果たすと考えられている。

プロテイナーゼ阻害剤

アンチスタシン

我々はプロテイナーゼ阻害剤I15（ヒルのアンチスタシン）図4と一致する配列を同定した。 このファミリーのタンパク質は、吸血性のヒルに共通して存在し、血液凝固の阻害に重要な役割を果たす。 主な標的は、第Xa因子、カリクレイン、プラスミン、トロンビンなど、止血に関与するセリンプロテアーゼである。 Haementeria ghilianiiのアンチスタシンであるGhilantenは、血小板凝集を阻害することが証明され、最近、巨大アマゾンヒル（Hementaria ghilianii）のギガスタシンは、補体C1を強力に阻害することが報告された . また、Hementeria officinalis の Antistasin は、今回同定された配列の中で最も近いホモログである。 4

CAP/CRISP

cysteine-rich secretory protein/antigen 5/pathogenesis-related 1 proteins (CAP) superfamilyには多数のタンパク質ファミリーがあり、特にcysteine rich secretory protein (CRISP) 図5a. これらはヘビなどの爬虫類の毒によく含まれ、そのほとんどが毒素である . また、血食性動物のCRISPが止血に関与している可能性も指摘されている(HP1)。 その結果、血球貪食性線虫 Ancylostoma caninum（鉤虫）由来のタンパク質配列、例えばカリウムチャネル遮断薬 AcK1 や血小板凝集阻害剤 HPI、蛇毒の triflin (Protobothrops flavoviridis) や natrin-1 (Naja atra) に類似性があることが判明した。 発現量の異なる遺伝子の中から、新たに “Cys-rich “モチーフを持つ配列を同定した（図5b）。 このタンパク質群は、シグナルペプチドと2つのシステインパターンCX{5,14}の存在によって特徴づけられる。 CX {7} CX{8}の場合 СС {2} СとCX{7,17}の CX{9}の場合 CX {8} СС {2} С.4057>

Eglin-like

Eglinsは小さなシステインフリー蛋白で、I13ファミリーのセリンプロテイナーゼ阻害物質に属している。 ヒルのEglinsは好中球エラスターゼとカテプシンGに対する阻害活性を持ち、また作物の内容物を時期外れのタンパク質分解から保護することに関与している。 なお、本研究で同定された配列は、ヒルの古典的なエグリン（図6a）との相同性は低い（

Cystatin

H. verbanaのプロテオームにのみシスタチン配列が存在することを明らかにした。 シスタチンはシステインプロテアーゼ（カテプシンB、H、C、L、S）の阻害剤であり、様々なダニのシアロトランススクリプトームでしばしば発見される。 マダニにおいては、シスタチンは、免疫反応、血液の消化やヘム解毒に関与する内因性システインプロテアーゼの制御に重要な役割を果たしている。 線虫の Nippostrongylus brasiliensis は、シスタチンを利用して宿主の免疫システムを回避している。

PAN domain

このドメインは、血液タンパク質のプラスミノーゲンや凝固第XI因子など多数のタンパク質に存在している。 血漿中のプレカリクレインのPAN/appleドメインは高分子量のキニノーゲンとの結合を媒介することが知られており、第XI因子のPAN/appleドメインは第XIIa、IX因子、血小板、キニノーゲン、ヘパリンに結合する . ヒルの唾液腺分泌物には、PANドメインを持ち、止血に関与するleech antiplatelet protein (LAPP)が含まれていることが判明した。 このタンパク質はコラーゲンI、III、IVに親和性を示し、コラーゲンを介した血小板の接着を阻害する。

α-2-macroglobulin（α2M）

非常に保存され多機能なα2Mは、広範囲のプロテアーゼ（セリン、システイン、アスパルチン、メタロップ）の阻害に関わり、サイトカインやホルモンと相互作用し、亜鉛や銅のキレートに役割を担っている 。 プラスミン阻害剤として作用し、線溶を阻害するが、場合によっては、トロンビンやカリクレインを不活性化することにより、凝固を阻害することもある . 4057>

