NS2B-NS3 protease

創薬の第一要件として標的タンパク質の3D構造（立体的）データが確立されています。 化学データベースからリガンド候補を同定するために、X線結晶構造および標的タンパク質に対して生成されたホモロジーモデルの両方が使用されてきたが、3D結晶構造はin silico生成ホモロジーモデルよりも有効であることが記録されている。 そこで、DENV感染症の主要な治療標的として提案されているDENV NS2B-NS3プロテアーゼの立体構造を、PDB ID:2FOM40 でプロテインデータバンク（PDB）から検索した。 NS2B-NS3proの結晶構造は1.5Å分解能で解析され、NS2Bコファクターを形成する鎖AとNS3proドメインを構成する鎖Bの2つのタンパク質鎖を示した（図2a）。 図2

バーチャルスクリーニングとドッキングシミュレーション解析

最近、構造ベースのバーチャルスクリーニングが、選択した標的に対する大規模生理活性化学ライブラリからの新規リード化合物の発見で人気を集めています。 このアプローチでは、選択された受容体の活性部位領域におけるリガンドのドッキングをシミュレーションし、その後、阻害剤のランク付けとスコアリングを行う23。 この研究では、Schrodinger suite の Glide モジュールを用いて、NS3pro に対する G. lucidum 由来の既知の 22 種類の抗ウイルストリテルペノイドの構造に基づく仮想スクリーニングを行った（表 S1）。 これらの阻害剤をさらに、Glide モジュールの XP ドッキングプロトコルで分析し、結合エネルギーや活性部 位残基との結合パターンに関する情報を収集した。 その結果、ガノデリック酸Gを除く全てのトリテルペノイドがNS2B-NS3proに対して有意な結合親和性を示すことが確認された（Table S1）。 また、参照阻害剤である 1,8-Dihydroxy-4,5-dinitroanthraquinone の同じ活性部位に対する分子ドッキングは -5.377 kcal/mol というドッキングスコアを出した。 そこで、ドッキングスコアが閾値である-5 kcal/mol よりも優れているトリテルペノイドを分子間相互作用解析の対象として選択した。 その結果、DENVプロテアーゼのNS3proドメインに対する阻害剤として、ガノデルマノントリオール（-6.291 kcal/mol）、ルシデュモールA（-5.993 kcal/mol）、ガノデリック酸C2 （-5.948 kcal/mol）、ガンスポリ酸A （-5.830 kcal/mol）の合計4種のトリテルペノイドを選択することに成功した。 これらのドッキングスコアは、既知の阻害剤である 1,8-Dihydroxy-4,5-dinitroanthraquinone (-5.377 kcal/mol) や Azadirachta indica からの生理活性分子 Nimbin (-5.56 kcal/mol), Desacetylnimbin (-5.24 kcal/mol) and Desacetylsalannin (-3.43 kcal/mol) と比較して DENV NS3pro41 に対して著しいと思われるものであった。 この結果は、G. lucidumの生理活性トリテルペノイドがDENVプロテアーゼの阻害剤としての可能性を示し、DENV感染に対する抗ウイルス薬の開発に使用できることを示唆している。

分子相互作用とMM/GBSA分析

タンパク質とリガンドとのドッキング複合体の分子接触は生物系における分子機構の理解を深めることができるので42、分子接触プロファイルもDENVプロテアーゼと選択したトリテルペノイドや参照阻害剤に関して研究した。 NS3pro-Ganodermanontriol 複合体は、活性領域において Lys73 (3Å), Thr120 (2.94Å), Asn167 (3.26Å, 2.86Å) 残基とそれぞれ適度な一重および二重水素結合による相互作用がみられ た。 NS3pro-Ganodermanontriol複合体内では、Trp50, Val72, Ile123, Val154, Val155 および Ala164残基にも疎水性アトラクションが追加記録されている。 また、His51, Thr118, Asn119, Thr120, Asn152, Asn167, Gly153は、それぞれGanodermanontriolと極性およびグリシン相互作用を示した。 一方、NS3pro-Ganodermanontriol複合体のドッキングでは、残基との正電荷相互作用（Lys73とLys74）および負電荷相互作用（Asp75）も記録された（図3a,b）。

