S.I.の成長およびエタノール生産量。 cerevisiae NCYC 2826 on wheat straw hydrolysate
図1Aは、「方法」の項に記載したように調製したグルコース濃度123mMの加水分解物を含む培養液中で30℃で36時間培養したS. cerevisiae National Collection of Yeast Cultures (NCYC) 2826の成長を示す図である。 S. cerevisiae株は、その高いエタノール耐性と工業的発酵における頑健性が報告されていることから選択された。 図 1A は、S. cerevisiae NCYC 2826 を麦わら加水分解物のみで培養した場合、0.036 h-1 の遅い成長速度 μ と 0.8 の最終光学密度 (OD) があったことを示している。 酵母栄養塩基（YNB）を培地に添加すると、μが0.135 h-1に増加し、最終的なODは1.5になった。一方、2.3 mg ml-1の尿素を小麦ワラの加水分解物に添加すると、μが0.99 h-1となり、最終のODは1.3であった。 これまでの研究で、尿素の補充は酵母発酵におけるエタノール生産を増加させることができ、尿素自体は最も最小限の酵母増殖培地において必須成分であることが示されている . 今回の結果は、これらの先行研究を支持するものであり、酵母のほぼ最適な増殖に尿素が必要であることを確認した。 36時間後に培養液中のエタノール濃度を測定したところ、123mMグルコースから得られたエタノールの収量は、すべての培養液で理論収量全体の約90%であった。 これら3つの培養条件では、同等の収率でエタノールが生産されたが、麦わら加水分解物では、尿素またはYNBを添加した場合よりも成長が遅く、最終光学濃度が低下した。
小麦藁加水分解物での細胞増殖の低下の原因を調べるために、S. cerevisiae NCYC 2826を藁濃度5%、10%、15%、20%の出発原料を用いて作った加水分解物に2.3 mg ml-1尿素を添加して培養を行った。 図1Bは、初期わら濃度が増加するにつれて、生育のラグフェーズも増加し、初期わら濃度20%で20時間になったことを示している。 最終的なODも、わら濃度が高くなるにつれて、放出されたグルコースの濃度が高くなるため、増加した。 このラグフェーズの増加は、藁の加水分解物にしばしば含まれるフラン化合物による生育阻害の特徴である。 加水分解物のフラン含量を分析した結果、HMF含量はごくわずかであったが（データなし）、フルフラール含量はわら初期濃度とともに増加し、わら初期含量20%で0.5 mg ml-1に達した（Figure 2）。 これらのデータは、小麦藁加水分解物上でのS. cerevisiae NCYC 2826の成長は、加水分解物中に存在するフルフラールの濃度によって制限されることを示唆している。
「方法」に記述したように製造した小麦藁加水分解物に存在するグルコース（四角）とフルフラール（三角）濃度と初期の藁濃度を増加させた。
Analysis of SGRP strain set growth on furfural
汚染フルフラールに対して耐性があると思われる酵母株を特定するために、方法に記載のSGRP株セットをYNB、100mMグルコースおよび1.5mg ml-1フルフラールの存在下で増殖させた。 表1は、「方法」のセクションに記載された採点システムを用いた、1.5 mg ml-1 フルフラールに対するSGRP株セットの耐性の分析を示している。 増殖しなかった菌株の複製は、測定可能な遅延期を持たないが、データセットに含める必要があるため、平均遅延時間の代わりに採点システムが必要であった。
我々は以前、フルフラールを含む培養液への接種量を増やすと、おそらく培地に導入される酵母の生菌数が最大になり、指数増殖期の確立が早くなることから、ラグフェーズの減少につながることを確認している (data not shown). したがって、これらの実験では、5%の植菌量の一晩培養液を用いた。 表1のデータから、レプリカプレート上での増殖は極めて多様であり、また株にも依存することが示され、S. cerevisiaeおよびS. paradoxusの株においてフルフラール耐性を識別するには、1.5 mg ml-1のフルフラール濃度が十分であることが示された。 100 mMのグルコースと2.0または3.0 mg ml-1のフルフラールを含むYNBで株の増殖試験を行ったところ、いずれの条件下でも分析したどの株からもほとんど増殖が観察されなかった。 そこで、1.5 mg ml-1のデータを用いて菌株を選択し、より詳細なフルフラールスクリーニングを行うことにした。 表1に示したデータの解析から、全体としてS. cerevisiae株は1.5 mg ml – 1 フルフラールにおいてS. paradoxus株よりも良好な生育を示した。 S. paradoxusの20%近くがスコアリングシステムで上位に入らなかったのに対し、S. cerevisiaeでは10%未満であり、S. paradoxusの平均総合スコアが2.1 ± 1.4であるのに対し、S. cerevisiaeは2.5 ± 1.4と高く反映される。 しかし、各菌株グループ内では、S. cerevisiae のスコアが 1.7 から 3.7 まで、S. paradoxus のスコアが 0.3 から 3.0 までと、大きなばらつきがあった。 2.9以上のスコアで標準偏差が1.5未満の菌株は、有意なフルフラール耐性を示すと判断された。 その結果、S. cerevisiaeのNCYC 3284株（ex soil, USA），NCYC 3290株（ex bili wine, West Africa），NCYC 3312株（ex soil, The Netherlands），NCYC 3451株（ex wort, Ireland）と、S. paradoxus NCYC 3277（ex oak bark, UK）が、より詳しいフルフラルスクリーンで検討されました。