接着に関わる分子

フィコリン

フィコリンは自然免疫系の成分で、レクチン依存的に補体の活性化経路を引き起こす。 無脊椎動物では、フィコリンは細菌の細胞壁成分の認識に関与している。 フィブリノゲン様ドメインは、赤血球に親和性のあるタンパク質、例えば、タキレクチン-5A (TL5A)などに存在する。 TL5Aは、Ca2+イオン存在下で強い血球凝集能と抗菌活性を示す。 爬虫類の毒では、フィコリン様タンパク質であるryncolin（Cerberus rynchops由来）やveficolin-1（UniProt：E2IYB3）（Baranus komodoensis由来）が、血小板凝集や血液凝固を引き起こすと推定されている。 このドメインは、ニューロピリン、ニューレキシンIV、ディスコイジンドメイン受容体タンパク質などの多くの膜貫通タンパク質や細胞外タンパク質、凝固因子VやVIIIなどの止血に関与するタンパク質に存在する。 ディスコイディンドメインは、リン脂質や糖質などの様々なリガンド分子との結合に重要な役割を果たす。 このような特徴から、DS含有タンパク質は、細胞接着、移動、増殖、シグナル伝達カスケードの活性化に積極的に関与している。 ヒルのDSドメイン含有タンパク質は、ガラクトースに対して高い親和性を持つレクチンとして働き、ヒルの自然免疫系の構成要素である可能性があるようだ。

低密度リポタンパク質受容体aファミリー

低密度リポタンパク質受容体（LDLR）ファミリーは、血しょう中の重要な成分で、ほ乳類の血液中の低密度リポタンパク質の認識とエンドサイトーシスに関与している。 既知の相同タンパク質とは対照的に、これらの受容体は膜タンパク質ではなく分泌タンパク質であり、4つのLDLRクラスA（システインリッチ）反復を含んでいます。 ヒルを含むいくつかの無脊椎動物は、コレステロールやステロイドホルモンを合成することができないと仮定され、ヒルは摂食の際、主に宿主の血液からコレステロールを外来源として獲得する。 4057>

R-type lectin

リシン型β-トレフォイルレクチンドメインを含むタンパク質は、原核生物および真核生物で見つかっている。 動物では、R-型レクチンは多様な活性を示す。 スカベンジャー受容体（マンノース、フコース、コラーゲン受容体）、N-アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、溶血性毒素（Cucumaria echinata由来のCEL-III）、アポトーシス誘導性細胞毒素に存在する。 以前、同様の配列がヒルのトランスクリプトームで同定されたが、著者らはこの分子がミトコンドリア局在であると仮定していた . もう一つの注目すべき近縁種は、ミミズLumbricus terrestrisのガラクトース結合性レクチンEW29である。 EW29は、2つの相同ドメインからなり、血球凝集活性を示すことが実験的に証明されている。

vWFA domain

このドメインは、補体因子、インテグリン、コラーゲンVI、VII、XII、XIVなどの血漿タンパク質に存在している。 ヒルのプロテオームで同定されたタンパク質の一つに、vWFAドメインの4つのコピーからなる分泌タンパク質がある（図7）。 この配列には、金属イオン依存性接着部位（MIDAS）、インテグリン-コラーゲン結合部位、糖タンパク質Ib（GpIb）結合部位など、いくつかの推定上の認識部位が含まれている。 BlastX解析によると、このドメインはVI型コラーゲンに相同である。 タンパク質のドメイン構成と糖タンパク質およびコラーゲン結合部位の存在を考慮すると、推定される作用機序の1つは、内皮または血小板の表面に結合し、それによってコラーゲンとの相互作用を妨げることである。 この結合は、止血中の競合的阻害（platelet scavenging）の根底にある.

で示した。