3D および 2D ドッキング複合体とそれぞれのスクリーニングしたトリテルペノイドとの分子間接触を示す NS3pro ドメインの図である。 (a,b) NS3pro-Ganodermanontriol複合体, (c,d) NS3pro-Lucidumol A複合体, (e,f) NS3pro-Ganoderic acid C2 (g,h) NS3pro-Ganosporeric acid A.。 2次元複合体において、緑、紫、赤、青、灰色の残基はそれぞれ疎水性、正、負、極性、グリシン相互作用を表し、ピンクの矢印は水素結合形成を示している。

NS3pro-LucidumolAの相互作用プロファイルは、残基Asp75 (3.31Å) と Asn152 (2.48Å) で形成される二つのシングル水素結合、Gly153 (2.11Å, 2.84Å) で形成するダブル水素結合、さらにGly151とのグリシン相互作用が反映されることが示された。 さらに、疎水性相互作用（Val72, Leu128, Phe130, Pro132, Tyr150, Val154 and Tyr161）および極性相互作用（His51, Ser135 and Asn152）も記録されている。 Asp75はLucidumol Aとプロテアーゼの活性ポケットで負電荷の相互作用を示した(Fig. 3c,d)。 また、NS3proとドッキングしたガノデリック酸C2は、Gly151（2.73Å、3.12Å）と中程度の二重水素結合を形成し、Trp50（2.66Å）とArg54（1.93Å）には一重水素結合が観察された。 さらに、この複合体では、ガノデリック酸C2の水酸基とプロテアーゼのArg54残基との間の塩橋形成も記録されている。 さらに、NS3pro-ガノデリック酸C2のドッキングでは、極性（His51とAsn152残基）、負（Asp75残基）、正（Arg54残基）の相互作用も記録された（図3e,f）。 NS3pro-ガノデリック酸A複合体のドッキングでは、Thr120、Asn152、Asn167残基に3つの単一水素結合が形成され、Trp50、Val72、Ile123、Val154、Val155、Ala164は疎水性相互作用を示すとマークされた（図3g,h）。 さらに、NS3proとGanosporeric acid Aとのドッキングでは、極性（残基Thr118,Asn119,Thr120,Asn152およびAsn167）、正（Lys73およびLys74）および負電荷相互作用（Asp75）が見られた。

さらに、NS3proプロテアーゼ活性部位に参考阻害剤の1，8-ジヒドロキシ-4，5-ジニトロアントラキノンがドッキングし、有意に相互作用を記録している。 この複合体は、Phe130残基で単一の水素結合を形成し、His51は阻害剤と塩橋およびπ-π相互作用を示すことが確認された。 さらに、疎水性（Leu128, Phe130, Pr0132, Tyr150 and Tyr151）、極性（His51, Ser131 and Ser135）およびグリシン（Gly151 and Gly153）相互作用も観察され、複合体のドッキングは良好であった。

スクリーニングした全てのトリテルペノイドはNS3proの触媒三重鎖（His51, Asp75, Ser135残基）、および他の保存残基（Phe130, Tyr150, Asn152, Gly153）で水素結合を示し、DENV proteaseの基質結合に大きな役割を果たすことが報告された43, 44と結論された。 さらに、いくつかの残基は、異なるリガンドと水素結合を共有することが記録されている。 これらのことから、リガンドとNS3proの触媒三残基の1つとの水素結合は、Asp75とHis51残基のカルボキシル基とイミダゾール基の間の電子伝達をそれぞれ妨げる可能性があることが示唆された。 このような妨害は、タンパク質分解活性の開始に不可欠な残基Ser135の水酸基（β-OH）に対する求核攻撃を頓挫させることが報告されている43,44。 したがって、今回スクリーニングしたトリテルペノイドは、様々な分子間相互作用を通じてDENVのNS3proドメインに強い親和性を示し、NS2B-NS3pro阻害によるDENV感染に対する薬剤として作用する可能性が示唆されたと結論づけた。

