DDRGK1 is required for ER homoeostasis
DDRGK1の細胞機能の理解のため、先に述べた21種類のsiRNA混合を用いてDDGK1のノックダウンの影響を検討した。 その結果、DDRGK1のノックダウンにより、MCF7とHepG2の両細胞において、Annexin V/PI染色（図1a）、カスパーゼ3の活性化およびPARP切断（図1b）で特徴付けられるアポトーシス細胞死が誘導されることが分かった。 なお、DDRGK1のノックダウンによって誘導されたHepG2細胞ではカスパーゼ-3切断を検出できるが、MCF7細胞ではカスパーゼ-3が欠損しているため、検出できないことに注意すべきである22。 定量的リアルタイムPCR（Q-PCR）解析により、DDRGK1のノックダウンにより、プロアポトーシス遺伝子BAX、BAK、NOXA、DR5およびBidの発現が増加し、一方、アンチアポトーシス遺伝子Bcl-2の発現が減少することがわかった（図1c,d）。 重要なことは、MCF7およびHepG2細胞におけるDDRGK1のノックダウンがERストレス応答を誘導し、BiP、HSPA8およびCHOPのERストレス特異的遺伝子発現が増加することがわかった（図1e、f）
(a) MCF7およびHepG2細胞に、コントロールsiRNAまたはDDRGK1標的siRNAを72時間トランスフェクトし、続いて細胞をアネキシンVおよびPIで染色してフローサイトメーター解析に付し、アポトーシス細胞の定量化（Annexin V+）を実施した。 (b）aに記載のコントロール及びDDRGK1ノックダウンMCF7及びHepG2細胞におけるPARP及び切断型カスパーゼ3のウェスタンブロット分析。 c，d）コントロール及びDDRGK1ノックダウンMCF7及びHepG2細胞におけるBAX、BAK、NOXA、Bid、DR-5及びBcl-2の相対mRNA発現量のQ-PCR解析。 (e,f）コントロールおよびDDRGK1ノックダウンMCF7およびHepG2細胞におけるBiP、HSPA8およびCHOPの相対的mRNA発現レベルのQ-PCR分析。 すべてのデータは、3回の実験による平均値±s.d.で示した。 *688>
DDRGK1がERストレス応答に関与することをさらに確認するために、ERストレス誘導物質であるタプシガルギン（Tg）およびツニカマイシン（Tm）で処理した後の細胞の生存に対するDDRGK1の影響を決定した。 DDRGK1をノックダウンすると、HepG2とMCF7の両細胞において、Tg処理によるERストレス誘発性アポトーシスを、Annexin V/PI染色とカスパーゼ-3とPARPの切断によって評価した（図2a-cおよび補足図1a-c）。 一方、DDRGK1の過剰発現は、HepG2細胞におけるERストレス誘発性細胞死を減少させた（図2d-f）。 さらに、MCF7細胞の生存率をMTTアッセイで評価した結果、DDRGK1をノックダウンすると、TgまたはTm処理に対して感受性が高くなり、細胞生存率が低下する（補足図1D）、一方、DDRGK1を過剰発現するとTgまたはTm処理後の細胞生存率が上昇する（補足図1E）ことが分かった。 以上のことから、DDRGK1はERホメオスタシスの制御に重要な役割を果たしていることが示唆された。
(a)． HepG2細胞を、コントロールsiRNAまたはDDRGK1に対するsiRNAで72時間トランスフェクトし、その後、細胞をDMSO（ビヒクルコントロール）またはTg（2.5μM）で24時間処理してから収穫した。 細胞はアネキシンVとPIで染色し、その後フローサイトメトリー分析を行った。 (b). aのアポトーシス細胞（アネキシンV+）の定量化。 c）aに記載のHepG2細胞におけるPARPおよび切断カスパーゼ3のウェスタンブロット分析。 d）HepG2細胞をコントロールベクターまたはDDRGK1で36時間トランスフェクトし、細胞をDMSOまたはTg (2.5 μM) で処理してから収穫を24時間行った。 細胞はアネキシンVとPIで染色し、その後フローサイトメトリーで解析した。 (e）dのアポトーシス細胞（Annexin V+）の定量化（f）dに記載のHepG2細胞におけるPARPおよび切断型カスパーゼ3のウェスタンブロット分析データはすべて3回の実験からの平均±s.d.として提示されている。 **688>