Effects of increasing concentrations of furfural on growth and ethanol production
図3は、S. cerevisiae株 NCYC 3284, NCYC 3290, NCYC 3312 and NCYC 3451 およびSGRP株セットから表1にフルフラールに対する耐性が増加したとして特定されたS. paradoxus株 NCYC 3277のフルフラの量を変更しながら成長する（0.1 〜 4.0 mg ml-1） を示している。 追記1． Figure S1 は、対応する増殖データを対数スケールでプロットしたものである。 対照株であるS. cerevisiae NCYC 2826も、比較のために含めた。 6つの菌株すべてにおいて、フルフラール濃度が増加するにつれて、成長曲線は、フルフラールを含む成長において以前に見られたように、ラグフェーズの増加を示し始めた。 試験したすべての菌株は、100 mMグルコースおよび0.1〜1.5 mg ml-1フルフラールを添加したYNBで増殖することが可能であった。 対照株であるS. cerevisiae NCYC 2826は、1.5 mg ml-1までしか増殖できず、0.1 mg ml-1フルフラールでの増殖と比較して最終ODが30%減少した。 表2より、これらの条件下でのNCYC 2826によるエタノール生産は、YNBとグルコースのみ、または小麦藁加水分解物で増殖させた場合に観察された約90%の収率と比較してかなり低下していることがわかる。 S. cerevisiae NCYC 2826はブドウ果汁から分離されたため、フルフラールへの曝露中に増殖・発酵する能力が進化したとは考えにくい。
Liti et al. Litiらは、地理的に孤立した5つの系統（マレーシア、北米、サケ、西アフリカ、「ワイン／ヨーロッパ」）と、これらの系統の多くの異なる組換え（モザイク）株を同定しました。 本研究の結果から、フルフラール耐性は特定のS. cerevisiaeの系統に特異的な表現型特性ではないことが明らかとなった。 同定された4つのフルフラール耐性SGRP S. cerevisiae株のうち、NCYC 3284 (YPS128) は北米系統、NCYC 3290 (DBVPG 6044) は西アフリカ系統、NCYC 3312 (DBVPG 1373) は「ワイン／ヨーロッパ」系統、NCYC 3451 (NCYC 361の単胞子派生株) は組換株であることが判明した。
S. cerevisiae NCYC 3451は最大のフルフラール耐性を示し（図3F、追加ファイル1：図S1F）、最大3.0 mg ml-1のフルフラールの存在下で増殖することが可能であった。 さらに、この菌株のエタノール生産はフルフラールによって阻害されないようであり、最も高いエタノール収率（95±15％；表2）は（フルフラール）濃度3.0 mg ml-1で達成された。 すでに述べたように、NCYC 3451は組換え株であり、少なくとも3つの異なる系統、すなわちサケ、西アフリカおよび「ワイン／ヨーロピアン」に由来するモザイク状のゲノムを有することが示されている（Liti et al.） ビールの腐敗酵母として麦汁から分離されたことが記録されているが、この株の非常に複雑なゲノム構造は、証明されてはいないものの、この株が工業用由来（例えば、ベーキングまたは醸造用株）であることを強く示唆する。 試験した残りの 4 種類の SGRP 株のうち、S. cerevisiae NCYC 3290 株および NCYC 3312 株はともに 2.5 mg ml-1 フルフラールで増殖できたが（それぞれ Figure 3D,C, Additional file 1: Figure S1D および S1C）、S. cerevisiae NCYC 3284 (Figure 3E, Additional file 1: Figure S1E) と S. paradoxus NCYC 3277 (Figure 3B, Additional file 1: Figure S1B) は 2.0 mg ml-1 フルフラールにのみ増殖可能であった。 全体として、5 つの SGRP 株のエタノール生産はフルフラールの存在に大きく影響されな かった。 実際、NCYC 3312では、0.5 mg ml-1フルフラールの存在により、エタノール収量が予想収量の41 ± 8% から75 ± 5% へと顕著に増加した（表2）。 このことは、ビール腐敗菌NCYC 3451でも観察されたが、程度は低かった（収量は14%増加しただけ；表2）。 実際、酵母におけるフルフラール脱水の生成物である少量のフルフリルアルコールが、実際にエタノール生産の増加につながることが最近明らかになった.
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