- 結果
- 臨床サンプルの分析
- Subtyping and Phylogenetic Analysis.
- Molecular Analysis of the HA and NA Surface Proteins.
- 豚におけるH2N3豚インフルエンザウイルスの病原性と感染性.
- Pathogenicity of H2N3 Swinfluenza Viruses in Mice.
- Transmissibility of H2N3 Swine Influenza Virus in Ferrets.
- Serological Investigation of H2N3 Swine Influenza Viruses in Outbreak Farms.
結果
臨床サンプルの分析
2006年9月に、複数のソースの商業豚ナーサリーで多巣性気管支肺炎の5〜6週齢の豚数頭からインフルエンザウイルス A/Swine/Missouri/4296424/2006 (Sw/4296424) が分離された。 肺病変は，中等度の亜急性から慢性の化膿性気管支肺炎と気管支炎および気管支周囲炎を伴う間質性肺炎であった． 肺組織は，豚生殖・呼吸器症候群ウイルス（PRRSV），豚サーコウイルス2型（PCV2），マイコプラズマ・ヒオ肺炎は陰性であったが，レンサ球菌は陽性であった． インフルエンザ様病変と肺炎の臨床症状が特徴的であったため，肺組織ホモジネートをMadin-Darby canine kidney（MDCK）細胞上に接種したところ，MDCK細胞は肺炎を起こした。 細胞障害作用は接種後3日目（p.i.）に検出された。 また，RT-PCR法により，感染細胞からインフルエンザウイルス核タンパク（NP）遺伝子を検出した． 本ウイルスは、血球凝集阻害（HI）アッセイにおいて参照豚の抗血清（A/Sw/IA/1973 H1N1, A/Sw/TX/1998 H3N2, A/Sw/NC/2001 H1N1）と反応せず、マルチプルRT-PCRではH1N1およびH3N2遺伝子が検出されなかった(14). このウイルスは、亜型分類と配列決定のために、2007年2月に国立動物疾病センター（NADC）に提出された。
9 月の分離株の亜型分類と配列決定（後述）の後、事例記録を検索すると、「型付けできない」別のインフルエンザ分離株が、2006年4月に提出されていたことが判明した。 A/Swine/Missouri/2124514/2006 (Sw/2124514) は、別の養豚場で呼吸器疾患を発症した12週齢の豚から分離されたものでした。 肺病変は病理組織学的に豚インフルエンザに特徴的であった（気管支上皮細胞の壊死と形質転換を伴う肺胞と気管支の重度の亜急性炎症）． 肺はPRRSV，PCV2およびM. hyopneumoniaは陰性であったが，RT-PCR（NP遺伝子に特異的）によりA型インフルエンザウイルスおよびS. suisは陽性であった． 5588>
Subtyping and Phylogenetic Analysis.
両インフルエンザウイルスの識別と特徴を明らかにするために、核酸配列決定と分子および系統解析を行った。 両ウイルスともMDCK細胞を用いて低経過分離株から直接塩基配列を決定し，プラーク精製と再塩基配列決定により塩基配列を確認した． 塩基配列とInfluenza Sequence Database（www.flu.lanl.gov）のBLAST検索により，H2N3ウイルスと同定された． Sw/4296424のHA遺伝子は北米のマガモから分離されたH2ウイルスのものと最もよく一致した。 また、NA遺伝子はアオトウガラスのH4N3型鳥インフルエンザウイルス（AIV）と98.3%一致した。 その内部遺伝子は、ポリメラーゼ酸性（PA）遺伝子を除いて、現在米国で流行している三重レサルト豚インフルエンザウイルスに由来するものであった。 これらのウイルスは、ヒト（PB1）、鳥（PB2、PA）、豚インフルエンザウイルス由来の内部遺伝子を有している（SI Table 4）。 そのPAセグメントは、マガモから分離されたH6N5 AIVのセグメントと99.2％同一であった（SI表4）。 Sw/2124514とSw/4296424は全塩基配列が99.3〜99.9%同一であった（SI表5）。 両者ともプラーククローニングを繰り返し、再検査を行い、配列決定によりH2N3亜型に属することが確認された。 H2N3亜型は血清学的に赤血球凝集阻害法およびノイラミニダーゼ阻害法で確認された。 HAおよびNA遺伝子に基づく系統解析の結果、これら2つのウイルスは、ユーラシア大陸の鳥類系統および1957年のインフルエンザ流行後にヒトから分離されたH2N2ウイルスとは異なるアメリカの鳥類系統に属することがわかった（図1）
インフルエンザウイルスH2 (a) とN3 (b) 遺伝子のORFの塩基配列に基づく系統樹。 水平方向の距離は遺伝的距離に比例する。 樹木はA/duck/Singapore/97 H5N3 (a) とA/tern/Astrakan/775/83 H3N3 (b) に根ざしている。
Molecular Analysis of the HA and NA Surface Proteins.