DDRGK1 modulates the UPR
DDRGK1 がどのように ER homoeostasis を制御するのかを理解するために、まず DDRGK1 欠損細胞における 3 つの UPR センサーとその下流の標的のタンパク質レベルの変化について分析した。 その結果、MCF7およびHepG2細胞においてDDRGK1をノックダウンすると、総IRE1αのレベルは有意に低下したが、リン酸化IRE1α（p-IRE1α）のレベルは弱くなった（図3a）。 ATF6および切断型ATF6のレベルは影響を受けなかった（図3a）。 興味深いことに、DDRGK1のノックダウンは、総PERKのレベルに影響を与えなかったが、リン酸化PERK（p-PERK）およびBiPのレベルは、有意に増加した（図3a）。 次に、IRE1αの基質であるXBP1に対するDDRGK1枯渇の影響を検討した。 その結果、DDRGK1ノックダウンMCF7細胞では、XBP1のスプライシングフォームであるXBP1sが時間依存的に有意に減少し（図3b）、これはIRE1αタンパク質レベルの変化と相関していた（補足図2A）。 さらに、DDRGK1の枯渇は、MCF7細胞およびHepG2細胞の両方において、eIF2αリン酸化レベル（p-eIF2α）およびCHOP発現量を増加させた（補足図2B）。 これらの結果は、図1および2で観察されたように、DDRGK1の枯渇がUPR-IRE1αシグナルを抑制し、UPR-PERKアポトーシス経路を活性化し、その結果、アポトーシスを誘発することを示唆するものである。 しかし、DDRGK1過剰発現細胞では、IRE1αのレベルが用量依存的に上昇した（図3c）。一方、p-PERK、PERK、ATF6、p-IRE1α、BiPおよびXBP1のスプライシング形態のレベルは大きく変化しなかった（図3c；補足図2CおよびD）。 DDRGK1とUPRの機能的関係を探るため、DDRGK1ノックダウンMCF7細胞と対照細胞において、Tg処理後のIRE1αとPERKの動的変化を異なるタイミングで評価した。 Tg処理により、予想通り、コントロール細胞のIRE1αおよびp-IRE1α、p-PERKおよびBiPのレベルが増加した。 しかし、DDRGK1欠失細胞では、コントロール細胞と比較して、総IRE1αレベルが有意に低下し（0-24時間）、p-IRE1αレベルは緩やかに低下した（4-24時間）（図3d）。 同時に、XBP1sのレベルは、DDRGK1欠失細胞において、対照細胞と比較して減少した（4-12時間）（図3e）。 PERKの総量は変化しなかったが、p-PERKはDDRGK1欠失細胞で有意に増加した（0-12時間）（図3d）。 同様の結果は、HepG2細胞でも得られた（補足図2EおよびF）。 以上のことから，DDRGK1の枯渇はIRE1αの分解とPERKの活性化を引き起こすことが示唆された。
(a) MCF7細胞およびHepG2細胞にコントロールsiRNAまたはDDRGK1標的siRNAを72時間トランスフェクトし、p-IRE1α、IRE1α、p-PERK、PERK、ATF6およびBiPのタンパク質レベルをウエスタンブロッティングにより決定した。 (b）MCF7細胞を、コントロールsiRNAまたはDDRGK1に対するsiRNAでトランスフェクトし、細胞を、XBP-1スプライシングのRT-PCR解析のために、示された時間に採取した。 (c) MCF7細胞およびHepG2細胞を、様々な用量のコントロールまたはDDRGK1ベクターで36時間トランスフェクトし、p-IRE1α、IRE1α、p-PERK、PERKおよびATF6のタンパク質レベルをウェスタンブロットにより決定した。 (d) MCF7細胞をsiRNAコントロールまたはDDRGK1を標的とするsiRNAで72時間トランスフェクトし、示された時間に2.5μM Tgで処理した後に細胞を回収し、ウェスタンブロットを行った。 (e）dのXBP-1スプライシングのRT-PCR解析。*非特異的バンドを表す。