さらに、Ganodermanontriol、Lucidumol A、Ganoderic acid C2、Ganosporeric acid Aの4つのトリテルペノイドとDENV NS3proとのドッキング複合体をMM/GBSA計算を用いて分析し、活性部位でのそれぞれのリガンドの結合親和性を算出した。 これらの計算では、ドッキングした4つの複合体すべてにおいて、比較的負のMM/GBSA値を示した。すなわち、NS3pro-Ganodermanontriol (-24.465 kcal/mol), NS3pro-Lucidumol A (-19.735 kcal/mol), NS3pro-Ganoderic acid C2 (-19.465 kcal/mol) である。039 kcal/mol）、NS3pro-Ganosporeric acid A（-11.449 kcal/mol）であり、参照阻害剤複合体 NS3pro-1,8-Dihydroxy-4,5-dinitroanthraquinone はより大きな値（- 38.934 kcal/mol）を生じた。 これらの結果は、NS3proに対するトリテルペノイドの阻害活性が参照阻害剤よりも弱いことを示唆しているが、他のトリテルペノイドと比較して、NS3proに対するガノデルマノントリオールの強い結合親和性は、予測されたドッキングスコアによって支持されていることも示唆された。 さらに、選択したトリテルペノイドとポジティブコントロールがDENV NS3proタンパク質と複合化した際の予測ΔG値および物理化学成分、すなわちΔGBind Coulomb、ΔGBind vdW（van der Waals力）、ΔGBind Solv SA（solvent accessible surface area）およびΔGBind Solv GB（solvation energy generalized Born）分析から以下のことが判明した。 リガンドによっては、ΔGBind Coulomb および/または ΔGBind vdW がトリテルペノイドおよび参照阻害剤と DENV NS3pro タンパク質の複合体の安定性に最も寄与していることがわかった。 (Figs. 4, S2, Table S2)。 したがって、ガノデルマノントリオールは、DENV NS3proタンパク質に対して最も有望な機能性トリテルペノイドであると結論付けられ、他のトリテルペノイドとともに、分子力学とin vitro解析でさらに分析された。

MMGBSA 法で計算した自由結合エネルギー (kcal/mol) は、スクリーニングしたトリテルペノイド、すなわち、次のとおりです。 (a) Ganodermanontriol, (b) Lucidumol A, (c) Ganoderic acid C2 and (d) Ganosporeric acid A とDENV NS2B-NS3 proteaseとの複合体の分子ドッキングシミュレーション後、MMGBSA法で算出した自由結合エネルギー（kcal/mol）。

分子動力学（MD）解析

分子ドッキング法を用いて計算したターゲット・リガンド上の相互作用情報は、分子動力学シミュレーションと結晶学研究によってさらに検証することができる38,41。 ここでは、選択したトリテルペノイド-NS3proドメイン複合体の安定性を、二乗平均平方根偏差（RMSD）、二乗平均平方根変動（RMSF）、タンパク質-リガンド接触マップ解析の観点から、10ナノ秒MDシミュレーションを使用して評価した。 興味深いことに、受容体の最終的な変動は<2 Å RMSDと記録された一方、Ganodermanontriol阻害剤は、シミュレーション区間の最後にNS3proドメインとの複合体で安定した最大変動6 Åを示した（図5a）。 また、受容体の個々の残基とリガンドの原子の両方について計算したRMSFは、シミュレーション期間中、許容範囲の変動（2.8Å未満）を示しました（図S3a、S4a）。 しかし、リガンドのシクロペンタフェナントレン-7-オン環のケト基とメチル基では、5～7ナノ秒の時間枠の間、重要ではないRMSF変動も観察された（Fig. S3a）。

RMSD for alpha carbon atoms of NS3pro protein and triterpenoids from G.. Inc. lucidum由来のトリテルペノイドをリガンドとした(a) NS3pro-Ganodermanontriol, (b) NS3pro-Lucidumol A, (c) NS3pro-Ganoderic acid C2 and (d) NS3pro-Ganosporeric acid A, in 10 ns trajectory of MD simulation.を用いた。

同様に、NS3pro-Lucidumol A複合体のRMSD分析では、受容体とリガンドはともに10ナノ秒間のシミュレーションで3Å以下の変動を示した（図5b）。 一方、NS3proとLucidumol AのRMSF解析では、＜7183＞3Åの変動を予測し、リガンドのヘプタン領域のメチル基とヒドロキシル基にも10ナノ秒間のシミュレーションで許容範囲の偏差が記録された（図S3b）。 同様に、NS3pro-ガノデリック酸C2複合体のリガンドは、最初の2-5ナノ秒の間に許容できる偏差を示し、その後安定し、最終偏差は10ナノ秒のシミュレーション間隔において8Å未満で記録されました（図S4b）。 リガンド（6Å以下）と受容体（3Å）のこれらの許容範囲内の偏差は、それぞれの錯体のRMSFの計算によっても支持されました（図S3c, S4c）。