Influenza A virus contains two surface proteins: the HA is the receptor-binding and membrane-fusion glycoprotein, and the NA is the receptor-destroying enzyme.Infinza A Viruses contains two surface proteins. ウイルスHAは、インフルエンザウイルスの宿主種特異性の重要な要因である(15)。 鳥類ウイルスの哺乳類宿主への適応に関連すると思われるHA内の残基を特徴づけるために、我々は豚のHAのアミノ酸配列を、参照とされる鳥類ウイルスのアミノ酸配列と比較した。 2つの豚のH2N3分離株のHA分子を分子レベルで比較したところ、マガモから分離したH2N3ウイルスとは6つの共通アミノ酸置換（D36N, Q226L, T274I, V316I, L419I, L506V）により異なることがわかった（SI Table 6）。 Q226Lは豚のH2N3分離株の両方に見られたが、228位はGで、鳥のコンセンサス配列と同一であった(表1)(16)。 一方、H2亜型のヒトHA分子は226Lと228Sを含むが、初期のヒトH2分離株は226Lと228Gを含み（表1）、豚の分離株と同様であった。 36N、274I、316I、419Iは豚のH2N3分離株（SI表6）に固有であるが、図1 aに描かれたヒトと鳥の分離株ではそれぞれの位置は36D、274T、316V、419Lであった。 図1 aに示したインフルエンザ株では、SI表6に示すように、506Vの位置は、A/mallard/Alberta/2004（H2N3）を除いて、ヒト、2つの豚のH2N3株、鳥の分離株で保存されている。 アオトウガラシから分離された参照用H4N3ウイルスと比較すると、両方の豚分離株のNAのアミノ酸配列に2つの共通のアミノ酸の変化が見られた。 H47YとH253Yである（SI Table 7）。 両ブタ由来H2N3ウイルスの47Yは、図1bに示したユーラシア大陸の鳥類由来ウイルスと同じアミノ酸であり、逆に北米の鳥類由来ウイルスは47Hであった。 253Yの位置は豚のH2N3分離株に固有であり、253Hの位置は図1 bに示したユーラシアと北米の鳥の分離株で保存されていることがわかる。 興味深いことに、Sw/2124514 (H2N3)より5カ月遅れて分離されたSw/4296424 (H2N3)は、Sw/2124514のHAおよびNAと比較して、HA分子にさらに2つの置換（P162SおよびL321V）が、NA分子にさらに3つの置換（V30I、I49TおよびA135T）があった（SI表6および7）。 NA分子の30I位（Sw/4296424）はユーラシアの分離株と類似しているが、30V位（Sw/2124514）は北アメリカの鳥類分離株で保存されている。
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ヒト、鳥および豚のH2インフルエンザウイルス分離株のHA受容体結合部位のアミノ酸の比較
豚におけるH2N3豚インフルエンザウイルスの病原性と感染性.
H2N3ウイルスの豚への適応度を調べるため、4週齢の豚20頭にSw/4296424ウイルスの2×106 50％ tissue culture infective dose（TCID50）を接種し、この宿主における病原性を検討した。 H2N3ウイルスは、2つの分離株の間で高い同一性があるため、1つだけを選択した。 12頭の対照ブタには非感染性の細胞培養上清を模擬接種した。 豚インフルエンザH1N1、H1N2、H2N3、H3N2ウイルスに対する抗体は、HIアッセイにより0日目にすべて血清陰性であった。 接触豚10頭およびウイルス接種豚5頭は、それぞれ接触後24日目または27日目にH2N3によるHIアッセイで血清学的検査を受けた。 急性呼吸器症状は観察されなかった。 死体解剖の結果、接種豚では重度の巨視的肺病変（梅色の固まった部分）が認められたが、対照豚では全く認められなかった（表2）。 肺構造への損傷の程度を表す病理組織学的スコア（0〜3）は，接種ブタでは＜2243＞2であった（表2）． 接種豚を3，5，7日目に安楽死させた肺は，軽度から中等度の間質性肺炎と急性から亜急性の壊死性気管支炎を示し，気管支と血管にわずかにリンパ球性のカフが認められた（図2）． 気管支肺胞洗浄液（BALF）中のウイルスを滴定し、鼻腔スワブ試料から分離した。 H2N3接種群では、3日目に25％（20頭中5頭）、5日目に67％（15頭中10頭）、7日目に20％（10頭中2頭）が鼻腔スワブからウイルス分離され、接触群では接触後5日と7日に10％（10頭中1頭）のサンプルが陽性であった。 一方，接触群では接種豚との接触24日後に100％（10頭中10頭）が血清陽性を示した（SI表9）． 対照豚の中には、時折、軽度の間質性肺炎の小集団が見られたが（表2）、豚インフルエンザウイルス感染症は陰性であった。 すべての豚はPRRSVとM. hyopneumoniaeをPCRで陰性化した。 この結果は、H2N3ウイルスが豚において病原性を持ち、豚の間で感染することを示している。