DDRGK1 はIRE1α
UPR はERストレスセンサーによりERストレス時に誘発され、ER homoeostasis 8を調節している。 マウスでIRE1αを肝細胞特異的に欠失させるとUPR-PERK経路が活性化されることが報告されている23。 DDRGK1 欠損細胞で観察された p-PERK の誘導が IRE1α のレベル低下に よってもたらされているかどうかを調べるために、IRE1α欠失細胞における p-PERK, PERK およびその下流標的のレベルを調べた。 その結果、IRE1αのノックダウンにより、MCF7細胞、HepG2細胞ともにp-PERKおよびp-eIF2αのタンパク質レベルが有意に増加し（図4a）、DDRGK1欠失細胞で観察されたものと同様である（図3a；補足図2b）。 これらの結果は、DDRGK1がIRE1αを標的とすることでUPRを制御していることを示している。 次に、DDRGK1がどのようにIRE1αを制御しているのかについて検討した。 その結果、DDRGK1ノックダウン細胞では、mRNAレベルではなく、IRE1αタンパク質レベルが劇的に減少していた（補足図3A）。 プロテアソーム阻害剤MG132で細胞を処理すると、DDRGK1が介在するIRE1αタンパク質の減少が阻止された（図4b；補足図3B）。 さらに、DDRGK1の枯渇は、シクロヘキシミドチェイスアッセイにおけるIRE1αの半減期を劇的に減少させることが確認された（図4c）。 これらの観察結果に従い、IRE1αの異所性発現は、DDRGK1欠失MCF7およびHepG2細胞の両方において、コントロール細胞と比較して、アネキシンV/PI染色およびカスパーゼ3活性化によって特徴付けられる細胞生存率を改善することが分かった（図4d、e；補足図3CおよびD）。 全体として、これらの結果は、DDRGK1がIRE1αの安定性を調節し、それによってUPRを調節することを示唆する。
(a). MCF7およびHepG2細胞を、コントロールsiRNAまたはIRE1αを標的とするsiRNAのいずれかで72時間トランスフェクトし、p-PERK、PERK、p-eIF2αおよびeIF2αのタンパク質レベルをウェスタンブロットにより決定した。 (b). MG132（20μM、8時間）で処理したコントロール及びDDRGK1ノックダウンMCF7細胞におけるIRE1αのウェスタンブロット解析。 (c). 100μg ml-1シクロヘキシミドで示した時間処理した後の、コントロール及びDDRGK1-ノックダウンMCF7細胞におけるIRE1αの崩壊のウェスタンブロット分析である。 グラフは、IRE1αタンパク質レベルの定量化を表す。 (d）MCF7細胞を、コントロールsiRNAまたはDDRGK1を標的とするsiRNAのいずれかで72時間トランスフェクトした。収穫前に、DDRGK1ノックダウン細胞を、コントロールまたはIRE1αベクターのいずれかで36時間トランスフェクトし、その後細胞をアネキシンVおよびPIで染色してフローサイトメーター分析に供し、その後アポトーシス細胞（アネキシンV+）の定量をした。 すべてのデータは、3つの実験からの平均±s.d.として示されている。 スチューデントのt検定により、*P<0.05。 (e）d.におけるMCF7細胞のIRE1αのウェスタンブロット分析＜688＞＜4657＞＜1823＞＜4657＞＜1576＞DDRGK1とIRE1αとの相互作用＜3744＞＜6839＞DDRGK1がIRE1α安定性を制御する方法を理解するために、HEK293T細胞における相互免疫沈降（IP）アッセイを介してDDRGK1とIRE1αとの相互作用を行うかどうかを検証した。 その結果、外因性に発現したFlag-IRE1αが内因性のDDRGK1およびBiPと特異的に相互作用することが示された（図5a）。 