さらに、NS3pro-ガンスポリン酸A複合体のリガンドのシミュレーション解析では、リガンドのヘプタン部位にあるカルボキシル基が6ナノ秒間低い偏差を示し、その後10ナノ秒間終了するまで4.6 Å RMSDで安定した状態になった（図5d）。 一方、NS3proは1.6Å RMSD付近で安定した振動を示し、初期N末端領域での偏差はわずかであった（図5d）。 これらの観察から、受容体とリガンドそれぞれの個々の残基（3.5Å以下）と原子（3Å）のRMSF曲線（図S3d、S4d）が支持するように、それぞれのドッキング複合体の安定性が示唆された。

シミュレーション軌道曲線から分子間結合に対する個々の残基の寄与を表すタンパク質リガンド相互作用マップも生成した（図6）。 NS3pro-Ganodermanontriol複合体のタンパク質-リガンド相互作用マップは、Met49, Val72, Lys73, Lys74, Asp75, Leu76, Trp83, Glu88, Thr118, Thr120, Ile123, Val147, Leu149, Asn152, Gly153, Val154, Val155, Ala164, Ile165, Ala166、Asn167残基が参加して、水素結合、疎水性引力、イオン相互作用、水橋を形成した（図1参照）。 6a). Leu149とAsn152残基は、10ナノ秒のシミュレーション期間中、顕著な水橋と水素結合誘引に寄与することが強調された（図6a）。 また、Asn152残基もドッキング複合体において水素結合を形成することが予測され（図3a、b）、NS3proのこの残基がGanodermanontriolとの相互作用に重要であることが示唆されました。すなわち、（a）NS3pro-Gandomanontriol、（b）NS3pro-Lucidumol A、（cc）NS3pro-Ganoderic acid C2及び（d）NS3pro-Ganosporeric acid Aは、MDシミュレーション中に計算された種々の接触及び相互作用プロフィールを有するドッキング複合体の正規化された積層棒グラフである。 相互作用分率>1.0は、いくつかの残基が類似のサブタイプの複数の相互作用を生成するため、妥当な値であると考えられる。

NS3proとルシデュモールAの相互作用マップでは、His51, Arg54, Val72, Lys73, Lys74, Asp75, Leu128, Asp129, Phe130, Pro132, Ser135, Tyr150, Gly151, Asn152, Gly153, Val154.A が参加することが示された。 Val155、Tyr161、Asn167残基が水素結合、疎水性相互作用、ウォーターブリッジに関与し、Asp75とGly153残基はウォーターブリッジと水素結合形成にそれぞれ最も寄与した（図）。 6b). 分子ドッキング解析でも、Gly153がリガンドとの水素結合に果たす役割が示唆され（図3c、d）、この残基がタンパク質-リガンドの安定性に重要であることが示唆された。 さらに、Tyr161、Asp75、Leu128 残基もそれぞれリガンドと水を介した相互作用、水素結合、疎水性相互作用に大きく寄与することが示された（Fig.6b）。 これらの結果から、Gly153, Tyr161, Asp75, Leu128は、シミュレーション期間中、NS3pro-Lucidumol A複合体の安定なコンフォメーションに大きく関与していることが示唆された。

同様に、NS3pro-ガノデリック酸A相互作用プロファイルでは、Try50, His51, Arg54, Asp71, Val72, Lys73, Lys74, Asp75, Thr118, Asn119, Thr120, Gly121, Thr122, Ile123, Gly151, Asn152, Gly153, Val154, Val155, Tyr161 and Asn167残基はウォーターブリッジ、疎水性およびイオン的相互作用に活発に貢献している（図1参照）。 6d). しかし、Lys73, Lys74, Val155, Asn167残基は水素結合を介してNS3proとGanosporeric acid Aリガンドとの複合体の安定性に最も貢献し、次いでウォーターブリッジ、疎水性、イオン性相互作用が起こると予測された（Fig. 6d）。 また、ドッキングした複合体では、Asn167がガノスポリ酸Aと水素結合を形成していることがわかり、複合体の安定性に大きく寄与していることが明らかになった。 これらの結果から、各トリテルペノイドはDENVプロテアーゼのNS3proドメインとドッキングした複合体において、有意に安定であることが検証され示唆された。 したがって、これらのトリテルペノイドはDENV感染症治療薬の製剤化に使用できる可能性があることが改めて示唆された＜6999＞。