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H2N3 ウイルス Sw/4296424 を接種した豚、または模擬接種した豚のマクロおよびミクロの肺炎
対照ブタと感染ブタの顕微鏡による肺の切片。 (a)非感染性細胞培養上清を接種した対照ブタの肺の気管支。 偽層状柱状上皮の規則的な輪郭に注意。 (b) H2N3豚インフルエンザウイルス接種3日後の豚の肺における壊死性細気管支炎。 気道の上皮は壊死した感染細胞の剥離と残存上皮の初期反応性増殖により局所的に破壊されている。 内腔には、剥落した上皮細胞と白血球が混在している。
Pathogenicity of H2N3 Swinfluenza Viruses in Mice.
H2N3 Sw/4296424ウイルスのマウスでの複製能力を調べるために、6-7週齢のBALB/cマウスに102-106 TCID50を鼻腔内接種した。 104 TCID50以上を接種したマウスは、病気の兆候（例えば、呼吸困難、毛並み荒れ、体重減少、嗜眠）を示した（SI表10）。 106 TCID50を受けたマウスの75％が死亡したが、より低い投与量では死亡は見られなかった。 106または105 TCID50を接種したマウスの肺で、ウイルスRNAがリアルタイムRT-PCR（17）により検出された（SI表10）。 病理組織学的に、H2N3ウイルスは、顕著な肺細胞の肥大とマクロファージ、リンパ球、好中球の混合集団による肺胞壁への浸潤を特徴とする間質性肺炎と増殖性肺胞炎の多発または合体病巣を誘発した（SI Fig.3）。 肺胞内腔の一部にはフィブリン塊と白血球の混合滲出液が見られた。 5588>
Transmissibility of H2N3 Swine Influenza Virus in Ferrets.
パンデミックを引き起こすには、出現したA型インフルエンザウイルスがヒトに感染し、ヒト間で効率的に伝播することが必要である。 再集団化したH2N3ウイルスが哺乳類系で感染する可能性を調べるために、フェレット接触モデル（18）を使用した。 18週齢のフェレット3匹を別々のケージに入れ、H2N3ウイルスSw/2124514を102.5 TCID50で接種した。 24時間後、各ケージに接触動物1匹を入れた。 1日目、4日目、7日目に鼻洗浄を行い、胚珠でウイルスを滴定した。 接種したフェレットと接触したフェレットのすべてでウイルスが検出されたが、明らかな臨床症状を示したものはいなかった（表3）。 以上の結果から，H2N3型インフルエンザウイルスはフェレットに感染し，効率的に接触感染したことが示唆された
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H2N3 (Sw/2124514) を接種したフェレットと接触したフェレットの鼻洗浄液中のウイルス力価
Serological Investigation of H2N3 Swine Influenza Viruses in Outbreak Farms.
H2N3ウイルスの広がりをさらに調べるために、影響を受けた二つの生産システムに関する動物の限定血清調査を実施した。 最初の調査では、2007年春に、2006年9月のアウトブレイク時に育児農場に子豚を提供した4つの農場の母豚から血清サンプルを採取した。 90％（60頭中54頭）がSw/4296424に対する抗体の存在で血清陽性であった（SI表11）。 検査動物の多くは、指標となる症例の発生時に存在しており、その時点で感染していたのか、その後感染したのかは不明である。 しかし、このデータは、ウイルスが母豚と苗床の両方の農場に存在し、ウイルスが動物間で効率的に感染していることを示している。 5588>
2006 年 4 月の集団発生に関連した 30 頭の母豚と 90 頭の離乳豚から 2007 年春に血清サンプルを採取し、HI 法を用いて Sw/2124514 に対する抗体の存在を検査した。 採取した母豚30頭および離乳豚90頭のうち、それぞれ30頭中1頭、90頭中26頭が血清陽性であった（SI 表11）
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