同様に、外因性に発現したFlag-DDRGK1は、内因性のIRE1αおよび既知のDDRGK1関連タンパク質であるC53と特異的に相互作用した（文献14）。 しかし、Flag-DDRGK1免疫沈降物からはBiPを検出できなかった（図5b）。このことは、DDRGK1がBiPと直接相互作用していない可能性を示唆している。 IRE1αは内因性ER関連分解（ERAD）基質として、IRE1αとSel1L-Hrd1 ERAD複合体がBiP依存的に会合することで分解される24。 そこで、DDRGK1とIRE1αの相互作用にBiPが関与しているかどうかを調べたところ、BiPはDDRGK1とIRE1αの相互作用に関与していた。 その結果、BiPをノックダウンしてもDDRGK1とIRE1αの相互作用には影響がないことがわかった（補足図4）。 さらに、DDRGK1とIRE1αの相互作用を確認するために、免疫蛍光染色実験を行った。 その結果、これら2つのタンパク質がERで共局在していることがわかった（図5c）。 IRE1αとDDRGK1の相互作用に関わる領域を特定するため、Flag-IRE1α野生型および切断変異体をDDRGK1とともにHEK293T細胞に共導入した。IPの結果、IRE1αの細胞質キナーゼドメインがDDRGK1との相互作用に必要であることが示された（Fig.5d）。 ERストレス条件下でのDDRGK1とIRE1αの相互作用の動的変化を理解するために、HEK293T細胞にFlag-DDRGK1をトランスフェクトし、異なる時間ポイントにTgで処理した。 予想通り、ERストレス下で総IRE1α、p-IRE1α、BiPが有意に増加することが観察された。 興味深いことに、DDRGK1はリン酸化されていないIRE1αと特異的に相互作用し、p-IRE1αとは相互作用しなかった(Fig. 5e)。 これらの結果は、DDRGK1がリン酸化されていないIRE1αと相互作用し、その安定性を維持していることを示唆している。
(a)． Flag-VectorまたはFlag-IRE1αベクターで36時間トランスフェクトしたHEK293T細胞におけるFlag M2アフィニティゲルの免疫沈降物のウェスタンブロット解析（b）。 Flag-VectorまたはFlag-DDRGK1を36時間トランスフェクトしたHEK293T細胞におけるFlag M2アフィニティーゲルの免疫沈降物のウェスタンブロット解析（c）。 MCF7細胞を抗DDRGK1抗体（緑）および抗IRE1α抗体（赤）で二重免疫染色した。 細胞核はDAPI（青）で対比染色した。 2つの内在性タンパク質DDRGK1とIRE1αの間の共局在化をマージパネルに示す。 スケールバー、20μm。 (d）Flag-VectorまたはFlag-IRE1α野生型およびトランケートでトランスフェクトしたHEK293T細胞におけるIRE1α野生型およびトランケート構築物の概略図およびFlag M2アフィニティーゲル免疫沈降物のウェスタンブロット解析。 (e）Flag-VectorまたはFlag-DDRGK1を発現するモックまたはTg処理（2.5μM）したHEK293T細胞におけるFlag M2アフィニティーゲル免疫沈降物のウエスタンブロット分析。
Ufm1 is required for the interaction of DDRGK1 and IRE1α3744>
最近の研究により、DDRGK1がufmylation substrateでありASC1 ufmylationに必要であることが示された15,20. DDRGK1によるIRE1αの安定性制御にufmylationが関与しているかどうかを調べるために、Ufm1枯渇がIRE1αタンパク質の発現に影響を与えるかどうかを調べた。 DDRGK1の枯渇と同様に、Ufm1の発現をノックダウンするとIRE1αタンパク質のレベルが劇的に低下することが確認され（図6a）、DDRGK1がufmyl化を通じてIRE1αを調節していることが示された。 同様に、DDRGK1を過剰発現させると、Ufm1ノックダウンMCF7細胞では、コントロール細胞と比較してIRE1αタンパク質が安定化しないことがわかった（図6b）。 また、Ufm1ノックダウンMCF7細胞では、Tg非存在下および存在下でIRE1αタンパク質量が劇的に減少した（図6c）ことから、DDRGK1によるIRE1αタンパク質安定化の制御には、ufmylationが必要であることが示唆された。 次に、IRE1αがufmylation修飾を受けるかどうかを検討した。 この疑問を解決するために、先に述べたように、DDRGK1およびUfm1、ならびにUBA5 (E1), UFC1 (E2) およびUFL1 (E3) を発現する細胞においてIRE1αのufmylationを検出しました20。 しかし、DDRGK1タンパク質のufmylationは既述のように容易に検出できたが、IRE1αタンパク質のufmylationは検出できなかった（データは示さず）15,20,25、これはIRE1αがufmylationの標的ではない可能性を示唆している。 興味深いことに、DDRGK1とIRE1αの結合は、Ufm1ノックダウンHEK293T細胞ではコントロール細胞と比較して有意に減少していることがわかった（図6d）。 この観察と一致して、DDRGK1 K267R（リジン残基267をアルギニン残基に置換したufmyl化欠損DDRGK1変異体）15とIRE1αとの相互作用が野生型DDRGK1と比較して劇的に減少することがわかった（図6e）ことから、DDRGK1とIRE1αとの会合にはufmyl化が必要であると考えられた。 さらに、DDRGK1 K267Rは、野生型DDRGK1と比較して、IRE1αタンパク質を安定化させることができなかった（図6f）。 これらの結果から、DDRGK1のK267におけるufmylationは、IRE1αとの相互作用およびIRE1αタンパク質の安定性の調節に必要であることが示唆された
(a) MCF7細胞をコントロールsiRNAまたはUfm1標的siRNAで72時間トランスフェクトし、IRE1αのタンパク質レベルをウェスタンブロットにより決定した。 (b）ベクターまたはDDRGK1を発現するコントロールおよびUfm1ノックダウンMCF7細胞におけるIRE1αのウェスタンブロット解析。 (c）2.5μMのTgで示した時間処理した後のコントロール及びUfm1-ノックダウンMCF7細胞におけるIRE1αのタンパク質レベルを、ウェスタンブロットによって決定した。 (d) Flag-VectorまたはFlag-DDRGK1を発現するHEK293TコントロールおよびUfm1-ノックダウン細胞におけるFlag M2アフィニティーゲル免疫沈降物のウェスタンブロット分析。 (e) Flag-Vector、Flag-DDRGK1 WTまたはK267R変異体をトランスフェクトしたHEK293T細胞におけるFlag M2アフィニティーゲル免疫沈降物のウエスタンブロット解析。 (f) Flag-Vector、Flag-DDRGK1 WTまたはK267R変異体をトランスフェクトしたMCF7細胞におけるIRE1αのウェスタンブロット解析
DDRGK1 is required for HSC reconstitution ability in mice
最近の研究から、造血幹細胞（HSC）はERストレスに対して極めて敏感であるということが指摘された26。 このことから，DDRGK1が造血幹細胞の機能に重要である可能性が推測された． 我々はまず、2ヶ月齢の野生型マウスから得た複数の造血系細胞におけるDDRGK1の発現量を測定した。 Q-PCRにより、長期造血幹細胞（LT-HSCs）、短期造血幹細胞（ST-HSCs）、多能性前駆細胞（MPPs）を含む造血幹細胞でDDRGK1の発現レベルが有意に高いことがわかった（図7a）。 さらに、DDRGK1のタンパク質レベルは、Lineage+c-Kit-骨髄（BM）細胞と比較して、造血幹細胞に富むLineage-c-Kit+骨髄（BM）細胞で高く発現していた（図7b）。 これらの観察結果は、幹細胞におけるDDRGK1の重要な役割を示唆している。 造血幹細胞機能におけるDDRGK1の役割を調べるために、DDRGK1をレンチウイルスでノックダウンした造血幹細胞を用いて、競合移植実験を行った（図7c）。 CD45.1ドナーマウスのLineage-Sca1+c-Kit+（LSK）細胞を、コントロールまたはDDRGK1ノックダウンレンズで形質転換し、致死照射したCD45.2レシピエントマウスに移植した。 フローサイトメトリー解析の結果、ドナー由来の末梢血（PB）細胞の割合は、DDRGK1ノックダウン群ではコントロールと比較して著しく減少しており、DDRGK1のノックダウンにより造血幹細胞の競合的再構成能が著しく損なわれたことが示された（図7d）。 非競合的移植実験では、DDRGK1ノックダウン造血幹細胞を移植したレシピエントマウスは移植後3ヶ月経過しても生存していたことから、DDRGK1のノックダウンは単に造血幹細胞の競合的再構成能力を損なうに過ぎないことが示唆された。 オフターゲット効果を除外するために、DDRGK1を標的とする別のshRNAを設計し、同様の結果を観察した（補足図5A）。 移植から3ヶ月後、レシピエントマウスを安楽死させ、BM解析とin vitroコロニー形成アッセイを行った。 フローサイトメトリー解析は、DDRGK1のノックダウンが、BMおよびPBにおけるドナー由来の造血幹細胞および前駆細胞ならびに分化した造血細胞の頻度の減少によって示されるように、その系統能（すなわち、骨髄系、B細胞およびT細胞系譜）に影響を与えずに、形質転換した造血幹細胞の維持を劇的に損ねることを示した（図7e）。 同様の結果は、DDRGK1を標的とする別のshRNAを用いた独立した実験でも観察された（補足図5B）。 さらに、レシピエントマウスからドナー由来のCD34-Flt3-LSK細胞（LT-造血幹細胞）を分離し、単細胞のコロニー形成アッセイを実施した。 その結果、DDRGK1のノックダウンにより造血幹細胞の中間コロニーおよび大型コロニー形成能が損なわれることがわかった（図7f）。 これらのデータを総合すると、DDRGK1は造血幹細胞の機能維持に必要であることが示唆される。
（a）若い野生型マウス（2カ月齢、n＝3）のBMの示した亜集団におけるDDRGK1の相対mRNA発現レベルのQ-PCR分析。 DDRGK1の相対的発現はGAPDHに対して正規化した。 データは平均±s.d.として示される。 (b) 若年野生型マウス（2ヶ月齢）からの濃縮Lineage+ c-Kit-およびLineage- c-Kit+細胞におけるDDRGK1のウェスタンブロット解析。 (c) 再構成アッセイの実験概略図。 (d) ドナー由来のコントロール（sh-Vector）またはDDRGK1-ノックダウン（sh-DDRGK1）PB細胞におけるGFP陽性細胞の割合を示す代表的なFACSパターン（左パネル）。 値は、全移植におけるドナー由来のGFP+細胞の正規化されたパーセンテージを表す（右図、n=3）。 データは平均±s.d.で示した。スチューデントのt検定により、**P<0.01および***P<0.001。 (e）値は、LT-HSC（CD34-Flt3- LSK）、ST-HSC（CD34+Flt3- LSK）、MPP（CD34+Flt3+ LSK）、CMP（CD34+CD16/32-Sca1-c-Kit+Lin-）におけるドナー由来のGFP+細胞のパーセンテージを表す。 GMP (CD34+CD16/32+Sca1-c-Kit+Lin-), MEP (CD34- CD16/32-Sca1-c-Kit+Lin-), B, 移植後12週の一次レシピエントマウスのBMにおけるTおよび骨髄系細胞集団 (n=3)． データは平均±s.d.として提示されている。 (f）レシピエントマウスの単一ドナー由来GFP+ LT-造血幹細胞を96ウェルプレートに選別し、14日間インビトロで培養した。 コロニー数を播種した元の単細胞数で割ることにより、コロニーの割合を算出した。 データは平均±s.d.で示した。**P<0.01 by Student’s t-test.
造血幹細胞の機能低下がホーミング効率の低下によるものかどうかを調べるために、2ヶ月齢マウスから精製したコントロールまたはsh-DDRGK1レンチウイルス導入LSK細胞に蛍光色素（紫）をラベルして致死照射を受けたレシピエントに注射をした。 移植18時間後にレシピエントのBMに存在する標識LSK細胞の割合をフローサイトメトリーで分析した。 その結果、DDRGK-ノックダウンLSK細胞のホーミング能力は、コントロール細胞と同等であることが分かった（補足図6AおよびB）。 DDRGK1のノックダウンがLSK細胞の細胞周期状態に影響を及ぼすかどうかを調べるため、ドナー由来のコントロールおよびDDRGK1ノックダウンLSK細胞を増殖マーカーKi67およびDAPIで染色したところ、DDRGK1ノックダウン造血幹細胞とコントロール造血幹細胞の間で細胞周期プロファイルに有意差がないことが分かった（補足図7A）。 次に、アネキシンV染色を用いて造血幹細胞のアポトーシスに対するDDRGK1-ノックダウンの影響を調べたところ、ドナー由来のDDRGK1-ノックダウンLSK細胞ではコントロールLSK細胞と比較してアポトーシスの頻度が著しく高く、この現象はDDRGK1を標的とする両方のshRNAで認められた（図8a；補足図7B）。 次に、形質導入された造血幹細胞における活性酸素種（ROS）のレベルを検討した。 その結果、コントロール群とDDRGK1ノックダウン群では、活性酸素レベルは同程度であった（補足図7C）。 以上のことから、造血幹細胞におけるDDRGK1のノックダウンがアポトーシス細胞死を誘導し、それによって造血幹細胞の機能が損なわれると結論した＜688＞＜5609＞＜5880＞＜5294＞図8：DDRGK1のノックダウンが造血幹細胞にERストレスを誘導している。
(a) 移植後のドナー由来のコントロールおよびDDRGK1ノックダウンLSK細胞内のAnnexin V陽性細胞の割合を示す代表的なFACSパターン（左側パネル）。 LSK細胞内のアネキシンV陽性細胞の割合を示す棒グラフ（右パネル、n=3）。 データは平均±s.d.として示される。 *P<0.05 by Student’s t-test。 (b）移植後のドナー由来のコントロールおよびDDRGK1ノックダウンLSK細胞におけるDDRGK1、BiPおよびCHOPの相対的mRNA発現レベルのQ-PCR解析（n＝3）。 データは平均±s.d.で示した。スチューデントのt検定により、**P<0.01および***P<0.001とした。 (c）コントロールまたはDDRGK1ノックダウン受領マウスから濃縮したドナー由来のGFP+Lineage-c-Kit+細胞におけるp-IRE1α、IRE1α、p-PERK、PERKおよびATF6のウェスタンブロット解析。 *非特異的なバンドを表す。 (d) 移植後のドナー由来のコントロールおよびDDRGK1ノックダウンLSK細胞におけるXBP-1スプライシングのRT-PCR解析。 Tg処理したMEF細胞をXBP-1スプライシングコントロールとして使用した。
造血幹細胞の機能低下がDDRGK1-ノックダウン造血幹細胞におけるERストレス応答の活性化のためかどうかを調べるために、コントロールおよびDDRGK-ノックダウン造血幹細胞のQ-PCRによるBipおよびCHOPの発現レベルを分析し、結果はBipおよびCHOPのmRNAレベルがDDRGK1-ノックダウン造血幹細胞において大幅に増加していることを示していた（図8B）。 さらに、コントロールおよびDDRGKノックダウンLineage-c-Kit+ BM細胞において、ERストレスセンサーのタンパク質レベルを検討した。 がん細胞株での観察結果と同様に、DDRGK1のノックダウンにより、IRE1αおよびp-IRE1αのタンパク質レベルの低下とp-PERKのレベルの上昇が見られたが、ATF6レベルはコントロールおよびDDRGK1ノックダウン群で差がなかった（図8c）。 また、ドナー由来のDDRGK1ノックダウンLSK細胞では、XBP1sのレベルが減少していた（図8d）。 これらの結果は、DDRGK1のノックダウンがIRE1αシグナルを障害するが、PERK経路を活性化することを示し、DDRGK1がERホモオスタシスの適切な維持に重要であり、それによって造血幹細胞の生存と維持に必須であることをさらに支持するものである
。